本發(fā)明屬于動(dòng)物模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體是一種通過慢性應(yīng)激對(duì)SD大鼠構(gòu)建自殺相關(guān)行為動(dòng)物模型的方法。
背景技術(shù)：
：自殺是一種嚴(yán)重危害公眾健康的社會(huì)問題，在全球死亡原因占有重要地位，其給家庭及社會(huì)帶來了沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO報(bào)道，每年全球有超過80,000人死于自殺，且有更多的人有自殺的意念和行為。因此，加強(qiáng)自殺的防治已成為亟待解決的重大公共健康問題。但迄今為止，自殺的發(fā)病機(jī)制不清。目前對(duì)自殺相關(guān)機(jī)制研究主要依賴于人體組織。然而人體組織難以獲取，這在很大程度上限制了自殺相關(guān)研究?，F(xiàn)有技術(shù)中，人們至今尚未能建立有效的自殺動(dòng)物模型用于探究自殺相關(guān)行為和潛在的藥物治療靶點(diǎn)。因此，發(fā)明一種可靠的自殺相關(guān)行為動(dòng)物模型十分必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于此，本發(fā)明的目的是建立自殺相關(guān)行為動(dòng)物模型。即通過習(xí)得性無助模型篩選出習(xí)得性無助大鼠和非習(xí)得性無助大鼠,采用“社會(huì)挫敗刺激疊加慢性不可預(yù)見性溫和刺激”進(jìn)行造模，并結(jié)合多種自殺行為相關(guān)的評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)所構(gòu)建的模型。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：基于Sprague-Dawley大鼠的自殺相關(guān)行為動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)選取至少100只SD大鼠建立習(xí)得性無助模型，從中篩選出習(xí)得性無助大鼠和非習(xí)得性無助大鼠各40只，將其中40只習(xí)得性無助大鼠和20只非習(xí)得性無助大鼠分別作為實(shí)驗(yàn)組，將剩下的20只非習(xí)得性無助大鼠作為對(duì)照組。(2)對(duì)實(shí)驗(yàn)組的大鼠進(jìn)行為期4周的社會(huì)挫敗刺激疊加慢性不可預(yù)見性溫和刺激，進(jìn)行建模，對(duì)照組不作任何處理正常喂養(yǎng)。(3)對(duì)步驟(2)的大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，包括：糖水偏好測(cè)試、激惹實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和居居住者-入侵者實(shí)驗(yàn)。為了使SD大鼠適應(yīng)環(huán)境，在進(jìn)行所述習(xí)得性無助模型之前，將SD大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，接受至少1周實(shí)驗(yàn)室環(huán)境適應(yīng)，適應(yīng)期間嚴(yán)格控制大鼠飼養(yǎng)的條件：包括噪音、光線、溫度和濕度。步驟(1)中所述習(xí)得性無助模型包括電擊誘導(dǎo)和穿梭箱測(cè)試兩個(gè)階段：在電擊誘導(dǎo)階段，首先封閉儀器中央的門，將每只SD大鼠分別置于穿梭箱一側(cè)，各接受60次不可逃避的電擊，電擊結(jié)束后分別將老鼠送回原來的飼養(yǎng)籠；24小時(shí)后，再對(duì)SD大鼠分別進(jìn)行穿梭箱測(cè)試，每只SD大鼠在不通電的穿梭箱中自由探索5分鐘，然后進(jìn)行30次電擊，SD大鼠可通過穿梭到穿梭箱對(duì)側(cè)以逃避電擊，動(dòng)物在10秒的電擊時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)逃避行為，則記為一次逃避失?。辉跒槠?0天的篩選時(shí)間內(nèi)，對(duì)每只SD大鼠進(jìn)行兩次習(xí)得性無助模型測(cè)試，選取失敗次數(shù)最多的40只作為習(xí)得性無助大鼠，失敗次數(shù)最少的40只作為非習(xí)得性無助大鼠。具體地，上述社會(huì)挫敗刺激包括將實(shí)驗(yàn)組SD大鼠放入雄性LE大鼠的飼養(yǎng)籠中，使LE大鼠與SD大鼠二者進(jìn)行身體接觸；若SD大鼠出現(xiàn)投降動(dòng)作或時(shí)間滿10分鐘后，用一個(gè)鐵絲保護(hù)籠罩住SD大鼠，以避免繼續(xù)身體接觸；時(shí)間滿1小時(shí)后將SD大鼠放回原來的籠中；每周進(jìn)行社會(huì)挫敗刺激三次，每次間隔一天。上述疊加慢性不可預(yù)見性溫和刺激包括束縛4小時(shí)、水剝奪24小時(shí)、食物剝奪24小時(shí)、擁擠24小時(shí)、濕籠24小時(shí)及斜籠24小時(shí)，每次予以實(shí)驗(yàn)組SD大鼠兩種上述刺激，每周進(jìn)行3次，每次間隔一天，每種刺激每周只進(jìn)行一次。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn):采用身體刺激和心理刺激造模，模擬人類自殺機(jī)制；成功首次構(gòu)建自殺相關(guān)行為動(dòng)物模型；可分別研究不同攻擊能力、是否習(xí)得性無助鼠及慢性刺激對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。附圖說明圖1為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)流程圖；圖2為本發(fā)明行為學(xué)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。具體實(shí)施方式下面進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)過程和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)流程參見圖1。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體重200-250克、8-10周齡的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠、3-4月齡的350-400克雄性Long-Evans(LE)大鼠和250-300克的雌性LE大鼠。主要試劑：食用蔗糖，70％酒精。主要儀器：YLS-17B避暗穿梭測(cè)試儀，透明玻璃桶，曠場(chǎng)箱，塑料瓶、高清攝像機(jī)、小動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)過程(1)利用習(xí)得性無助模型從SD大鼠中篩選出習(xí)得性無助大鼠和非習(xí)得性無助大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境適應(yīng)：實(shí)驗(yàn)開始前，將SD大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，接受至少1周實(shí)驗(yàn)室環(huán)境適應(yīng)，適應(yīng)期間嚴(yán)格控制大鼠飼養(yǎng)的條件(噪音、光線、溫度、濕度)。習(xí)得性無助模型：習(xí)得性無助模型包括電擊誘導(dǎo)和穿梭箱測(cè)試兩個(gè)階段。在電擊誘導(dǎo)階段，首先封閉儀器中央的門，將每只SD大鼠分別置于穿梭箱一側(cè)，各接受60次不可逃避的電擊，電流強(qiáng)度為1.0mA，電擊時(shí)間和電擊間歇時(shí)間均為隨機(jī)5到25秒(平均15秒)，電擊結(jié)束后分別將老鼠送回原來的飼養(yǎng)籠。24小時(shí)后，再對(duì)SD大鼠分別進(jìn)行穿梭箱測(cè)試。穿梭箱測(cè)試前，每只SD大鼠在不通電的穿梭箱中自由探索5分鐘。然后進(jìn)行30次電擊，電流強(qiáng)度為1.0mA，每次電擊10秒，電擊間歇時(shí)間為隨機(jī)20到40秒(平均30秒)，大鼠可通過穿梭到穿梭箱對(duì)側(cè)以逃避電擊。動(dòng)物在10秒的電擊時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)逃避行為，則記為一次逃避失敗。在為期40天的篩選時(shí)間內(nèi)，對(duì)每只SD大鼠進(jìn)行兩次習(xí)得性無助模型測(cè)試。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、糖水適應(yīng)訓(xùn)練和基線測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：依據(jù)每只SD大鼠兩次習(xí)得性無助模型測(cè)試中的逃避失敗次數(shù)，將200只SD大鼠分成三組：失敗次數(shù)最多的40只大鼠作為逃避失敗+刺激組(LH組)，即習(xí)得性無助大鼠，失敗次數(shù)最少的40只(即非習(xí)得性無助大鼠)中，20只作為逃避成功+刺激組(NLH組)，20只作為對(duì)照組(CON組)，而剩余的120只大鼠不再用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。LH組和NLH組大鼠會(huì)予以社會(huì)挫敗刺激疊加慢性不可預(yù)見性溫和刺激，而對(duì)照組動(dòng)物不予以任何刺激。糖水適應(yīng)訓(xùn)練和基線測(cè)試：首先給予每只SD大鼠1％糖水溶液和清水各一瓶，行48小時(shí)糖水適應(yīng)訓(xùn)練。完成訓(xùn)練后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行禁食禁引飲6小時(shí)，然后進(jìn)行1小時(shí)糖水偏好測(cè)試。分別記錄1小時(shí)內(nèi)實(shí)驗(yàn)鼠糖水和清水消耗量，并計(jì)算糖水偏好度，計(jì)算公式為糖水偏好度＝糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)。(3)社會(huì)挫敗刺激疊加慢性不可預(yù)見性溫和刺激社會(huì)挫敗刺激：將實(shí)驗(yàn)組SD大鼠放入雄性LE大鼠的飼養(yǎng)籠中，使LE大鼠與SD大鼠二者進(jìn)行身體接觸。若SD大鼠出現(xiàn)投降動(dòng)作或時(shí)間滿10分鐘后，用一個(gè)鐵絲保護(hù)籠罩住SD大鼠，以避免繼續(xù)身體接觸。時(shí)間滿1小時(shí)后將SD大鼠放回原來的籠中。每周進(jìn)行社會(huì)挫敗刺激三次，每次間隔一天。慢性不可預(yù)見性溫和刺激：予以實(shí)驗(yàn)組SD大鼠兩種溫和刺激，包括束縛4小時(shí)、水剝奪24小時(shí)、食物剝奪24小時(shí)、擁擠24小時(shí)、濕籠24小時(shí)及斜籠24小時(shí)。每周進(jìn)行慢性不可預(yù)見性溫和刺激三次，每次間隔一天，每種刺激每周只進(jìn)行一次。同時(shí)在每周的最后一天進(jìn)行糖水偏好測(cè)試，并稱量和記錄SD大鼠體重。具體日程安排見表1。行為學(xué)評(píng)價(jià)方法激惹實(shí)驗(yàn)：依次對(duì)每只SD大鼠進(jìn)行以下四種刺激：朝大鼠背上吹氣，用玻棒輕觸大鼠胡須，用玻棒輕觸大鼠背部，用手輕輕固定大鼠，分別評(píng)定大鼠對(duì)4種刺激的反應(yīng)并打分并計(jì)算總分。具體方法見表2。激惹實(shí)驗(yàn)總分反映大鼠的激惹性行為，該值越大，說明激惹性行為越強(qiáng)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：記錄SD大鼠在曠場(chǎng)(100cm*100cm)中5分鐘的運(yùn)動(dòng)總距離，站立次數(shù)和中心區(qū)域(曠場(chǎng)內(nèi)25％區(qū)域)運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比。其中，運(yùn)動(dòng)總距離反映大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，該值越大，說明運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)；中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比反映大鼠的焦慮行為，該值越大，說明焦慮行為越弱；站立次數(shù)反映小鼠的焦慮行為，該值越大，說明焦慮行為越弱。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于水深40cm的透明玻璃桶(15cm*50cm)中適應(yīng)30秒，繼續(xù)記錄并分析大鼠后5min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。強(qiáng)迫游泳的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間反映大鼠的抑郁行為，該值越大，說明抑郁行為程度越重。居住者-入侵者實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前所有實(shí)驗(yàn)組SD大鼠均單籠飼養(yǎng)24小時(shí)，然后在其飼養(yǎng)籠中放置一只未進(jìn)行刺激的體型較小的雄性SD大鼠(8周齡，體重約200g)，采用攝像機(jī)分別記錄每對(duì)大鼠的行為10分鐘。由兩位實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立記錄老鼠攻擊行為持續(xù)時(shí)間和攻擊潛伏時(shí)間。其中，攻擊行為持續(xù)時(shí)間反映大鼠的攻擊能力，該值越大，說明攻擊能力越強(qiáng)；攻擊潛伏時(shí)間同樣反映大鼠的攻擊能力，該值越大，說明攻擊能力越弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將40只LH組大鼠根據(jù)攻擊能力強(qiáng)弱，分為攻擊能力強(qiáng)的逃避失敗+刺激組+具有攻擊特征組(LH-Agg組)和攻擊能力弱的逃避失敗+刺激組+具有攻擊特征組(LH-Non組)各20只。行為學(xué)數(shù)據(jù)激惹測(cè)試總分分組激惹測(cè)試總分各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠2.50±0.47LH-Aggvs.LH-Non0.261LH-Non組大鼠1.60±0.28LH-Aggvs.NLH0.853NLH組大鼠1.83±0.23LH-Aggvs.CON0.029CON組大鼠1.21±0.21LH-Nonvs.NLH1.000LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON0.986曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離分組運(yùn)動(dòng)總距離(m)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠2607.01±184.40LH-Aggvs.LH-Non0.434LH-Non組大鼠2109.36±162.00LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠2795.14±201.54LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠2305.91±224.77LH-Nonvs.NLH0.085LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON0.485曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中央活動(dòng)時(shí)間比例分組中央活動(dòng)時(shí)間(％)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠2.34±0.72LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠1.87±0.60LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠3.07±0.85LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠3.48±1.47LH-Nonvs.NLH1.000LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON1.000曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)站立次數(shù)分組站立次數(shù)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠8.33±1.13LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠6.45±0.95LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠9.06±1.36LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠6.53±1.16LH-Nonvs.NLH0.668LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON0.759強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間分組不動(dòng)時(shí)間(s)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠187.88±15.08LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠203.54±13.52LH-Aggvs.NLH0.007NLH組大鼠127.71±11.28LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠93.31±8.31LH-Nonvs.NLH0.000LH-Nonvs.CON0.000NLHvs.CON0.322居住者-入侵者實(shí)驗(yàn)攻擊行為持續(xù)時(shí)間分組攻擊行為持續(xù)時(shí)間(s)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠123.13±11.23LH-Aggvs.LH-Non0.000LH-Non組大鼠40.55±6.09LH-Aggvs.NLH0.000NLH組大鼠61.64±13.28LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠38.46±9.38LH-Nonvs.NLH0.860LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON0.676居住者-入侵者實(shí)驗(yàn)攻擊潛伏時(shí)間分組攻擊潛伏時(shí)間(s)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠101.06±8.68LH-Aggvs.LH-Non0.003LH-Non組大鼠269.90±30.99LH-Aggvs.NLH0.011NLH組大鼠254.67±35.04LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠329.53±44.12LH-Nonvs.NLH1.000LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON0.679糖水偏好測(cè)試(基線)分組糖水偏好度各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠0.67±0.04LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠0.67±0.03LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠0.71±0.03LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠0.67±0.03LH-Nonvs.NLH1.000LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON1.000糖水偏好測(cè)試(第一周)分組糖水偏好度各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠0.65±0.05LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠0.68±0.04LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠0.70±0.03LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠0.65±0.03LH-Nonvs.NLH1.000LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON1.000糖水偏好測(cè)試(第二周)分組糖水偏好度各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠0.56±0.05LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠0.57±0.04LH-Aggvs.NLH0.059NLH組大鼠0.70±0.03LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠0.82±0.02LH-Nonvs.NLH0.075LH-Nonvs.CON0.000NLHvs.CON0.111糖水偏好測(cè)試(第三周)分組糖水偏好度各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠0.62±0.05LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠0.59±0.04LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠0.66±0.04LH-Aggvs.CON0.054CON組大鼠0.77±0.03LH-Nonvs.NLH1.000LH-Nonvs.CON0.008NLHvs.CON0.383糖水偏好測(cè)試(第四周)分組糖水偏好度(％)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠0.52±0.05LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠0.56±0.03LH-Aggvs.NLH0.023NLH組大鼠0.69±0.03LH-Aggvs.CON0.860CON組大鼠0.61±0.03LH-Nonvs.NLH0.129LH-Nonvs.CON1.000NLHvs.CON0.764體重(基線)分組體重(g)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠303.97±5.98LH-Aggvs.LH-Non0.647LH-Non組大鼠291.09±5.10LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠308.92±5.31LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠310.27±6.07LH-Nonvs.NLH0.163LH-Nonvs.CON0.098NLHvs.CON1.000體重(第一周)分組體重(g)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠289.56±5.27LH-Aggvs.LH-Non0.669LH-Non組大鼠276.46±4.70LH-Aggvs.NLH0.241NLH組大鼠306.99±6.37LH-Aggvs.CON1.000CON組大鼠338.45±6.66LH-Nonvs.NLH0.002LH-Nonvs.CON0.000NLHvs.CON0.002體重(第二周)分組體重(g)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠299.24±5.86LH-Aggvs.LH-Non0.708LH-Non組大鼠285.67±4.62LH-Aggvs.NLH0.511NLH組大鼠314.62±6.17LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠372.79±7.51LH-Nonvs.NLH0.007LH-Nonvs.CON0.000NLHvs.CON0.000體重(第三周)分組體重(g)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠310.86±5.16LH-Aggvs.LH-Non1.000LH-Non組大鼠298.59±5.94LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠318.83±8.07LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠378.43±7.27LH-Nonvs.NLH0.209LH-Nonvs.CON0.000NLHvs.CON0.000體重(第四周)分組體重(g)各組兩兩比較P值LH-Agg組大鼠322.76±6.06LH-Aggvs.LH-Non0.400LH-Non組大鼠305.33±3.97LH-Aggvs.NLH1.000NLH組大鼠326.08±8.27LH-Aggvs.CON0.000CON組大鼠392.59±7.79LH-Nonvs.NLH0.179LH-Nonvs.CON0.000NLHvs.CON0.000注：行為學(xué)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。結(jié)合以上數(shù)據(jù)和圖2可以得到以下結(jié)果：與對(duì)照組(CON)、逃避失敗+刺激+不具攻擊特征組(LH-Non)、逃避成功+刺激組(NLH)SD大鼠相比，逃避失敗+刺激+具有攻擊特征組(LH-Agg)大鼠攻擊潛伏時(shí)間明顯縮短(圖2中A)、攻擊總時(shí)間明顯延長(圖2中B)，表明LH-Agg組具有明顯攻擊特征；與對(duì)照組(CON)大鼠相比，逃避失敗+刺激+具有攻擊特征組(LH-Agg)SD大鼠激惹總分較高，提示LH-Agg組具有明顯激惹特征(圖2中C)；LH-Agg、LH-Non組與NLH、CON組相比，靜止時(shí)間明顯延長，表明LH-Agg、LH-Non組更具有抑郁傾向(圖2中D)；第二周、第三周糖水偏好度結(jié)果顯示，LH-Agg組、LH-Non組糖水偏好度明顯低于對(duì)照組，提示LH-Agg組、LH-Non組具有明顯抑郁特征，而NLH組與CON組之間，糖水偏好度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示NLH組抑郁特征不明顯(圖2中E)；第二周到第四周LH-Agg組、LH-Non組、NLH組體重均比CON組低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但LH-Non組與NLH組體重相比，在第一、二周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而第三、四周無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2中F)。綜上所述，行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)4周應(yīng)激后大鼠模型表現(xiàn)出典型的自殺相關(guān)行為，具有典型的自殺樣特性，即侵犯、沖動(dòng)、易激惹和絕望，同時(shí)大鼠模型表現(xiàn)出明顯抑郁特征。該模型的成功構(gòu)建為研究自殺相關(guān)行為的機(jī)制研究提供了新的研究載體。當(dāng)前第1頁1 2 3