本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二球懸鈴木(Platanus acerifolia Wind.)是懸鈴木科(Platanaceae)懸鈴木屬(Platanus)落葉大喬木樹種，為一球懸鈴木和三球懸鈴木的雜種(P.occidentalis×P.orientalis)，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，現(xiàn)已于世界各地廣為栽植。二球懸鈴木雜種優(yōu)勢(shì)明顯，冠大蔭濃、樹形優(yōu)美、樹干斑駁有致，速生、易繁殖、耐修剪、抗逆性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的空氣凈化和滯塵減噪能力，享有“行道樹之王”的美譽(yù)。我國(guó)從二十世紀(jì)初開始引入栽培，現(xiàn)于南北各地均有栽培，生長(zhǎng)良好。

二球懸鈴木雄花于4-5月份發(fā)育成熟，散落大量花粉，同時(shí)老球果開始脫落，果毛漫天飛揚(yáng)，而花粉、果毛又是常見過敏源之一，給市民帶來嚴(yán)重的造成呼吸道、皮膚過敏現(xiàn)象。本課題組希望開展基礎(chǔ)生物學(xué)研究，利用基因工程育種手段選育出無花無球的二球懸鈴木新品種。

目前關(guān)于二球懸鈴木的組織培養(yǎng)已有報(bào)道，采用的外植體包括葉片再生、下胚軸再生等為材料，但以二球懸鈴木子葉為外植體進(jìn)行再生培養(yǎng)成株的研究至今未見報(bào)道。而且以懸鈴木葉片、下胚軸作為外植體進(jìn)行再生培養(yǎng)時(shí)，其外植體易褐化死亡，再生芽誘導(dǎo)率低且不穩(wěn)定，因此建立穩(wěn)定的高頻的二球懸鈴木再生體系，可為其基因工程育種研究提供試驗(yàn)依據(jù)，有效地推進(jìn)二球懸鈴木新品種選育進(jìn)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種二球懸鈴木子葉高頻再生體系的建立方法，本方法以二球懸鈴木成熟種子的子葉為外植體，建立其再生體系，該方法不定芽芽誘導(dǎo)率能達(dá)到67％以上，且每片子葉誘導(dǎo)出的不定芽成苗數(shù)能達(dá)到6-8個(gè)，繼代生長(zhǎng)良好，可成為遺傳轉(zhuǎn)化的良好外植體。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

一種構(gòu)建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法，包括以下步驟：

(1)球果的采集

在懸鈴木球果成熟期的10-12月份，從成年的二球懸鈴木樹上采集飽滿的當(dāng)年生球果；

(2)種子消毒

取球果剝離出種子，先用清水揉搓脫去種毛；將搓洗干凈的種子放于超凈工作臺(tái)上按以下程序進(jìn)行消毒處理：先用75％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞溶液消毒40min，期間晃動(dòng)種子2-3次，最后用無菌水沖洗3次；

(3)子葉不定芽的再生誘導(dǎo)

將消毒后的種子，放于無菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)鋪無菌的濕潤(rùn)濾紙，在光下萌發(fā)培養(yǎng)1周，待子葉展開后，取靠近芽點(diǎn)的中下部子葉接種于子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于光下培養(yǎng)45d至切口處誘導(dǎo)出不定芽，期間每2周更換一次新鮮的子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為25℃±2℃，光照強(qiáng)度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗；

(4)子葉不定芽的增殖和生根培養(yǎng)

待步驟(3)中子葉再生出的不定芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)切下，轉(zhuǎn)移至子葉不定芽增殖培養(yǎng)基中于光下培養(yǎng)40-45d，取頂端3-4cm的頂芽轉(zhuǎn)入到子葉不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25℃±2℃，光照強(qiáng)度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗；

上述再生體系中：

培養(yǎng)基成分及其配比如下：

1)子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS，附加6-BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0；

2)子葉不定芽增殖培養(yǎng)基：MS，附加6-BA0.3mg/L，NAA0.05mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0；

3)子葉不定芽生根培養(yǎng)基：1/2MS，附加IBA0.1mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0。

上述方法中的所述的子葉為靠近合點(diǎn)的下半部1/2子葉，且不含芽點(diǎn)。

申請(qǐng)人提供了一種構(gòu)建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法的專用培養(yǎng)基，該專用培養(yǎng)基的配比及其制備方法包括：

1)子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS，附加6-BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0；

2)子葉不定芽增殖培養(yǎng)基：MS，附加6-BA0.3mg/L，NAA0.05mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0；

3)子葉不定芽生根培養(yǎng)基：1/2MS，附加IBA0.1mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0。

本發(fā)明培養(yǎng)基采用常規(guī)高溫蒸汽(121℃)滅菌20min后使用。

生根培養(yǎng)基中所述的1/2MS，是指常用MS培養(yǎng)基中的大量元素與微量元素含量減半。

本發(fā)明的顯著特點(diǎn)在于：

本發(fā)明所建立的二球懸鈴木子葉不定芽再生體系，外植體不經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)可直接通過器官發(fā)生途徑高頻率誘導(dǎo)出不定芽，培養(yǎng)周期短，成苗率高，方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于細(xì)胞工程和基因工程育種的研究與應(yīng)用。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的二球懸鈴木子葉不定芽再生過程的技術(shù)流程圖。附圖標(biāo)記說明：

圖1中的A圖：子葉不定芽誘導(dǎo)初期；圖1中的B圖：子葉不定芽誘導(dǎo)中期；圖1中的C-D圖：子葉不定芽誘導(dǎo)后期。

圖2：本發(fā)明的二球懸鈴木子葉不定芽增殖與生根示意圖。附圖標(biāo)記說明：

圖1中的A圖：不定芽增殖示意圖；圖1中的B圖：不定芽生根示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種構(gòu)建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法，具體步驟如下所述：

(1)果球的采集與種子消毒、萌發(fā)

選取健壯的成年二球懸鈴木，取其中上部飽滿球果2-3個(gè)，將其種子剝離下來，用清水揉搓去除種毛，再用自來水沖洗30-40min。將沖洗完的種子放于超凈工作臺(tái)上按以下程序進(jìn)行消毒處理：先用75％酒精消毒種子40s，再用0.1％升汞溶液消毒種子40min，消毒期間晃動(dòng)種子2-3次，最后用無菌水沖洗3次；將消毒后的種子放置無菌的培養(yǎng)皿(內(nèi)鋪濕潤(rùn)的無菌濾紙)中，在培養(yǎng)溫度為25℃，±2℃，光照強(qiáng)度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)1周至子葉展開。

(2)二球懸鈴木子葉不定芽再生體系的建立

1)不同激素組合對(duì)二球懸鈴木子葉不定芽再生的影響

待懸鈴木種子萌發(fā)子葉展開后，取靠近芽點(diǎn)的中下部1/2子葉，約0.5*0.5cm²大小，分別接種于不同激素組合的子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(如表1)，每皿接種30-35個(gè)外植體，每處理重復(fù)3次，在培養(yǎng)溫度為25℃，±2℃，光照強(qiáng)度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)25-30d，至不定芽冒出。觀察記錄不同培養(yǎng)基的不定芽再生情況，并統(tǒng)計(jì)再生率，結(jié)果見表1所示。

表1不同的植物激素種類組合對(duì)二球懸鈴木子葉再生的影響

注：同列不同小寫字母表示在5％水平上差異顯著，基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基(附加蔗糖3％，瓊脂0.75％，培養(yǎng)基體積為1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0)，以下表格中的基本培養(yǎng)基與表1所述的基本培養(yǎng)基相同。

由表1和圖1中可看出，子葉接種到子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-6d后子葉開始變綠膨大；培養(yǎng)10-15d后子葉可膨大約1.0*1.5cm²大小，切口處出現(xiàn)芽萌動(dòng)點(diǎn)；培養(yǎng)35d左右切口處冒出大量不定芽。不同激素組合對(duì)子葉不定芽再生率存在顯著性差異(0-68.9％)，其中6-BA(6-氨基芐基嘌呤)和NAA(萘乙酸)組合對(duì)子葉不定芽誘導(dǎo)的效果最佳，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)64％以上。當(dāng)添加KT(激動(dòng)素)/NAA、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)/NAA或6-BA/IBA(吲哚丁酸)時(shí)，大多數(shù)甚至全部子葉逐漸變黃褐化死亡；當(dāng)添加TDZ(噻苯隆)/NAA、6-BA/IAA(吲哚乙酸)激素時(shí)，芽再生誘導(dǎo)率分別是46.1％和33.0％，顯著性低于6-BA/NAA組合。

2)二球懸鈴木子葉不定芽再生誘導(dǎo)的最適激素濃度確定

6-BA和NAA組合最有利于二球懸鈴木子葉不定芽的誘導(dǎo)，但最適的濃度組合有待進(jìn)一步試驗(yàn)，按以上方法將切取的二球懸鈴木子葉分別接種于不同6-BA和NAA濃度的子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(如表2)，在培養(yǎng)溫度為25℃，±2℃，光照強(qiáng)度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)后會(huì)在切口處再生出大量不定芽。培養(yǎng)期間每2周更換一次新鮮的相對(duì)應(yīng)的不同6-BA/NAA濃度組合的子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)45-50d后，觀察記錄不同培養(yǎng)基上不定芽的再生及生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)再生率和平均芽數(shù)，其結(jié)果見表2所示。

表2不同激素濃度對(duì)二球懸鈴木子葉不定芽再生的影響

由表2所示，當(dāng)二球懸鈴木子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA的濃度低于2.0mg/L時(shí)，二球懸鈴木子葉誘導(dǎo)出的多為單芽，且生長(zhǎng)較快，可能是種胚合點(diǎn)處直接萌發(fā)形成的單芽；當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L為，再生出的不定芽生長(zhǎng)良好，但二球懸鈴木子葉的不定芽誘導(dǎo)率較低，成苗數(shù)較少；當(dāng)6-BA濃度高于2.0mg/L，且6-BA/NAA含量比值在12-30之間時(shí)，二球懸鈴木子葉的不定芽誘導(dǎo)率最高達(dá)68％以上；當(dāng)6-BA/NAA含量比值超過30時(shí)，二球懸鈴木子葉誘導(dǎo)出的不定芽易出現(xiàn)玻璃化或不良狀態(tài)的愈傷化；當(dāng)6-BA為6.0mg/L，NAA的濃度為0.2mg/L時(shí)，二球懸鈴木子葉的不定芽誘導(dǎo)率雖較高，但誘導(dǎo)出的不定芽葉片卷曲畸形，生長(zhǎng)狀態(tài)差。

綜上所述，選擇二球懸鈴木子葉不定芽誘導(dǎo)率較高、芽生長(zhǎng)狀態(tài)較好、激素用量較少的MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L為二球懸鈴木子葉最佳的子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

統(tǒng)計(jì)公式說明：

芽再生率(％)＝再生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100％；

平均芽數(shù)(個(gè)/個(gè))＝外植體再生不定芽數(shù)/再生不定芽的外植體總數(shù)。

(3)增殖和生根培養(yǎng)

待二球懸鈴木子葉的再生芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，取其不定芽單株，轉(zhuǎn)移至子葉增殖培養(yǎng)基(MS添加0.3mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)20-25d后，取頂端3-4cm的頂芽轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基(見后)中生根培養(yǎng)，得到二球懸鈴木子葉的完整再生植株。

本實(shí)施例的優(yōu)選培養(yǎng)基總結(jié)如下：

(1)子葉不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS，附加6-BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0；

(2)子葉不定芽增殖培養(yǎng)基為MS，附加6-BA0.3mg/L，NAA0.05mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0；

(3)子葉不定芽生根培養(yǎng)基為1/2MS，附加IBA0.1mg/L，蔗糖3.0％，瓊脂0.75％，補(bǔ)足蒸餾水至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8-6.0。

本發(fā)明培養(yǎng)基采用常規(guī)高溫蒸汽滅菌(121℃滅菌20分鐘)后使用。生根培養(yǎng)基中的1/2MS，是通用的MS培養(yǎng)基中的大量元素與微量元素含量減半。