本發(fā)明使用水楊酸(Salicylic acid，SA)和苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)預(yù)處理感水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)植株日本晴(Nipponbare)，隨后用黑條矮縮病毒侵染日本晴秧苗，鑒定出SA及BTH的處理可以提高水稻對(duì)RBSDV的抗性，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中降低因黑條矮縮病對(duì)水稻造成的危害，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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RBSDV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)第二組成員，以灰飛虱(Small brown planthopper，SBPH)為主要傳毒媒介進(jìn)行持久性傳播，介體灰飛虱一旦染毒，終身帶毒，并能連續(xù)傳毒，但不經(jīng)卵傳毒。自然條件下，主要寄主有水稻、玉米、大麥、小麥、高粱、粟、看麥娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。在我國(guó)，RBSDV侵染小麥引起小麥綠矮病，侵染玉米引起玉米粗縮病，侵染水稻引起水稻黑條矮縮病。水稻黑條矮縮病植株的典型癥狀為植株矮縮、葉片短小僵直，顏色濃綠，心葉扭曲褶皺，發(fā)病初期葉背面的葉脈和莖稈上出現(xiàn)蠟淚狀白色突起，后期突起變成黑褐色，后期不抽穗或穗小，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。21世紀(jì)以來(lái)，水稻黑條矮縮病在我國(guó)各水稻產(chǎn)區(qū)尤其是江浙一帶越來(lái)越嚴(yán)重，對(duì)我國(guó)水稻生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

SA，分子式為C₇H₆O₃，無(wú)色透明晶體，是植物一種重要的酚類激素，廣泛作用于植物的生理過(guò)程：如生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用、蒸騰作用、礦物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)等。最主要的，SA還是一種極其重要的信號(hào)分子參與植物免疫反應(yīng)，因?yàn)樗梢哉T導(dǎo)產(chǎn)生一些抗病原物病程相關(guān)非表達(dá)子NPR1等，進(jìn)入細(xì)胞核與受體因子TGA組成復(fù)合物，進(jìn)一步誘導(dǎo)SA途徑相關(guān)抗病基因的表達(dá)，提高植物抗病能力。

BTH，分子式為C₆H₄N₂S，針狀結(jié)晶，SA類似物，是一種典型的植物抗病誘導(dǎo)劑，普通條件下無(wú)殺菌作用，但能夠誘導(dǎo)植物的免疫活性，對(duì)于植物抗病及防病起著很大的作用。在植物病蟲害防治過(guò)程中，BTH作為一種抗病誘導(dǎo)劑，比其他化學(xué)物質(zhì)更加的環(huán)保高效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明針對(duì)上述研究背景，以RBSDV感病水稻品種日本晴(Nipponbare)為研究對(duì)象，對(duì)水、SA和BTH處理后的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)SA和BTH處理后日本晴的發(fā)病率明顯低于對(duì)照組。本發(fā)明提供了利用SA及BTH降低水稻黑條矮縮病發(fā)病率的方法，利用該方法可以調(diào)高水稻對(duì)RBSDV的抗性，可應(yīng)用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、科研、環(huán)保等眾多領(lǐng)域，更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保地降低病害造成的糧食損失。

附圖說(shuō)明：

圖1健康水稻與水稻黑條矮縮病植株對(duì)比

圖2飼毒所用病株RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3水稻黑條矮縮病株飼喂灰飛虱

圖4度過(guò)循回期的灰飛虱Dot-ELISA帶毒率檢測(cè)結(jié)果

圖5SA和BTH處理后與對(duì)照組的差異，ND(No detected)指未被檢測(cè)到，不同字母表示在P＜0.05水平上存在組間差異。

具體實(shí)施方式：

下面實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1，利用水楊酸藥劑預(yù)處理水稻調(diào)查其病情的方法

1、攜帶RBSDV水稻病株的獲得

2016年4月于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院采集植株矮縮、葉色濃綠，分蘗略有增多，心葉有缺刻等表現(xiàn)出水稻黑條矮縮病典型癥狀的新鮮水稻植株(圖1)。參照Trizol(Reagent)說(shuō)明書提取水稻葉片的總RNA。并用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和質(zhì)量。只有260/280的比值在1.9和2.1之間且260/230的比值大于2.0的RNA可以用作后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。采用已發(fā)表引物RB1-S9-F：5′-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3′(R：A/G；Y：T/C；M：A/C)和RB-S9-R：5′-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3′(H：T/G；M：G/A/T)(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確定水稻疑似病株是否攜帶RBSDV。以提取的2μL水稻葉片總RNA為模板、RB-S9-R為引物，參照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以合成的2μL cDNA為模板、RB1-S9-F/RB-S9-R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用常規(guī)PCR反應(yīng)體系，最終體系由ddH₂O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的目的條帶(1200bp)(圖2)。挑選出3株較好水稻病株以備飼毒。

2、植物材料、病毒分析以及侵染方法

水稻種子(Nipponbare)首先用0.1％HgCl₂消毒1h；然后用去離子水沖洗干凈，25℃浸種2d，催芽1d；催芽后的種子點(diǎn)播于1L燒杯中培養(yǎng)，每杯40粒，每隔兩天澆灌適量的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，光照14h，黑暗10h，溫度28±1℃。

本室常年飼養(yǎng)無(wú)毒灰飛虱群體，為避免傳毒介體污染，每次使用無(wú)毒灰飛虱若蟲前取100頭Dot-ELISA法檢測(cè)其是否攜帶RBSDV，確定其為無(wú)毒蟲。將篩選備用的新鮮水稻病株種于5L燒杯中，土面覆蓋濾紙，將適量1-2齡無(wú)毒灰飛虱若蟲移入其中，并用紗布封口(圖3)，飼喂48h后將其移入預(yù)先育有武育粳3號(hào)健康秧苗的1L燒杯中度循回期(10-12d)，循回期過(guò)后取100頭灰飛虱用Dot-ELISA法檢測(cè)其RBSDV帶毒率(圖4)。

3、不同處理下的發(fā)病情況

14d左右的水稻秧苗，在其土壤較干燥的情況下，分別施加dH₂O、500μM SA各30mL(SA購(gòu)于臺(tái)灣生工生物科技有限公司)。黑暗下過(guò)夜處理12h，平均每株秧苗以10頭的量接入灰飛虱，侵染3d。隨后將蟲小心掃出，室內(nèi)緩養(yǎng)1d，再將秧苗移栽至大田，正常管理。1個(gè)月左右查看發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。重復(fù)三次。

如表中所示，相比于對(duì)照組，SA處理后日本晴的發(fā)病率降低了約45％左右，效果顯著，可以得到結(jié)論，外源添加水楊酸可以在很大程度上降低水稻黑條矮縮病的發(fā)病率。進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析如圖5。

實(shí)施例2，利用苯并噻二唑藥劑預(yù)處理水稻調(diào)查其病情的方法

1、攜帶RBSDV水稻病株的獲得

同實(shí)施例1。

2、植物材料、病毒分析以及侵染方法

同實(shí)施例2。

3、不同處理下的發(fā)病情況

14d左右的水稻秧苗，在其土壤較干燥的情況下，分別施加dH2O、500μM BTH各30mL(BTH購(gòu)于臺(tái)灣生工生物科技有限公司)。黑暗下過(guò)夜處理12h，平均每株秧苗以10頭的量接入灰飛虱，侵染3d。隨后將蟲小心掃出，室內(nèi)緩養(yǎng)1d，再將秧苗移栽至大田，正常管理。1個(gè)月左右查看發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。重復(fù)三次。

如表中所示，相比于對(duì)照組，BTH處理后日本晴的發(fā)病率降低了約50％左右，效果顯著，可以得到結(jié)論，外源添加BTH可以在很大程度上降低水稻黑條矮縮病的發(fā)病率。進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析如圖5。

上述實(shí)施不以任何形式限定本發(fā)明。