本發(fā)明涉及木本植物無(wú)性繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及油樟無(wú)性繁殖的方法。
背景技術(shù)：
油樟系樟科樟屬的珍貴樹種，且油樟可用于提取樟油，具有廣闊的市場(chǎng)前景?，F(xiàn)今油樟的繁殖方法大多采用種子繁殖、扦插或壓條繁殖。但是由于油樟種子含大量的油脂，容易喪失發(fā)芽能力，導(dǎo)致種子繁殖的成功率很低，同時(shí)如果采用實(shí)生苗造林，由于油樟子代產(chǎn)生性狀分離，實(shí)生苗性狀良莠不齊，從而導(dǎo)致油樟油的產(chǎn)量和質(zhì)量都不高，影響造林后的經(jīng)濟(jì)效益。而采用扦插或壓條的方法進(jìn)行繁殖時(shí)，由于油樟是難生根植物，成功率也不高，而且采用扦插或壓條繁殖的油樟苗生長(zhǎng)緩慢、樹形差且樟油產(chǎn)量較低。并且油樟優(yōu)樹的枝條數(shù)量有限，從而影響了扦插苗的產(chǎn)量，只有通過先生產(chǎn)出組培苗然后再用組培苗建立采穗圃，才可以進(jìn)行大規(guī)模的扦插苗生產(chǎn)。因此油樟的繁殖一直是油樟大規(guī)模種植的急需解決的問題。
現(xiàn)今，雖然很多植物都采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖，但是油樟采用組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖成功的還未見報(bào)告，油樟組織培養(yǎng)難以成功的原因主要為：
1.油樟枝葉含有的桉葉油素、香穗烯、樟腦、松香醇等油樟油含量是香樟枝葉含油率的1～2倍，導(dǎo)致其外植體在組培過程中極易褐化而死亡，從而造成組培失敗的原因之一；
2.沒有合適的油樟組培培養(yǎng)基，常規(guī)的MS、MT、White等培養(yǎng)基真對(duì)油樟誘導(dǎo)成功率較低，尤其是MS培養(yǎng)基并不適合啟動(dòng)培養(yǎng)；
3.樟類植物在組培過程中除了要有合適的培養(yǎng)基外，對(duì)光照強(qiáng)度和溫度的要求極為嚴(yán)格，過高或過低都會(huì)造成繼代材料生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)嚴(yán)重的還會(huì)褐變死亡；
4.由于油樟是難生根植物，所以誘導(dǎo)油樟芽苗生根也存在一定的難度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提出了一種油樟組織培養(yǎng)的方法，可以有效實(shí)現(xiàn)油樟無(wú)性繁殖。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為，一種油樟組織培養(yǎng)的方法，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗四個(gè)步驟，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟所使用的啟動(dòng)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)步驟所使用的繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)步驟所使用的生根培養(yǎng)基中均含有改良MS培養(yǎng)基；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3濃度為1600mg/L、NH4NO3濃度為720mg/L，其余物質(zhì)不變；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)中加入泛酸鈣1.2mg/L，并更改鹽酸吡哆醇濃度為2.0mg/L、鹽酸硫胺素濃度為3mg/L、煙酸濃度為10mg/L，其余物質(zhì)不變。
進(jìn)一步，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)步驟進(jìn)行時(shí)，溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h，培養(yǎng)周期為30d～40d。
所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基的pH值均為5.8～6.0。
進(jìn)一步，所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黃素3mg/L+抗壞血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。
進(jìn)一步，所述的繼代培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黃素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗壞血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的繼代培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。
進(jìn)一步，所述的生根培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的生根培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。
作為優(yōu)選，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟為將表面滅菌處理后的油樟外植體，用手術(shù)刀和鑷子將其切割成長(zhǎng)0.8～1.2cm的莖段，每個(gè)莖段帶一個(gè)腋芽，斜插接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室的溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h，培養(yǎng)時(shí)間為30d～40d。
作為優(yōu)選，所述的的外植體為健康油樟的基部萌芽條上選取的當(dāng)年生幼嫩枝條。
作為優(yōu)選，所述的繼代培養(yǎng)步驟為將繼代苗切割成芽叢或帶腋芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，每瓶接種芽叢或莖段不少于5個(gè)，每個(gè)芽叢芽數(shù)不少3個(gè)，每隔30d～40d將繼代苗轉(zhuǎn)接至新繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)代數(shù)控制在30代內(nèi)，培養(yǎng)室的溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h。
作為優(yōu)選，所述的生根培養(yǎng)步驟為選擇增殖培養(yǎng)30d后，高3.0cm以上，葉片正常展開的芽苗，通過無(wú)菌操作切取2.5cm左右的頂芽，接種到生根培養(yǎng)基上；每瓶接種單芽15個(gè)，培養(yǎng)室的溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h，培養(yǎng)時(shí)間為15d～25d。
作為優(yōu)選，所述的煉苗步驟為當(dāng)組培苗高度達(dá)到3.0cm以上,根長(zhǎng)達(dá)1.0～1.5cm時(shí),將組培苗從培養(yǎng)室移至煉苗溫室或大棚進(jìn)行煉苗，時(shí)間為10～15d，采用自然散射光，光照強(qiáng)度控制在5000～10000Lx，環(huán)境溫度為20～32℃，避免強(qiáng)光直射和高溫灼傷組培苗。
煉苗結(jié)束后即可進(jìn)行移栽。
移栽過程指將煉苗所得生根苗長(zhǎng)至3~5cm左右即可進(jìn)行移栽至營(yíng)養(yǎng)袋中。 移栽初期宜保持環(huán)境濕度80%~95%（如可覆蓋薄膜進(jìn)行保溫保濕）；移栽初期須控制光照強(qiáng)度小于5000Lx，并逐漸加強(qiáng)光照，每天打開薄膜通風(fēng)5min，以防病害，保持相對(duì)濕度90％以上，15d（冬季可適當(dāng)延長(zhǎng)至25d）后可逐漸揭開薄膜。同時(shí)注意遮蔭，最終到全自然光照強(qiáng)度下培育苗木至出圃；移栽21d后，每7d噴施或淋施0.1%的復(fù)合肥溶液1次；移栽7d后,一個(gè)月內(nèi)每7d輪流噴施多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液，一個(gè)月后每30d輪流噴施。
本發(fā)明針對(duì)油樟組織培養(yǎng)過程中易褐化、難生根等情況，設(shè)定了一種改良MS培養(yǎng)基，可以有效促進(jìn)油樟組織培養(yǎng)，符合油樟組織培養(yǎng)所需，且改良后的MS培養(yǎng)基克服了其本身不適合作為啟動(dòng)培養(yǎng)基的缺陷。本發(fā)明還針對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期所需添加不同的物質(zhì)，且各階段培養(yǎng)基pH值設(shè)定為5.8～6.0，可以有效提升有樟組織培養(yǎng)各步驟成功率；同時(shí)針對(duì)油樟培養(yǎng)設(shè)定了嚴(yán)格的溫度與光照范圍，可以有效提升油樟組織培養(yǎng)成功率。
L-半胱氨酸和抗壞血酸是抗氧化物，主要作用是防止植物組織在繼代培養(yǎng)過程中褐變死亡。植物組織在切割時(shí)會(huì)溢泌一些酚類物質(zhì)，滲出細(xì)胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)材料生長(zhǎng)停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。在木本尤其是熱帶木本及少數(shù)草本植物中較為嚴(yán)重。常用的抗酚類氧化劑有半胱氨酸和抗壞血酸。 褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對(duì)許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)與分化，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡。
生物素和核黃素是維生素，在培養(yǎng)基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育，在各種代謝過程中起著催化劑的作用。當(dāng)植物細(xì)胞和組織離體生長(zhǎng)時(shí)，也能合成一些必需的維生素，但不能達(dá)到植物生長(zhǎng)的最佳需要量。因此，必須在培養(yǎng)基中添加必需的維生素和氨基酸，使植物組織健壯生長(zhǎng)。比較常用的維生素是鹽酸硫胺素（VB1）、鹽酸吡哆醇（VB6）、煙酸（VB3）、肌醇等，鹽酸硫胺素是所有細(xì)胞和組織必需的基本維生素。煙酸和鹽酸吡哆醇常添加到培養(yǎng)基中，但對(duì)許多植物的細(xì)胞可能不是必需的。其他維生素如生物素（VH）、葉酸、抗壞血酸（VC）、泛酸鈣、維生素E（生育酚）、核黃素和對(duì)氨基苯甲酸也常被使用。氨基酸類物質(zhì)不僅為培養(yǎng)物提供有機(jī)氮源，同時(shí)也對(duì)外植體的生長(zhǎng)以及不定芽、不定胚的分化起促進(jìn)作用。
活性炭（AC）是一種吸附性較強(qiáng)的無(wú)機(jī)吸附劑，培養(yǎng)基中添加活性炭的主要作用是利用其吸附能力，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)等，防止酚類物質(zhì)引起組織褐變死亡，從而有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。在使用過程中應(yīng)注意，盡量用最低濃度的活性炭來對(duì)抗褐變的產(chǎn)生，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菦]有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。其次是活性炭使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根；活性炭還可降低玻璃化苗的產(chǎn)生頻率，對(duì)防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。
以健康油樟的基部萌芽條上選取的當(dāng)年生幼嫩枝條為外植體，活性強(qiáng)、生長(zhǎng)速率快，從而保障了培養(yǎng)的油樟幼苗的含油量與生長(zhǎng)速度。
通過本發(fā)明所述的方法可以對(duì)優(yōu)選優(yōu)良油樟單株進(jìn)行組培快繁，在短期內(nèi)可生產(chǎn)出大量油樟油含量一致，規(guī)格統(tǒng)一、種性穩(wěn)定的油樟苗木，從而解決由于采用普通種子苗（實(shí)生苗）造林而產(chǎn)生的油樟油產(chǎn)量過低的問題；在香樟的組培苗和扦插苗及實(shí)生苗的生長(zhǎng)量對(duì)比試驗(yàn)中，無(wú)論就組培苗的生長(zhǎng)量和樹型都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于普通實(shí)生苗和扦插苗，保障油樟造林的速度，且在造林過程中不影響原油樟的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施方式
下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1：一種油樟組織培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：
1.誘導(dǎo)培養(yǎng)：將表面滅菌處理后的油樟外植體，用手術(shù)刀和鑷子將其切割成長(zhǎng)0.8～1.2cm的莖段，每個(gè)莖段帶一個(gè)腋芽，斜插接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室的溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h，培養(yǎng)時(shí)間為30d～40d；所述的的外植體為健康油樟的基部萌芽條上選取的當(dāng)年生幼嫩枝條；
2.繼代培養(yǎng)：將繼代苗切割成芽叢或帶腋芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，每瓶接種芽叢或莖段不少于5個(gè)，每個(gè)芽叢芽數(shù)不少3個(gè)，每隔30d～40d將繼代苗轉(zhuǎn)接至新繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)代數(shù)控制在30代內(nèi)，培養(yǎng)室的溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h；
3.生根培養(yǎng)：選擇增殖培養(yǎng)15d～25d后，高3.0cm以上，葉片正常展開的芽苗，通過無(wú)菌操作切取2.5cm左右的頂芽，接種到生根培養(yǎng)基上；每瓶接種單芽15個(gè)，培養(yǎng)室的溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h；
4.煉苗：當(dāng)組培苗高度達(dá)到3.0cm以上,根長(zhǎng)達(dá)1.0～1.5cm時(shí),將組培苗從培養(yǎng)室移至煉苗溫室或大棚進(jìn)行煉苗，時(shí)間為10～15d，采用自然散射光，光照強(qiáng)度應(yīng)控控制在5000～10000Lx，環(huán)境溫度為20～32℃，避免強(qiáng)光直射和高溫灼傷組培苗，煉苗結(jié)束之后即可對(duì)幼苗進(jìn)行移植；
5.移栽：煉苗所得生根苗長(zhǎng)至3~5cm左右即可進(jìn)行移栽至營(yíng)養(yǎng)袋中。 移栽初期宜保持環(huán)境濕度80%~95%（如可覆蓋薄膜進(jìn)行保溫保濕）；移栽初期須控制光照強(qiáng)度小于5000Lx，并逐漸加強(qiáng)光照，每天打開薄膜通風(fēng)5min，以防病害，保持相對(duì)濕度90％以上，15d（冬季可適當(dāng)延長(zhǎng)至25d）后可逐漸揭開薄膜。同時(shí)注意遮蔭，最終到全自然光照強(qiáng)度下培育苗木至出圃；移栽21d后，每7d噴施或淋施0.1%的復(fù)合肥溶液1次；移栽7d后,一個(gè)月內(nèi)每7d輪流噴施多菌靈1000倍液或百菌清1000倍液，一個(gè)月后每30d輪流噴施。
所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黃素3mg/L+抗壞血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉膠5.4g/L；所述的繼代培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黃素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗壞血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉膠5.4g/L；所述的生根培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基的pH值均為5.8～6.0。
所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3濃度為1600mg/L、NH4NO3濃度為720mg/L，其余物質(zhì)不變；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)中加入泛酸鈣1.2mg/L，并更改鹽酸吡哆醇濃度為2.0mg/L、鹽酸硫胺素濃度為3mg/L、煙酸濃度為10mg/L，其余物質(zhì)不變。
采用以上方法進(jìn)行油樟組織培養(yǎng)成功率不低于95%。
實(shí)施例2：一種油樟組織培養(yǎng)的方法，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗四個(gè)步驟，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟所使用的啟動(dòng)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)步驟所使用的繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)步驟所使用的生根培養(yǎng)基中均含有改良MS培養(yǎng)基；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3濃度為1600mg/L、NH4NO3濃度為720mg/L，其余物質(zhì)不變；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)中加入泛酸鈣1.2mg/L，并更改鹽酸吡哆醇濃度為2.0mg/L、鹽酸硫胺素濃度為3mg/L、煙酸濃度為10mg/L，其余物質(zhì)不變，在煉苗結(jié)束后，即可進(jìn)行移栽。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)步驟進(jìn)行時(shí)，溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h。
所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黃素3mg/L+抗壞血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。
所述的繼代培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黃素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗壞血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的繼代培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。
所述的生根培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉膠5.4g/L，所述的生根培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。
所述油樟組織培養(yǎng)方法所采用的外植體為健康油樟的基部萌芽條上選取的當(dāng)年生幼嫩枝條。
實(shí)施例3：一種油樟組織培養(yǎng)的方法，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗四個(gè)步驟，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟所使用的啟動(dòng)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)步驟所使用的繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)步驟所使用的生根培養(yǎng)基中均含有改良MS培養(yǎng)基；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3濃度為1600mg/L、NH4NO3濃度為720mg/L，其余物質(zhì)不變；所述的改良MS培養(yǎng)基在原MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)中加入泛酸鈣1.2mg/L，并更改鹽酸吡哆醇濃度為2.0mg/L、鹽酸硫胺素濃度為3mg/L、煙酸濃度為10mg/L，其余物質(zhì)不變。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)步驟進(jìn)行時(shí)，溫度控制在26℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為每天10～12h。
所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基的pH值均為5.8～6.0。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在本發(fā)明的精神和原則內(nèi)可以有各種更改和變化，這些等同的變型或替換等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。