本發(fā)明屬于珍稀瀕危植物組織培養(yǎng)快繁方法，具體涉及一種珍稀瀕危植物四藥門花組織培養(yǎng)快繁方法。
背景技術(shù)：
：四藥門花(Loropetalumsubcordatum)是金縷梅科(Hamamelidaceae)檵木屬常綠灌木或小喬木，是中國特有的殘遺植物，是我國二級保護(hù)植物(于永福.中國野生植物保護(hù)工作的里程碑——《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》出臺[J].植物雜志,1999(05):3.)。四花門花株形優(yōu)美，花期長，也是一種極具應(yīng)用價值的景觀植物，僅我國分布于廣西木論、貴州茂蘭、廣東中山以及香港幾個地區(qū)，因其分布區(qū)域狹窄，且數(shù)量極少，被列為IUCN(InternationalUnionForConservationOfNature)稀有植物和中國國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物(張宏達(dá).中國植物志:金縷梅科[M].北京:科學(xué)出版社,1979.)。對四藥門花的生殖生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，種群存在自交衰退現(xiàn)象，其自然結(jié)實(shí)率僅有4.79％，即使輔以人工異株授粉，其結(jié)實(shí)率也僅有6.67％(顧壘,張奠湘.瀕危植物四藥門花的自花授粉[J].植物分類學(xué)報,2008,46(5):651–657.)。為保護(hù)現(xiàn)有的種質(zhì)資源，減輕資源壓力，擴(kuò)大種群數(shù)量，并能實(shí)現(xiàn)推廣利用，組織培養(yǎng)快速繁殖成為重要的手段，能夠?yàn)檫w地保護(hù)和擴(kuò)大種群提供新技術(shù)支撐。組織培養(yǎng)是一種能快速無性繁殖的方法，繁殖周期短，繁殖系數(shù)大，遺傳穩(wěn)定，能夠保存親本優(yōu)良的性狀，被廣泛的用于有性繁殖困難或緩慢的植物種類以及自然種群稀少的瀕危植物的保護(hù)中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種珍稀瀕危植物四藥門花組織培養(yǎng)快繁方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種珍稀瀕危植物四藥門花組織培養(yǎng)快繁方法，包括外植體滅菌處理、外植體啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及移栽等過程，具體包括如下步驟：(1)外植體滅菌與外植體啟動培養(yǎng)：以四藥門花植株新梢莖段為外植體，選取樹姿優(yōu)美，生長健壯，無病蟲害的植株采摘當(dāng)年生枝條，將枝條剪去葉片，保留葉柄，用軟毛刷蘸洗潔精水輕輕刷洗枝條，用自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺上，剪成長2.0cm左右，含1～2個葉腋芽的莖段，用0.1％升汞溶液滅菌處理5～12min，期間不斷搖動，用無菌水沖洗5～6次，接種到外植體啟動培養(yǎng)基進(jìn)行葉腋芽誘導(dǎo)，12天左右開始有芽萌動，35天左右萌芽約2.0cm長，能夠進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)；(2)繼代培養(yǎng)：將步驟(1)誘導(dǎo)得到的葉腋芽分別接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將伸長的葉腋芽剪切成莖段接入新的增殖培養(yǎng)基，如此反復(fù)，得到大量叢生芽；繼代培養(yǎng)中許多培養(yǎng)瓶中的苗都有生根現(xiàn)象，而且有的根系發(fā)育良好，說明四藥門花是非常容易生根的樹種。(3)生根培養(yǎng)：將步驟(2)繼代培養(yǎng)得到的叢生芽切割成帶頂芽莖段接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，10天左右開始萌生小根，30天左右長出大量健壯的根系。(4)煉苗移栽：將步驟(3)獲得的生根苗移至溫室，將高3cm以上且根系發(fā)達(dá)、莖葉健壯的無菌生根苗取出，洗凈在根系上附著的培養(yǎng)基，移栽到適宜濕度的裝入穴盤的基質(zhì)中，蓋上透明塑料穴盤蓋保濕，每10天左右根據(jù)基質(zhì)濕度進(jìn)行噴水管理。約一周左右便有新葉長出，30天內(nèi)頂芽伸長，葉片長大，葉色由深綠色變成草綠色。30天后揭去塑料蓋，45天后移栽至營養(yǎng)缽中，成活率可達(dá)100％。步驟(1)中所述的消毒的時間優(yōu)選為10～12min；更優(yōu)選為10min。步驟(1)中所述的外植體啟動培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5～2.0mg·L-1+IBA0.1～0.2mg·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0。優(yōu)選為：MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0。步驟(2)中所述的增殖培養(yǎng)基為：1/4MS+KT2.0～10.0mg·L-1+6-BA0～2.0mg·L-1+IBA0～0.3mg·L-1+AC0.3～0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0；優(yōu)選為：1/4MS+KT2.0～10.0mg·L-1+6-BA0～2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0；更優(yōu)選為：1/4MS+KT2.0～10.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0。步驟(3)中所述的生根培養(yǎng)基為：1/2WPM+KT0～1.0mg·L-1+IBA0.5～1.0mg·L-1+AC0.3～0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖20g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0。優(yōu)選為：1/2WPM+IBA0.5～1.0mg·L-1+AC0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖20g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0。所述的外植體啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)三個階段的培養(yǎng)室條件均為光照時間8～12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。所述的移栽的條件為溫度25±2℃，光照時間8～12h/d，光照強(qiáng)度2000～5000lx。所述的移栽的基質(zhì)為腐殖土、黃心土:腐殖土＝2:1或黃心土:腐殖土:沙＝2:1:1。所述的外植體滅菌處理、外植體啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)階段培養(yǎng)時間分別根據(jù)所調(diào)查的叢生芽分化率、叢生芽增殖率和生根確定。上述所述MS成分和含量：KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，MgSO4·7H2O370mg·L-1，CaCl2·2H2O440mg·L-1，KI0.83mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，VB10.1mg·L-1，VB60.5mg·L-1，煙酸0.5mg·L-1。上述所述1/4MS成分和含量：KNO3475mg·L-1，NH4NO3412.5mg·L-1，KH2PO442.5mg·L-1，MgSO4·7H2O92.5mg·L-1，CaCl2·2H2O110mg·L-1，KI0.83mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，VB10.1mg·L-1，VB60.5mg·L-1，煙酸0.5mg·L-1。上述所述1/2WPM成分和含量：K2SO4495mg·L-1，MgSO4·7H2O185mg·L-1，KH2PO485mg·L-1，NH4NO3200mg·L-1，Ca(NO3)2·4H2O278mg·L-1，CaCl2·2H2O48mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，CuSO4·5H2O0.25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg·L-1，Na2-EDTA·2H2O37.3mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，VB11mg·L-1，VB60.5mg·L-1，煙酸0.5mg·L-1。本發(fā)明所用的試劑全稱：IBA，Indole-3-butytricacid，吲哚丁酸；6-BA，6-Benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤；NAA，1-Naphthylaceticacid，萘乙酸；KT，Kinetin，6-糠氨基嘌呤；AC，Activecarbon，活性炭。本發(fā)明在外植體啟動培養(yǎng)中用0.1％升汞進(jìn)行不同時間的滅菌處理，篩選出存活率最高，褐化率最低的滅菌時間。在繼代培養(yǎng)中，進(jìn)行不同基本培養(yǎng)基與激素配比的組合，篩選出增殖率最高，生長最優(yōu)的組合。在生根培養(yǎng)中，進(jìn)行不同激素配比的組合，篩選出生根率最高，組培苗最健壯的組合。本實(shí)驗(yàn)啟動培養(yǎng)為接種后35天統(tǒng)計(jì)，繼代培養(yǎng)為60天后統(tǒng)計(jì)，生根培養(yǎng)為接種后30天統(tǒng)計(jì)，移栽存活率為移栽后45天統(tǒng)計(jì)。表10.1％HgCl2處理時間對四藥門花莖段外植體葉腋芽萌發(fā)的影響編號處理時間/min接種莖段數(shù)/段污染率/％褐化率/％萌發(fā)率/％154517.5012.5045.00284525.6412.8230.77310456.3813.0251.064124514.5823.8150.005154511.9029.1727.08在本發(fā)明中，使用HgCl2滅菌不同時間，滅菌10min的污染率最低的，褐化率居中，且萌發(fā)率最高，而滅菌時間再加長就會增加褐化率，且萌發(fā)率也會逐漸減低。因此，本發(fā)明選用最佳滅菌時間為10min。表2不同基本培養(yǎng)基和不同激素配比對四藥門花莖段的繼代培養(yǎng)影響在本發(fā)明中，繼代培養(yǎng)階段分別研究3種基本培養(yǎng)基與不同激素及激素不同濃度的組合，結(jié)果表明，使用1/4MS培養(yǎng)基的平均芽長較其他基本培養(yǎng)基長，在使用1/4MS培養(yǎng)基的處理中，芽的增殖倍數(shù)2、3、4號處理明顯高于1號處理，區(qū)別在于KT的使用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4號處理的芽增殖倍數(shù)和芽長均高于2、3號處理，因此以KT、6-BA與IBA綜合效果最佳，且KT使用量要與6-BA相對平衡，不能過高。本發(fā)明故選擇1/4MS+KT2.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1培養(yǎng)基作為最佳增殖培養(yǎng)基。表3不同激素組合對四藥門花生根的影響在本發(fā)明中，生根培養(yǎng)階段主要研究了3種激素與活性炭的組合，結(jié)果表明，無論是哪種培養(yǎng)基，生根率都達(dá)到100.00％，但苗木的生長勢有所不同。無活性炭組株高較矮，生長不良，葉小而發(fā)黃。其他激素組合，以9號IBA1.0mg·L-1處理組的平均株高最高，平均生根條數(shù)最多，平均根長最長，葉片大，葉色深綠色，植株健壯，因此本發(fā)明選擇1/2WPM+IBA1.0mg·L-1+AC0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖20g·L-1培養(yǎng)基作為最佳生根培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，移栽基質(zhì)選用了腐殖土，黃心土:腐殖土＝2:1，黃心土:腐殖土:沙＝2:1:1三種配比，其中腐殖土移栽存活率達(dá)到100％，為最優(yōu)，黃心土：腐殖土＝2:1移栽存活率為96％～98％，黃心土:腐殖土:沙＝2:1:1移栽存活率為98％～99％。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明顯著的優(yōu)勢在于運(yùn)用1/4MS為基本培養(yǎng)基，添加一定濃度的KT或KT和6-BA組合，誘導(dǎo)率達(dá)到100.00％，高于了孫紅梅等(孫紅梅，陳彥，梁銀興，等.瀕危植物四藥門花的組織培養(yǎng)研究初探[J].現(xiàn)代園藝.2015(04):12-13.)研究的MS+6-BA4mg·L-1誘導(dǎo)率96.7％。生根培養(yǎng)基通過添加活性炭后生根率達(dá)到了100.00％，添加IBA的培養(yǎng)基平均生根條數(shù)達(dá)到5.78條，植株生長健壯。運(yùn)用本發(fā)明能夠在短期內(nèi)快速大量繁殖健壯四藥門花，達(dá)到對珍稀瀕危四藥門花種群繁殖保育和工廠化生產(chǎn)的目的。本發(fā)明外植體滅菌以及初代培養(yǎng)的萌發(fā)率可達(dá)為51.06％，誘導(dǎo)率與生根率、移栽成活率均可達(dá)100％，且培養(yǎng)周期短，繁殖率高，可實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。附圖說明圖1是本發(fā)明四藥門花外植體啟動階段示意圖。圖2是本發(fā)明四藥門花增殖階段示意圖。圖3是本發(fā)明四藥門花生根階段示意圖。圖4是本發(fā)明四藥門花移栽初期的示意圖。圖5是本發(fā)明四藥門花換袋苗初期的示意圖。圖6是本發(fā)明四藥門花換袋2個月后的示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(1)外植體的選?。簩?shí)驗(yàn)材料來自于廣東省中山市五桂山四藥門花自然居群，采集當(dāng)年生木質(zhì)化程度較好的枝條，扦插于廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫室大棚中繁殖一定數(shù)量，于10月份采集扦插苗的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條作為組培外植體材料，在實(shí)驗(yàn)室中剪去葉片，保留葉柄。(2)外植體消毒與外植體啟動培養(yǎng)：將上述的莖段用軟毛刷蘸洗潔精水輕輕刷洗，自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺上，剪成長2.0cm左右，含1～2個葉腋芽的莖段，用0.1％升汞溶液消毒10min，用無菌水沖洗5～6次，接種到外植體啟動培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0)中，進(jìn)行葉腋芽誘導(dǎo)，10天左右開始有葉腋芽萌發(fā)，35天左右萌芽約2.0cm長，萌發(fā)率51.06％，能夠進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。(3)繼代培養(yǎng)：將外植體啟動培養(yǎng)獲得的葉腋芽放入1/4MS+KT2.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1周后頂芽開始伸長，10天后基部葉腋處的隱芽開始萌動，60天左右新生葉腋芽可以生長到3.5cm以上，60天左右時將伸長的葉腋芽剪切成1.2cm左右長的莖段接入新的增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)2.082，如此反復(fù)，得到大量叢生芽。培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。(4)生根培養(yǎng)：將繼代培養(yǎng)中獲得的叢生芽切割成1.5cm左右高的單個帶頂芽植株，轉(zhuǎn)移至1/2WPM+IBA1.0mg·L-1+AC0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖20g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)10天后，基部頂端開始有小根萌出，培養(yǎng)30天后獲得莖葉健壯且生根率達(dá)100％、平均生根5.78條，平均根長2.25cm的優(yōu)質(zhì)生根苗。培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。將生好根的組培瓶移至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院人工氣候室內(nèi)，取出苗木，選擇高3cm以上，且根系發(fā)達(dá)、莖葉健壯的生根苗，洗凈在根系上附著的培養(yǎng)基，移栽到適宜濕度的裝入穴盤的腐殖土基質(zhì)中，蓋上透明塑料穴盤蓋保濕，大約7天便有新葉萌發(fā)，每10天左右根據(jù)基質(zhì)濕度進(jìn)行噴水管理，30天后揭去塑料蓋。45天后移栽到16*16cm的營養(yǎng)袋中，基質(zhì)配比不變，保持土壤適宜濕度，移至廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫棚中管養(yǎng)，定期撫育管理并檢測生長情況。人工氣候室溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度5000lx，溫棚中溫度為25～28℃，濕度為85％，用75％透光率的遮陰網(wǎng)遮蔭。經(jīng)試驗(yàn)，采用本實(shí)施例所有組培苗的苗床移栽成活率為100％。實(shí)施例2(1)外植體的選?。簩?shí)驗(yàn)材料來自于廣東省中山市五桂山四藥門花自然居群，采集當(dāng)年生木質(zhì)化程度較好的枝條，扦插于廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫室大棚中繁殖一定數(shù)量，于10月份采集扦插苗的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條作為組培外植體材料，在實(shí)驗(yàn)室中剪去葉片，保留葉柄。(2)外植體消毒與外植體啟動培養(yǎng)：將上述的莖段用軟毛刷蘸洗潔精水輕輕刷洗，在自來水中沖洗干凈后置于超凈工作臺上，剪成長2.0cm左右，含1～2個葉腋芽的莖段，用0.1％升汞溶液消毒5min，用無菌水沖洗5～6次，接種到外植體啟動培養(yǎng)基(MS+6-BA0.5mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0)中，進(jìn)行葉腋芽誘導(dǎo)。12天左右開始有葉腋芽萌發(fā)，35天左右萌芽約2.0cm長，萌發(fā)率45.00％能夠進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照時間8h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。(3)繼代培養(yǎng)：將外植體啟動培養(yǎng)獲得的葉腋芽放入1/4MS+KT10.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1周后頂芽開始伸長，10天后基部葉腋處的隱芽開始萌動，60天左右新生葉腋芽可以生長到3.0cm以上，60天時將伸長的葉腋芽剪切成1.2cm左右長的莖段接入新的增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)2.00，如此反復(fù)，得到大量叢生芽。培養(yǎng)條件為光照時間8h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。(4)生根培養(yǎng)：將繼代培養(yǎng)中獲得的叢生芽切割成1.5cm左右高單個帶頂芽植株，轉(zhuǎn)移至1/2WPM+IBA0.5mg·L-1+AC0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖20g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)10天左右即有小根生成，培養(yǎng)35天后獲得生根率100％、平均生根3.83條的枝葉健壯的生根苗。培養(yǎng)條件為光照時間8h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。將生好根的組培瓶移至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院人工氣候室內(nèi)，取出苗木，選擇高3cm以上，且根系發(fā)達(dá)、莖葉健壯的生根苗，洗凈在根系上附著的培養(yǎng)基，移栽到適宜濕度的裝入穴盤的黃心土：腐殖土：沙＝2:1:1的混合基質(zhì)中，蓋上透明塑料穴盤蓋保濕。約10天左右部分小苗開始有新葉萌發(fā)，45天后移栽到16*16cm的營養(yǎng)袋中，使用黃心土：腐殖土：沙＝2:1:1的混合基質(zhì)，保持基質(zhì)適宜濕度，移至廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫棚中管養(yǎng)，定期撫育管理并檢測生長情況。人工氣候室溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度5000lx溫棚中溫度為25～28℃，濕度為85％，用75％透光率的遮陰網(wǎng)遮蔭。保持土壤濕度。經(jīng)試驗(yàn)，采用本實(shí)施例所有組培苗的苗床移栽成活率為98.3％。實(shí)施例3(1)外植體的選?。簩?shí)驗(yàn)材料來自于廣東省中山市五桂山四藥門花自然居群，采集當(dāng)年生木質(zhì)化程度較好的枝條，扦插于廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫室大棚中繁殖一定數(shù)量，于10月份采集扦插苗的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條作為組培外植體材料，在實(shí)驗(yàn)室中剪去葉片，保留葉柄。(2)外植體消毒與外植體啟動培養(yǎng)：將上述的莖段用軟毛刷蘸洗潔精水輕輕刷洗，在自來水中沖洗干凈后置于超凈工作臺上，剪成長2.0cm左右，含1～2個葉腋芽的莖段，用0.1％升汞溶液消毒12min，用無菌水沖洗5～6次，接種到外植體啟動培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0)中，進(jìn)行葉腋芽誘導(dǎo)，10天左右開始有芽萌動，35天左右萌芽約2.0cm長，萌發(fā)率50.00％，能夠進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。(3)繼代培養(yǎng)：將外植體啟動培養(yǎng)獲得的葉腋芽放入1/4MS+KT10.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1周后頂芽開始伸長，10天后基部葉腋處的隱芽開始萌動，60天左右新生葉腋芽可以生長到3.0cm以上，60天時將伸長的葉腋芽剪切成1.2cm左右長的莖段接入新的增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)1.98，反復(fù)繼代，得到大量叢生芽。培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。(4)生根培養(yǎng)：將繼代培養(yǎng)中獲得的叢生芽切割成1.5cm左右高單個帶頂芽植株，轉(zhuǎn)移至1/2WPM+KT1.0mg·L-1+IBA0.5mg·L-1+AC0.5g·L-1+卡拉膠9g·L-1+蔗糖20g·L-1，pH調(diào)至5.8～6.0的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)10天后有根系開始萌生，培養(yǎng)35天后獲得生根率100％，平均生根4.64條的枝葉健壯的生根苗。培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25±2℃。將生好根的組培瓶移至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院人工氣候室內(nèi)，取出苗木，選擇高3cm以上，且根系發(fā)達(dá)、莖葉健壯的生根苗，洗凈在根系上附著的培養(yǎng)基，移栽到適宜濕度的裝入穴盤的黃心土：腐殖土＝2:1的混合基質(zhì)中，蓋上透明塑料穴盤蓋保濕。約7天左右部分小苗開始有新葉萌發(fā)，45天后移栽到16*16cm的營養(yǎng)袋中，使用腐殖土，保持適宜土壤濕度，移至廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫棚中管養(yǎng)，定期撫育管理并檢測生長情況。人工氣候室溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度5000lx溫棚中溫度為27～30℃，濕度為85％，用75％透光率的遮陰網(wǎng)遮蔭。經(jīng)試驗(yàn)，采用本實(shí)施例所有組培苗的苗床移栽成活率為96％。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3