背景技術(shù)：
：拔地拉(Badila)，又稱黑皮蔗，是一種熱帶型水果甘蔗，清甜可口，營養(yǎng)價(jià)值高，在我國種植歷史悠久，在廣西已有50多年的栽培歷史，也是面積最大的水果甘蔗，其中廣西種植面積占總面積的90％以上。由于拔地拉種植年限太久，種性退化，已普遍感染了花葉病(sugarcanemosaicvirus,SCMV)和宿根矮化病(ratoonstuntingdisease,RSD)等病毒性病害，致使甘蔗植株矮化、節(jié)間變短、品質(zhì)變劣，商品食用價(jià)值下降，并且產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響。研究表明，莖尖分生培養(yǎng)對甘蔗花葉病、宿根矮化病等病毒病的脫毒是有效的。利用優(yōu)良拔地拉的莖尖生長點(diǎn)及心葉進(jìn)行組織培養(yǎng)，既可快速繁殖優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的拔地拉良種，又能減輕病毒感染。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，生產(chǎn)健康果蔗組培苗是解決種質(zhì)退化問題行之有效的途徑。拔地拉脫毒種苗組培快繁的成本主要包括組培苗生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基、設(shè)施設(shè)備、供電成本、耗材和人工成本。常規(guī)的拔地拉脫毒種苗組培快繁方法要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培養(yǎng)基中，進(jìn)行無菌培養(yǎng)才能正常生長，設(shè)備要求高且耗能大，人工操作成本高。如果能通過抑菌的方法來改造培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基在不需要進(jìn)行高溫高壓滅菌的情況下，仍能使拔地拉脫毒組培苗正常生長，那樣，一方面既可以降低拔地拉組織培養(yǎng)對設(shè)施設(shè)備的要求，尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓鍋設(shè)備，減少了投資成本，電能消耗也將大幅度降低；另一方面，組培環(huán)節(jié)大為簡化，人工操作的速度大幅提高，從而降低了人工成本。此外，由于改造后的培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制組織培養(yǎng)過程中的污染問題，又不會對拔地拉生長產(chǎn)生毒害或抑制，即不影響拔地拉的正常生長，從而從根本上簡化了拔地拉組織培養(yǎng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種利用抑菌培養(yǎng)基培育拔地拉的組培方法。本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育拔地拉的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0～5.0mg/L6-BA+0.1～1.0mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+50～100mg/L丙酸鈣+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；增殖培養(yǎng)基為：MS+1.0～3.0mg/L6-BA+0.1～1.0mg/LNAA+1.0～2.0mg/LKT+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+50～100mg/L丙酸鈣+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+2.0～5.0mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+50～100mg/L丙酸鈣+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-BA，指6-芐氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌呤；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導(dǎo)培養(yǎng)：選擇田間生長旺盛無病蟲害的拔地拉植株，在莖中部取具有飽滿芽點(diǎn)的雙芽莖段，洗凈，并用800倍稀釋的多菌靈浸泡30min，然后用清水洗凈后放入恒溫水浴鍋中，50～52℃熱水處理30min，期間不斷攪拌使拔地拉莖段受熱均勻；然后，取出莖段用無菌泥炭土覆蓋，厚度為剛露出蔗芽，保持濕潤，并在35～37℃和1500Lx光照條件下培養(yǎng)；待發(fā)芽后，取健壯的植株，從最高肥厚帶往下30cm處切下，用體積比為75％的酒精表面消毒，剝離外層葉鞘，取含生長點(diǎn)0.5～1.0cm的芽尖，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30d后可形成大量的叢生芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1500Lx；5.增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中，叢生芽逐步發(fā)育成不具根的幼苗，每15d轉(zhuǎn)接一次，可以達(dá)到大量增殖的效果；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1500Lx；6.生根培養(yǎng)：當(dāng)叢生苗長到4～6cm高，且莖桿直徑不小于0.2cm時，將叢生苗切成單株，接種到生根培養(yǎng)基上，25d后形成完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1500Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的基質(zhì)中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃；所述透水性好的基質(zhì)，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。本發(fā)明的應(yīng)用效果：本發(fā)明的抑菌組培方法，利用化學(xué)試劑添加到各種培養(yǎng)基中，達(dá)到滅菌或抑菌的作用，配制的培養(yǎng)基是無需高溫高壓滅菌。因此，拔地拉誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的各個階段，除了要考慮常用的評價(jià)指標(biāo)外，還要考慮污染率的問題。1.誘導(dǎo)培養(yǎng)：通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育拔地拉的組培方法與常規(guī)的拔地拉組培方法相比，結(jié)果如表1所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的外植體培養(yǎng)的成活率差異不明顯。表1本發(fā)明的抑菌組培方法對拔地拉誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響組培方式外植體數(shù)外植體污染數(shù)成活率(％)常規(guī)組培方法802667.5抑菌組培方法762369.72.增殖培養(yǎng)：本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)組培拔地拉的增殖倍數(shù)和污染率的比較，結(jié)果如表2所示，增殖倍數(shù)和污染率二個指標(biāo)都差異不明顯。從瓶苗的生長狀況看，本發(fā)明的抑菌組培的培養(yǎng)基由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素?fù)p失較少，拔地拉組培苗更壯，葉色更綠。表2本發(fā)明的抑菌組培方法對拔地拉增殖倍數(shù)和污染率的影響組培方式增殖倍數(shù)平均污染率(％)生長狀況常規(guī)組培方法4.60苗弱、葉色淺綠、莖細(xì)。抑菌組培方法4.70苗壯、葉色綠、莖粗。3.本發(fā)明的抑菌組培方法對拔地拉生根率和污染率的影響：在組培苗生根過程中，本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)的拔地拉組培方法相比，由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素?fù)p失較少，其拔地拉組培苗生根效果更好，比較結(jié)果如表3所示，生根率和污染率的差異不顯著。表3本發(fā)明的抑菌組培方法的拔地拉瓶苗生根情況組培方式生根率(％)平均污染率(％)生長狀況常規(guī)組培方法970.4根細(xì)、短，平均根條數(shù)少。抑菌組培方法980.3根粗、長，平均根條數(shù)多。4.成本分析：本發(fā)明的抑菌組培方法與常規(guī)組培的成本分析見表4。本發(fā)明組培省去了高壓滅菌環(huán)節(jié)，簡化了組培程序，提高了工作效率。從直接費(fèi)用計(jì)算，每年可以節(jié)約5.5萬元左右(以每天配制50L培養(yǎng)基計(jì)算)。還需要添置高壓鍋等設(shè)備及日常維護(hù)，此外，存在實(shí)驗(yàn)室安全等問題。表4本發(fā)明的拔地拉簡便組培方法與常規(guī)組培的成本分析表本發(fā)明具有如下有益效果：1.本發(fā)明的拔地拉抑菌組培方法中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了拔地拉組培技術(shù)環(huán)節(jié)，降低了拔地拉組培成本。2.本發(fā)明的拔地拉抑菌組培方法，操作簡單，只需按不同的培養(yǎng)基配方配制后即可，實(shí)用性強(qiáng)，推廣性好。3.本發(fā)明的拔地拉抑菌組培方法與常規(guī)的拔地拉組培方法對比，可以降低成本10％以上。具體實(shí)施方式為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例一：一種利用抑菌培養(yǎng)基培育拔地拉的組培方法一種利用抑菌培養(yǎng)基培育拔地拉的組培方法，包括以下步驟：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+1.0mg/L環(huán)絲氨酸+30mg/L特美汀+70mg/L丙酸鈣+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；增殖培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1.5mg/LKT+60mg/L次氯酸鈉+1.0mg/L環(huán)絲氨酸+30mg/L特美汀+70mg/L丙酸鈣+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+3.0mg/LNAA+60mg/L次氯酸鈉+1.0mg/L環(huán)絲氨酸+30mg/L特美汀+70mg/L丙酸鈣+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導(dǎo)培養(yǎng)：選擇田間生長旺盛無病蟲害的拔地拉植株，在莖中部取具有飽滿芽點(diǎn)的雙芽莖段，洗凈并用800倍稀釋的多菌靈浸泡30min，然后用清水洗凈后放入恒溫水浴鍋中，50～52℃熱水處理30min，期間不斷攪拌使拔地拉莖段受熱均勻；然后，取出莖段用無菌泥炭土覆蓋，厚度為剛露出蔗芽，保持濕潤，并在35～37℃和1500Lx光照條件下培養(yǎng)；待發(fā)芽后，取健壯的植株，從最高肥厚帶往下30cm處切下，用體積比為75％的酒精表面消毒，剝離外層葉鞘，取含生長點(diǎn)0.5～1.0cm的芽尖，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30d后可形成大量的叢生芽；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1500Lx；5.增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中，叢生芽逐步發(fā)育成不具根的幼苗，每15d轉(zhuǎn)接一次，可以達(dá)到大量增殖的效果；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1500Lx；6.生根培養(yǎng)：當(dāng)叢生苗長到4～6cm高,且莖桿的直徑不小于0.2cm時，將叢生苗切成單株，接種到生根培養(yǎng)基上，25d后形成完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1500Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的基質(zhì)中(草木灰：沙子：耕作土＝1:1:1)，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃。當(dāng)前第1頁1 2 3