本發(fā)明涉及一種樹木的增殖方法，具體是一種白牛筋木的組培增殖方法。

背景技術(shù)：

牛筋條在植物分類上屬于薔薇科牛筋條屬，產(chǎn)于云南的只有一種和一個(gè)變種。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所結(jié)合云南山高坡陡、冬春干旱的實(shí)際，就地取材，在總結(jié)群眾經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)牛筋條植物進(jìn)行了研究。根據(jù)初步觀察，牛筋條無論嫁接蘋果和梨都有矮化樹體和提早結(jié)果的明顯效果，可以一砧多用，是一個(gè)很有希望的蘋果和梨的實(shí)生矮化砧。但牛筋條是常綠灌木，四季常綠，主根發(fā)達(dá)，入土很深，須根少，有抗早耐瘠的一面，又有不耐移栽、定植的一面，一般嫁接苗由于須根少，移苗定植后緩苗期長，影響生長。

白牛筋木的繁殖方法主要是種籽繁殖和扦插繁殖。種籽繁殖的實(shí)生苗因?yàn)橹鞲l(fā)達(dá)，入土深，須根少，又是常綠樹，所以移栽成活率低；扦插繁殖，除了要求外界具有一定的濕度、溫度、空氣和自生以及外界具備充足營養(yǎng)物質(zhì)外，還需要一些微量的特殊活性物質(zhì)，操作復(fù)雜，由于牛筋條扦插生根困難，育苗成本高，效率低，影響了其推廣速度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高育苗效率、降低育苗成本的白牛筋木的組培增殖方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種白牛筋木的組培增殖方法，具體步驟如下：

（1）外植體的選?。涸?月至5月的晴好天氣，剪取牛筋條當(dāng)年生營養(yǎng)枝的幼嫩莖段或莖尖；

（2）外植體的滅菌：剪去嫩莖上的葉片，用洗潔精清洗莖段或莖尖，再用自來水沖洗干凈，將莖段或莖尖放入超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30s，再用滅過菌蒸餾水將酒精沖洗干凈，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡20-30min，然后用無菌水清洗4次；

（3）無菌系建立：無菌系的建立采用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，使用的激素為6BA和NAA，將培養(yǎng)基裝入廣口瓶中，每瓶裝入培養(yǎng)基30-40ML，密封后進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌后冷卻待用；在超凈工作臺(tái)中，將消毒好的莖段或莖尖剪成長為2cm的莖段，然后將剪好的莖段插入滅菌后的MS培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插入莖段5-8個(gè)，密封后將其放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)；

（4）繼代增殖：牛筋條在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，無菌系建立，繼而進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS+1-2mg6BA+0.05-0.5%NAA，每瓶培養(yǎng)基為50ML，接入無菌系的莖段3個(gè)，密封后放入培養(yǎng)室進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每周對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒一定，每20-25d更換一次培養(yǎng)基，通過一個(gè)周期的繼代培養(yǎng)，牛筋條增殖系數(shù)達(dá)到13-15。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（1）中的莖段或莖尖用質(zhì)量百分濃度為75%的酒精消毒30秒，再用質(zhì)量百分濃度為0.1%的升汞消毒25min。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟（3）和步驟（4）中的培養(yǎng)室條件為：培養(yǎng)室溫度控制在25-27℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1000-1200Lx。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明采用組織培養(yǎng)增殖方法，對(duì)白牛筋木矮化砧木進(jìn)行大批量生產(chǎn)，降低了育苗成本，提高了育苗效率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

實(shí)施例1

一種白牛筋木的組培增殖方法，具體步驟如下：

（1）外植體的選?。涸?月至5月的晴好天氣，剪取牛筋條當(dāng)年生營養(yǎng)枝的幼嫩莖段或莖尖；

（2）外植體的滅菌：剪去嫩莖上的葉片，用洗潔精清洗莖段或莖尖，再用自來水沖洗干凈，將莖段或莖尖放入超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30s，再用滅過菌蒸餾水將酒精沖洗干凈，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡20min，然后用無菌水清洗4次；

（3）無菌系建立：無菌系的建立采用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，使用的激素為6BA和NAA，將培養(yǎng)基裝入廣口瓶中，每瓶裝入培養(yǎng)基30mL，密封后進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌后冷卻待用；在超凈工作臺(tái)中，將消毒好的莖段或莖尖剪成長為2cm的莖段，然后將剪好的莖段插入滅菌后的MS培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插入莖段5個(gè)，密封后將其放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)；控制好培養(yǎng)所需的光照和溫度條件，避免外界對(duì)培養(yǎng)室的污染，及時(shí)清除被污染的莖段和培養(yǎng)基；培養(yǎng)室溫度控制在25℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1000Lx。

（4）繼代增殖：牛筋條在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，無菌系建立，繼而進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS+1mg6BA+0.05%NAA，每瓶培養(yǎng)基為50ML，接入無菌系的莖段3個(gè)，密封后放入培養(yǎng)室進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每周對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒一定，每20d更換一次培養(yǎng)基，通過一個(gè)周期的繼代培養(yǎng)，牛筋條增殖系數(shù)達(dá)到13；培養(yǎng)室溫度控制在25℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1000Lx。

實(shí)施例2

一種白牛筋木的組培增殖方法，具體步驟如下：

（1）外植體的選?。涸?月至5月的晴好天氣，剪取牛筋條當(dāng)年生營養(yǎng)枝的幼嫩莖段或莖尖；

（2）外植體的滅菌：剪去嫩莖上的葉片，用洗潔精清洗莖段或莖尖，再用自來水沖洗干凈，將莖段或莖尖放入超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30s，再用滅過菌蒸餾水將酒精沖洗干凈，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡25min，然后用無菌水清洗4次；

（3）無菌系建立：無菌系的建立采用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，使用的激素為6BA和NAA，將培養(yǎng)基裝入廣口瓶中，每瓶裝入培養(yǎng)基35mL，密封后進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌后冷卻待用；在超凈工作臺(tái)中，將消毒好的莖段或莖尖剪成長為2cm的莖段，然后將剪好的莖段插入滅菌后的MS培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插入莖段6個(gè)，密封后將其放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)；控制好培養(yǎng)所需的光照和溫度條件，避免外界對(duì)培養(yǎng)室的污染，及時(shí)清除被污染的莖段和培養(yǎng)基；培養(yǎng)室溫度控制在26℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1100Lx。

（4）繼代增殖：牛筋條在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，無菌系建立，繼而進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS+1.5mg6BA+0.2%NAA，每瓶培養(yǎng)基為50ML，接入無菌系的莖段3個(gè)，密封后放入培養(yǎng)室進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每周對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒一定，每22d更換一次培養(yǎng)基，通過一個(gè)周期的繼代培養(yǎng)，牛筋條增殖系數(shù)達(dá)到14；培養(yǎng)室溫度控制在26℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1100Lx。

實(shí)施例3

一種白牛筋木的組培增殖方法，具體步驟如下：

（1）外植體的選?。涸?月至5月的晴好天氣，剪取牛筋條當(dāng)年生營養(yǎng)枝的幼嫩莖段或莖尖；

（2）外植體的滅菌：剪去嫩莖上的葉片，用洗潔精清洗莖段或莖尖，再用自來水沖洗干凈，將莖段或莖尖放入超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30s，再用滅過菌蒸餾水將酒精沖洗干凈，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡30min，然后用無菌水清洗4次；

（3）無菌系建立：無菌系的建立采用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，使用的激素為6BA和NAA，將培養(yǎng)基裝入廣口瓶中，每瓶裝入培養(yǎng)基40mL，密封后進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌后冷卻待用；在超凈工作臺(tái)中，將消毒好的莖段或莖尖剪成長為2cm的莖段，然后將剪好的莖段插入滅菌后的MS培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插入莖段8個(gè)，密封后將其放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)；控制好培養(yǎng)所需的光照和溫度條件，避免外界對(duì)培養(yǎng)室的污染，及時(shí)清除被污染的莖段和培養(yǎng)基；培養(yǎng)室溫度控制在27℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1200Lx。

（4）繼代增殖：牛筋條在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，無菌系建立，繼而進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS+2mg6BA+0.5%NAA，每瓶培養(yǎng)基為50ML，接入無菌系的莖段3個(gè)，密封后放入培養(yǎng)室進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每周對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒一定，每25d更換一次培養(yǎng)基，通過一個(gè)周期的繼代培養(yǎng)，牛筋條增殖系數(shù)達(dá)到15；培養(yǎng)室溫度控制在27℃，每天光照12h，光照強(qiáng)度為1200Lx。

試驗(yàn)1：

1.1外植體的選?。?015年5月，在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所云南特有果樹及砧木資源圃采集1a生牛筋條嫩梢部分。剪取其10-15cm長的嫩梢，去掉葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無菌苗的培養(yǎng)：將采集的嫩梢剪成5cm左右長的莖段，用流水沖洗30-60min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用70%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液滅菌8min，最后用無菌水搖晃沖洗3次，然后將嫩梢剪成1.5cm左右長的帶腋芽莖段，接入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L的初代培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段；初代培養(yǎng)25d

后，用鑷子小心取出試管苗，切成1.5-2.0cm帶芽莖段，接種到繼代培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L中，每瓶接3-4莖段。

1.2.2莖芽的增殖培養(yǎng)：選取繼代培養(yǎng)同一批生長期30d左右的、長勢好的試管苗，將其切成1.5-2.0cm帶芽莖段接入各種不同成分的增殖篩選培養(yǎng)基中，每種處理最少接10瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，試管苗培養(yǎng)30d后，觀察試管苗生長狀況，統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)及試管苗高度。增殖系數(shù)＝植株大于1cm長的分支/接種時(shí)莖段的數(shù)量×100%；

1.2.3生根培養(yǎng)和試管苗移栽：切取3-4cm的試管苗莖段，接種到生根培養(yǎng)基上，30d后統(tǒng)計(jì)生根率和生根條數(shù)等；然后將長勢好的生根苗轉(zhuǎn)入練苗室進(jìn)行練苗，瓶內(nèi)練苗5d后，移栽入基質(zhì)中練苗，15d試管苗已發(fā)新根，統(tǒng)計(jì)成活率。生根率＝生根植株數(shù)/接種莖段總數(shù)×100%；生根條數(shù)為植株基部誘導(dǎo)出的第一級(jí)根的條數(shù)；移栽成活率＝移栽成活數(shù)/移栽生根苗數(shù)×100%。

培養(yǎng)條件：

以上培養(yǎng)基pH均為5.8，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，培養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx。

試驗(yàn)2：

1.1外植體的選?。?009年5月，在西北農(nóng)林科技大學(xué)梨種質(zhì)資源圃采集2a生云南榅桲植株嫩梢部分。剪取其10-15cm長的嫩梢，去掉葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室備用；

1.2試驗(yàn)方法：

1.2.1無菌苗的培養(yǎng)：將采集的嫩梢剪成5cm左右長的莖段，用流水沖洗30-60min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用70%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液滅菌8min，最后用無菌水搖晃沖洗3次，然后將嫩梢剪成1.5cm左右長的帶腋芽莖段，接入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L的初代培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。初代培養(yǎng)25d后，用鑷子小心取出試管苗，切成1.5-2.0cm帶芽莖段，接種到繼代培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L中，每瓶接3-4莖段。

1.2.2莖芽的增殖培養(yǎng)：選取繼代培養(yǎng)同一批生長期30d左右的、長勢好的試管苗，將其切成1.5-2.0cm帶芽莖段接入各種不同成分的增殖篩選培養(yǎng)基中，每種處理最少接10瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，試管苗培養(yǎng)30d后，觀察試管苗生長狀況，統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)及試管苗高度。增殖系數(shù)＝植株大于1cm長的分支/接種時(shí)莖段的數(shù)量×100%。

1.2.3生根培養(yǎng)和試管苗移栽：切取3-4cm的試管苗莖段，接種到生根培養(yǎng)基上，30d后統(tǒng)計(jì)生根率和生根條數(shù)等。然后將長勢好的生根苗轉(zhuǎn)入練苗室進(jìn)行練苗，瓶內(nèi)練苗5d后，移栽入基質(zhì)中練苗，15d試管苗已發(fā)新根，統(tǒng)計(jì)成活率。生根率＝生根植株數(shù)/接種莖段總數(shù)×100%；生根條數(shù)為植株基部誘導(dǎo)出的第一級(jí)根的條數(shù)；移栽成活率＝移栽成活數(shù)/移栽生根苗數(shù)×100%。

培養(yǎng)條件：

以上培養(yǎng)基pH均為5.8，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，培養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx。

以梨矮化砧木云南榅桲的莖段為外植體，進(jìn)行了離體快繁研究。結(jié)果表明：莖芽增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L或MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L，增殖系數(shù)分別為3.65和3.58，并且試管苗長勢健壯；云南榅桲不定根誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.3mg/L，生根苗移栽成活率為92％。

針對(duì)白牛筋木的矮化作用明顯，但繁殖和移栽后難成活，導(dǎo)致難以推廣利用的問題。因此，把2015年扦插試驗(yàn)成活的白牛筋木，嫁接蘋果和梨品種試驗(yàn)，同時(shí)開展白牛筋木的組織培養(yǎng)離體保存研究，找到適宜快速擴(kuò)繁的方法，加速白牛筋木矮化砧的繁殖推廣。在無菌系建立的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了牛筋條芽增值培養(yǎng)基的篩選工作，以MS為基本培養(yǎng)基，利用6-BA1-2（細(xì)胞分裂素）、KT1-2（激動(dòng)素）、NAA0.1-1（生長素）等激素，設(shè)計(jì)了2組12個(gè)配方來進(jìn)行牛筋條芽增值培養(yǎng)基的篩選。具體的配方見表1：

表1牛筋條芽增值培養(yǎng)基配方

通過多次的篩選比較，目前已基本篩選出第一組中的第二個(gè)培養(yǎng)基，即MS+6-BA1+NAA0.5配方對(duì)牛筋條芽增值有較好地效果，解決了牛筋條在擴(kuò)繁過程中的芽增值問題。其芽的增值數(shù)量在5～10棵之間，而其他配方的培養(yǎng)基增值數(shù)量僅在0～4棵。因此擴(kuò)繁過程中以MS+6-BA1+NAA0.5配方為主要的芽增值培養(yǎng)基。

本發(fā)明采用組織培養(yǎng)增殖方法，對(duì)白牛筋木矮化砧木進(jìn)行大批量生產(chǎn)，降低了育苗成本，提高了育苗效率。

上面對(duì)本專利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。