本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹的組培方法，屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)屬山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，茶葉是世界上三大無酒精飲料之一。近年來，隨著茶產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，茶葉生產(chǎn)中對優(yōu)良茶樹新品種的需求越來越迫切。利用生物技術(shù)進行組培快繁具有繁殖系數(shù)高，最大限度地保持品種的遺傳穩(wěn)定性和無性系快繁能力等優(yōu)點，在茶葉生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景,雖然傳統(tǒng)育種方法已培育出了產(chǎn)量高和品質(zhì)優(yōu)的茶樹品種，但生產(chǎn)上仍缺乏高茶氨酸、高茶多酚和低咖啡堿等符合人們消費需求的優(yōu)異品種。這主要是因為茶樹基因的高度雜合性，傳統(tǒng)的茶樹育種年限長、難度較大。植物離體再生技術(shù)的日益成熟和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，為茶樹品種創(chuàng)新開辟了新的途徑?；蚬こ碳夹g(shù)的應(yīng)用需要建立高頻率的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而高頻率的遺傳轉(zhuǎn)化體系又依賴于高頻率的再生體系。茶樹組織培養(yǎng)的成本主要包括組培苗生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基、設(shè)施設(shè)備、供電成本、耗材和人工成本。常規(guī)的茉莉花組織培養(yǎng)方法要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培養(yǎng)基中才能正常生長，耗能大，人工操作成本高。如果能通過藥物抑菌的方法來改造培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基在不需要進行高溫高壓滅菌，就能夠獲得茶樹的正常生長。然而，針對不同的植物品種要想找到一種合適的抗菌劑是比較困難的，往往是當培養(yǎng)基抗菌時，植物組織的生長就受到抑制；而植物組織正常生長，就無法獲得滿意的抗菌效果。其原因一是還沒有一種抗生素對所有的菌類都有效，而且藥效期短；二是有些抗菌素、防腐劑在有效的濃度下，其殺菌、抗菌離子對植物組織直接產(chǎn)生傷害，有些則產(chǎn)生鹽害。必須選擇與植物組織親和、友好，藥效期長(至少一個生長周期)，不產(chǎn)生鹽害并具有殺菌、抗菌活性的物質(zhì)作為抗菌劑。因此，篩選合適的抗菌藥劑是開放組培技術(shù)得以應(yīng)用的關(guān)鍵。本發(fā)明為茶樹組織培養(yǎng)提供一種抑菌培養(yǎng)方法。一方面可以降低茶樹組織培養(yǎng)對設(shè)施設(shè)備的要求，尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓鍋設(shè)備，縮減了投資成本，電能消耗也將大幅度降低；另一方面，采用抑菌培養(yǎng)基進行茶樹組織培養(yǎng)，組培環(huán)節(jié)大為簡化，人工操作的速度大幅提高，從而降低了人工成本。此外，由于改造后的培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制組織培養(yǎng)過程中的污染問題，又不會對茶樹生長產(chǎn)生毒害或抑制，即不影響茶樹的正常生長，從根本上簡化了茶樹組織培養(yǎng)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹的組培方法。本發(fā)明的目的是通過以下方法實現(xiàn)的。本發(fā)明的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～1.0mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸鈉+5～10mg/L乳酸鏈球菌素+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；增殖培養(yǎng)基為：MS+1～2mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LIBA+0.5～2mg/LGA3+40～100mg/L次氯酸鈉+5～10mg/L乳酸鏈球菌素+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+1～3mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸鈉+5～10mg/L乳酸鏈球菌素+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-BA，指6-芐氨基嘌呤；所述IBA，指α-吲哚丁酸；所述GA3，指赤霉素；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導(dǎo)培養(yǎng)：剪取無病蟲害生長健壯的茶樹新梢，剪去葉片后，剪成2～3cm的帶腋芽莖段，用洗衣粉浸泡沖洗15min后，用體積比為75％酒精消毒30s，再用重量體積比為0.1％升汞浸泡消毒12min，無菌水反復(fù)沖洗不少于3次；消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后長出新芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1000Lx；5.增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的茶樹新芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，30d后逐步誘導(dǎo)出叢生芽；將叢生芽切開，或?qū)㈤L的新芽再切成帶腋芽的莖段，接種到增殖培養(yǎng)基上；每30d轉(zhuǎn)接一次，獲得大量幼芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1500Lx；6.生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm芽苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1500Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃。本發(fā)明的應(yīng)用效果：本發(fā)明的抑菌組培方法，利用化學(xué)試劑添加到各種培養(yǎng)基中，達到滅菌或抑菌的作用，配制的培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌。因此，在茶樹誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各個階段，除了要考慮常用的評價指標外，還要考慮污染率的問題。1.誘導(dǎo)培養(yǎng)：通過實驗證實，本發(fā)明的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹的組培方法與常規(guī)的茶樹組培方法相比，結(jié)果如表1所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段外植體培養(yǎng)的成活率差異不明顯。表1本發(fā)明的抑菌組培方法對茶樹誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響組培方式外植體數(shù)外植體污染數(shù)成活率(％)常規(guī)組培方法722565.3抑菌組培方法662168.22.增殖培養(yǎng)：本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)組培茶樹的增殖倍數(shù)和污染率的比較，結(jié)果如表2所示，增殖倍數(shù)和污染率二個指標都差異不顯著。從瓶苗的生長狀況看，本發(fā)明抑菌組培方法的培養(yǎng)基由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素損失較少，其茶樹組培苗更壯，葉色更綠。表2本發(fā)明的抑菌組培方法對茶樹增殖倍數(shù)和污染率的影響3本發(fā)明的抑菌組培方法對茶樹生根率和污染率的影響：在組培苗生根過程中，本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)的茶樹組培方法相比，結(jié)果如表3所示，生根率和污染率的差異不顯著。表3本發(fā)明抑菌組培方法的茶樹瓶苗生根情況組培方式生根率(％)平均污染率(％)常規(guī)組培方法850.5抑菌組培方法880.34.成本分析：本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)組培的成本分析見表4。本發(fā)明組培省去了高壓滅菌環(huán)節(jié)，簡化了組培程序，提高了工作效率。從直接費用計算，每年可以節(jié)約5.5萬元左右(以每天配制50L培養(yǎng)基計算)。常規(guī)組培還需要添置高壓鍋等設(shè)備及日常維護，此外，還存在實驗室安全等問題。表4本發(fā)明的茶樹抑菌組培方法與常規(guī)組培的成本分析表本發(fā)明具有如下有益效果：1.本發(fā)明的茶樹抑菌組培方法中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了茶樹組培技術(shù)環(huán)節(jié)，降低了茶樹組培成本。2.本發(fā)明的茶樹抑菌組培方法，操作簡單，只需按不同的培養(yǎng)基配方配制后即可，實用性強，推廣性好。3.本發(fā)明的茶樹抑菌組培方法與常規(guī)的茶樹組培方法對比，可以降低成本10％以上。具體實施方式為了進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實施例加以說明。實施例一：一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹的組培方法一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹的組培方法，包括以下步驟：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+60mg/L次氯酸鈉+8mg/L乳酸鏈球菌素+30mg/L丙酸鈣+0.1mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；增殖培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+1mg/LGA3+60mg/L次氯酸鈉+8mg/L乳酸鏈球菌素+30mg/L丙酸鈣+0.1mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+2mg/LIBA+60mg/L次氯酸鈉+8mg/L乳酸鏈球菌素+30mg/L丙酸鈣+0.1mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1.0mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導(dǎo)培養(yǎng)：剪取無病蟲害生長健壯的茶樹新梢，剪去葉片后，剪成2～3cm長的帶腋芽莖段，用洗衣粉浸泡沖洗15min后，用體積比為75％酒精消毒30s，再用重量體積比為0.1％升汞浸泡消毒12min，無菌水反復(fù)沖洗3次；消毒后的莖段在無菌條件下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后長出新芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1000Lx；5.增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的新芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，30d后逐步誘導(dǎo)出叢生芽；將叢生芽切開，或?qū)㈤L的新芽再切成帶腋芽的莖段，接種到增殖培養(yǎng)基上；每30d轉(zhuǎn)接一次，可獲得大量幼芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1400Lx；6.生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm芽苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為25℃，光照12h，光照強度為1500Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃。當前第1頁1 2 3