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本發(fā)明提供了一種經(jīng)遺傳修飾的非人類動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，該動物基因組中包含編碼人源化cd3蛋白(例如人源化cd3ε、人源化cd3δ和/或人源化cd3γ)的核酸序列。因此，本發(fā)明提供了表達人源化cd3復合物的經(jīng)遺傳修飾的非人類動物。本文還提供了一種臨床前試驗模型，用于cd3治療劑，例如cd3抗體，例如cd3雙特異性抗體。

背景技術(shù)：

除了t細胞受體亞基(例如高度可變的tcrα和tcrβ)，t細胞表面的t細胞受體復合物還包含不變的cd3ε、cd3δ和cd3γ鏈，這些鏈形成由cd3εδ和cd3εγ組成的異源二聚體。ζ鏈也與tcr/cd3復合物相關(guān)，其以二硫鍵連接的同源二聚體形式存在。

cd3鏈在t細胞受體組裝、轉(zhuǎn)運到細胞表面、表面受體內(nèi)吞作用、t細胞發(fā)育和t細胞信號轉(zhuǎn)導方面具有重要作用。例如，對多種cd3亞基缺陷的研究證明，cd3鏈對于雙陰性(cd4-cd8-，或dn)到雙陽性(cd4+cd8+，或dp)到單陽性(cd4+或cd8+，或sp)t細胞轉(zhuǎn)換非常重要。此外，cd3ε、cd3δ和cd3γ鏈各含有一個免疫受體酪氨酸激活基序(itam)，而ζ鏈二聚體含有6個itam。這些基序起到信號轉(zhuǎn)導模塊的作用，并在tcr參與下被相關(guān)激酶磷酸化。

抗cd3的抗體被證明能聚集t細胞上的cd3，從而通過與裝載肽的mhc分子與tcr的結(jié)合相似的方式導致t細胞激活。因此，建議將抗cd3抗體用作旨在激活t細胞的候選治療劑。此外，建議將能結(jié)合cd3和靶抗原的雙特異性抗體用作治療用途，涉及將t細胞免疫應答靶向到表達該靶抗原的組織和細胞。

特別需要便利的動物模型，用于單特異性cd3和雙特異性cd3治療劑抗體的臨床前試驗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文提供了經(jīng)遺傳修飾的非人類動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，該動物包含經(jīng)遺傳修飾、編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性非人類cd3基因座，其中該人cd3蛋白是cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，或其任意組合。在一個實施例中，內(nèi)源性非人類cd3基因座經(jīng)遺傳修飾，編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，內(nèi)源性非人類cd3基因座經(jīng)遺傳修飾，以不表達相應非人類蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，內(nèi)源性非人類cd3基因座還編碼相應內(nèi)源性非人類動物cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中該動物在其t細胞表面上表達嵌合cd3蛋白，該t細胞包括人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源性非人類動物cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，非人類動物中編碼人cd3的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列被有效連接到編碼相應非人類動物cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個具體實施例中，非人類動物包含：(a)在內(nèi)源性cd3ε基因座處編碼人cd3ε細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該序列與編碼內(nèi)源性非人類動物cd3ε跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接，(b)在內(nèi)源性cd3δ基因座處編碼人cd3δ細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該序列與編碼內(nèi)源性非人類動物cd3δ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接，以及(c)在內(nèi)源性cd3γ基因座處編碼人cd3γ細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該序列與編碼內(nèi)源性非人類動物cd3γ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接。其中非人類動物在其t細胞表面表達嵌合cd3ε、cd3δ和cd3γ。在一些實施例中，非人類動物中人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域包括選自seqidno:33、seqidno:34和seqidno:35的序列。在一些實施例中，動物包括人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域，所述細胞外結(jié)構(gòu)域包括選自seqidno:33、seqidno:34和seqidno:35的序列。

在一些實施例中，本文所述的經(jīng)遺傳修飾的非人類動物包括與cd3啟動子有效連接的編碼人cd3蛋白細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。因此，在一些實施例中，本文所述的非人類動物包括編碼以下各項的核酸序列：與cd3啟動子有效連接的人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域，與cd3啟動子有效連接的人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域，以及與cd3啟動子有效連接的人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，cd3啟動子為非人動物cd3啟動子。在一個實施例中，cd3啟動子為人cd3啟動子。在一個實施例中，cd3啟動子為內(nèi)源性非人cd3啟動子。

在一個具體實施例中，非人動物為哺乳動物。在一個實施例中，動物為嚙齒動物。在一個實施例中，動物為大鼠或小鼠。在一個實施例中，動物為小鼠。因此，在一個實施例中，本文提供了一種經(jīng)遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠包含：(a)在內(nèi)源性小鼠cd3ε基因座處編碼人cd3ε細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該序列與編碼內(nèi)源性小鼠cd3ε跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接，(b)在內(nèi)源性小鼠cd3δ基因座處編碼人cd3δ細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該序列與編碼內(nèi)源性小鼠cd3δ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接，以及(c)在內(nèi)源性小鼠cd3γ基因座處編碼人cd3γ細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該序列與編碼內(nèi)源性小鼠cd3γ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接，并且所述小鼠在其t細胞表面表達人源化cd3ε、cd3δ和cd3γ。在一個實施例中，小鼠的人源化cd3ε蛋白的氨基酸序列如eqidno:24中所述，人源化cd3δ蛋白的氨基酸序列如seqidno:25中所述，人源化cd3γ蛋白的氨基酸序列如seqidno:26中所述。在一個實施例中，本文提供的經(jīng)遺傳修飾的小鼠包括與小鼠cd3啟動子有效連接的編碼人cd3細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個實施例中，啟動子為內(nèi)源性小鼠cd3啟動子。在另一個實施例中，本文提供的經(jīng)遺傳修飾的小鼠包括與人cd3啟動子有效連接的編碼人cd3細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一個實施例中，所述小鼠與未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠相比，在胸腺中呈現(xiàn)相似的cd4+與cd8+細胞比率。在一個實施例中，所述小鼠胸腺中cd4+與cd8+細胞的比在未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠的cd4+與cd8+細胞的比的30％、25％、20％、15％、12％、10％、5％或2％以內(nèi)。在一個實施例中，所述小鼠與未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠相比，在脾、淋巴結(jié)和外周血中呈現(xiàn)相似的t細胞和b細胞百分比。在一個實施例中，所述小鼠與未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠相比，呈現(xiàn)相似數(shù)量的循環(huán)白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞。

因此，在一個方面，本文提供了一種經(jīng)遺傳修飾的小鼠，所述小鼠在內(nèi)源性小鼠cd3基因座處包括編碼人cd3蛋白細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，其中所述人cd3蛋白選自cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，及其組合。在一個實施例中，小鼠包含人cd3ε、cd3δ和cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域。在所述小鼠的一個實施例中，所述人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:33中所述，所述人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:34中所述，所述人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:35中所述。在一個實施例中，小鼠表達人源化cd3ε、人源化cd3δ和人源化cd3γ。在所述小鼠的一個實施例中，人源化cd3ε如seqidno:24中所述，人源化cd3δ如seqidno:25中所述，人源化cd3γ如seqidno:26中所述。在一個實施例中，小鼠還包括小鼠cd3ε、cd3δ和cd3γ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，小鼠還包括內(nèi)源性小鼠cd3ε、cd3δ和cd3γ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

在另一個方面，本文提供了一種制備表達人源化cd3蛋白的經(jīng)遺傳修飾的非人類動物的方法，包括將編碼人cd3蛋白細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列引入非人類動物細胞的基因組中，其中所述人cd3蛋白選自cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，及其組合；以及由所述細胞繁殖所述經(jīng)遺傳修飾的非人類動物。在所述方法的一個實施例中，動物不包含相應非人類蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。在所述方法的一個實施例中，動物在內(nèi)源性非人類cd3基因座處包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在所述方法的一個實施例中，人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:33中所述，人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:34中所述，人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:35中所述。在所述方法的一個實施例中，動物不包含相應非人類蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個具體實施例中，該方法包括在內(nèi)源性cd3基因座處用人cd3蛋白的相應細胞外結(jié)構(gòu)域替換非人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域。在所述方法的一個實施例中，動物還包含編碼相應內(nèi)源性非人類動物cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在所述方法的一個實施例中，非人類動物是小鼠，替換是在內(nèi)源性小鼠cd3基因座處。在其中所述動物是小鼠的該方法的一個實施例中，小鼠表達選自如seqidno:24中所述的人源化cd3ε、如seqidno:25中所述的人源化cd3δ、如seqidno:26中所述的人源化cd3γ，及其組合的人源化cd3蛋白。在所述方法的一個實施例中，替換在單個es細胞中進行，所述單個es細胞被引入小鼠胚胎以產(chǎn)生小鼠。

在又一個方面，本文提供了一種非人類動物模型，例如用于測試基于cd3的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的小鼠模型，其中抗原結(jié)合蛋白能夠同時結(jié)合cd3和目標抗原，所述小鼠模型包含經(jīng)遺傳修飾以編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的小鼠，其中人cd3蛋白是cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，或其任意組合(例如兩種或更多種cd3蛋白的組合)；并且所述小鼠模型包含表達或包含非小鼠目標抗原的細胞。所述模型中的非人類動物可以是上文或本文其他地方所述的任何非人類動物。在所述小鼠模型的一個實施例中，人源化cd3蛋白的核酸序列位于內(nèi)源性cd3基因座處。在所述小鼠模型的一個實施例中，抗原結(jié)合蛋白已經(jīng)被引入所述小鼠。在所述小鼠模型的一個實施例中，小鼠表達人cd3ε、cd3δ和cd3γ細胞外結(jié)構(gòu)域。在所述小鼠模型的一個實施例中，小鼠還表達小鼠cd3ε、cd3δ和cd3γ跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

在所述小鼠模型的一個實施例中，小鼠包含表達目標抗原的腫瘤的異種移植。在所述小鼠模型的一個實施例中，表達或包含目標抗原的細胞是腫瘤細胞。在所述小鼠模型的一個實施例中，所選擇的雙特異性抗原結(jié)合蛋白同時結(jié)合到人源化cd3蛋白和目標抗原。在所述小鼠模型的一個實施例中，目標抗原是人抗原。在所述小鼠模型的一個實施例中，抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合猴cd3蛋白。在所述小鼠模型的一個實施例中，目標抗原是腫瘤相關(guān)抗原。在此類實施例中，腫瘤相關(guān)抗原可選自alk、bage蛋白、birc5(存活素)、birc7、ca9、calr、ccr5、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd27、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd52、cd56、cd79、cdk4、ceacam3、ceacam5、clec12a、egfr、egfr變體iii、erbb2(her2)、erbb3、erbb4、epcam、epha2、epha3、fcrl5、flt3、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、gpnmb、gm3、gpr112、il3ra、kit、kras、lgr5、源自ebv的lmp2、l1cam、mage蛋白、mlana、msln、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ankrd30a、ny-eso1(ctag1b)、ox40、pap、pax3、pax5、plac1、prlr、pmel、prame、psma(folh1)、rage蛋白、ret、rgs5、ror1、sart1、sart3、slamf7、slc39a6(liv1)、steap1、steap2、tert、tmprss2、thompson-nouvelle抗原、tnfrsf17、tyr、upk3a、vtcn1、wt1。

在另一個實施例中，目標抗原是傳染性疾病相關(guān)抗原。在此類實施例中，小鼠可用傳染性試劑感染。在一個此類實施例中，傳染性疾病相關(guān)抗原可以是病毒抗原，所述病毒抗原選自hiv、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒(例如hsv-1、hsv-2、cmv、hav-6、vzv、艾普斯登-巴爾病毒)、腺病毒、流感病毒、黃熱病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩基病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流腮病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、htlv、登革病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、jc病毒、埃博拉病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒抗原。在另一個此類實施例中，傳染性疾病相關(guān)抗原可以是細菌抗原，所述細菌抗原選自衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、淋菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫、螺旋體和萊姆病細菌抗原。

在所述小鼠模型的一個實施例中，基于cd3的抗原結(jié)合蛋白是抗體。在一個實施例中，基于cd3的抗原結(jié)合蛋白是人或人源化抗原結(jié)合蛋白。此類小鼠模型可允許測試抗原結(jié)合蛋白在小鼠中的功效和/或毒性。

本文還提供了一種篩選靶向目標抗原的候選藥物的方法，包括(a)將目標抗原引入經(jīng)遺傳修飾的小鼠，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠包含經(jīng)遺傳修飾以編碼人cd3蛋白細胞外結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性非人類cd3基因座，其中所述人cd3蛋白是如上文或本文其他地方所限定的cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，或其任意組合；(b)使所述小鼠與目標候選藥物接觸，其中所述候選藥物針對人cd3和目標抗原；以及(c)確定所述候選藥物是否可有效防止、減少或消除以存在或表達所述目標抗原為特征的細胞。在所述方法的一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠在內(nèi)源性小鼠cd3基因座處包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在所述方法的一個實施例中，小鼠不包含相應小鼠蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。在所述方法的一個實施例中，小鼠包含編碼相應內(nèi)源性小鼠cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在所述方法的一個實施例中，編碼人cd3的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列被有效連接到編碼相應內(nèi)源性小鼠cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在所述方法的一個實施例中，人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:33中所述，人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:34中所述，人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域如seqidno:35中所述。因此，在所述方法的一個具體實施例中，小鼠表達包含seqidno:24中所述的氨基酸序列的人源化cd3ε蛋白、包含seqidno:25中所述的氨基酸序列的人源化cd3δ蛋白，以及包含seqidno:26中所述的氨基酸序列的人源化cd3γ蛋白。

在本文所述的篩選候選藥物的方法的一個具體實施例中，將目標抗原引入本文所述的小鼠這一步驟包括在小鼠中表達所述目標抗原。在一個實施例中，在小鼠中表達所述目標抗原這一步驟包括對小鼠進行遺傳修飾以表達所述目標抗原。在一個實施例中，引入所述目標抗原這一步驟包括用所述目標抗原感染小鼠。在所述方法的一個實施例中，引入這一步驟包括將表達所述目標抗原的細胞引入所述小鼠。在所述方法的各種實施例中，細胞可以是腫瘤細胞、細菌細胞或用病毒感染的細胞。因此，在所述方法的一些實施例中，小鼠包含感染，所述感染是病毒感染或細菌感染。因此，目標抗原可以是傳染性疾病相關(guān)抗原。在一個實施例中，目標抗原可以是病毒抗原，所述病毒抗原選自hiv、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒(例如hsv-1、hsv-2、cmv、hav-6、vzv、艾普斯登-巴爾病毒)、腺病毒、流感病毒、黃熱病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩基病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流腮病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、htlv、登革病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、jc病毒、埃博拉病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒抗原。在另一個實施例中，目標抗原可以是傳染性疾病相關(guān)抗原，所述傳染性疾病相關(guān)抗原是選自以下各項的細菌抗原：衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、淋菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫、螺旋體和萊姆病細菌抗原。

在篩選候選藥物的方法的另一個實施例中，目標抗原是腫瘤相關(guān)抗原。在所述方法的一個實施例中，腫瘤相關(guān)抗原選自alk、bage蛋白、birc5(存活素)、birc7、ca9、calr、ccr5、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd27、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd52、cd56、cd79、cdk4、ceacam3、ceacam5、clec12a、egfr、egfr變體iii、erbb2(her2)、erbb3、erbb4、epcam、epha2、epha3、fcrl5、flt3、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、gpnmb、gm3、gpr112、il3ra、kit、kras、lgr5、源自ebv的lmp2、l1cam、mage蛋白、mlana、msln、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ankrd30a、ny-eso1(ctag1b)、ox40、pap、pax3、pax5、plac1、prlr、pmel、prame、psma(folh1)、rage蛋白、ret、rgs5、ror1、sart1、sart3、slamf7、slc39a6(liv1)、steap1、steap2、tert、tmprss2、thompson-nouvelle抗原、tnfrsf17、tyr、upk3a、vtcn1、wt1。

在篩選候選藥物的方法的一些實施例中，小鼠是具有免疫能力的小鼠。在本文所述方法的一些實施例中，目標抗原是人目標抗原。

在所述方法的一些實施例中，候選藥物是抗體。在一些實施例中，候選藥物是抗原結(jié)合蛋白。在一些實施例中，候選藥物是雙特異性抗體或雙特異性抗原結(jié)合蛋白。在一些實施例中，雙特異性抗原結(jié)合蛋白能夠同時結(jié)合人cd3蛋白和目標抗原。在一個實施例中，候選藥物能夠識別猴cd3蛋白。

在篩選候選藥物的方法的一些實施例中，與不靶向目標抗原的試劑相比，候選藥物能夠減少、消除或防止腫瘤生長。在此類方法的一些實施例中，確定候選藥物是否可有效防止、減少或消除以存在或表達目標抗原為特征的細胞這一步驟包括腫瘤體積測定或t細胞介導的腫瘤細胞殺傷測定。

在其他實施例中，與不靶向目標抗原的試劑相比，候選藥物能夠減少、消除或防止細菌或病毒感染。在一些此類實施例中，確定候選藥物是否可有效防止、減少或消除以存在或表達目標抗原為特征的細胞這一步驟包括測量病毒或細菌滴度。

在其他實施例中，本文提供了一種非人類動物模型，例如用于測試聯(lián)合藥物治療的安全性、功效和藥代動力學的小鼠模型，其中所述聯(lián)合治療包括結(jié)合人cd3分子的藥物，例如抗原結(jié)合蛋白。此類聯(lián)合治療的目的在于靶向特定腫瘤、感染或本文所述的其他疾病，該靶向過程可從t細胞的募集和/或活化中受益。

附圖說明

圖1示出了t細胞受體復合物的結(jié)構(gòu)。所述復合物包含兩個cd3ε亞基、一個cd3δ亞基、一個cd3γ亞基和兩個cd3ζ亞基，這些亞基在t細胞表面與tcrαβ異源二聚體形成復合物。星號表示itam基序的位置。

圖2a和圖2b是人源化cd3γδε大靶向載體的示意圖(未按比例繪制)。圖2a示出了選擇表達盒(neo)缺失前的大靶向載體，其中示出了人cd3e、cd3d和cd3g序列的敲入位置。a、b、c、d、e、f和g表示表1中所示的接合區(qū)核酸序列的位置。圖2b示出了選擇表達盒(neo)缺失后的大靶向載體，與圖2a類似，示出了人cd3e、cd3d和cd3g的位置。a、b、c、d、e、f和g是表1和表3中所示的接合區(qū)核酸序列的位置。

圖3示出了人源化cd3γδε小鼠中人源化cd3蛋白的氨基酸序列。人源cd3蛋白序列帶下劃線。

圖4示出了小鼠和人cd3e、cd3d和cd3g序列的比對結(jié)果。引入小鼠cd3基因座的人序列的5'和3'末端分別用*和**表示。

圖5a頂行是展示野生型(wt)、雜合人源化cd3γδε(het)或純合人源化cd3γδε(ho)小鼠中cd4+和cd8+胸腺細胞的正態(tài)分布的fac分析圖。圖5b頂行是示出所示動物的外周血中b細胞和t細胞的百分比和數(shù)量的數(shù)據(jù)圖。圖5b底行是示出所示動物的脾臟中t細胞和b細胞的百分比的數(shù)據(jù)圖。圖5c示出了從人源化cd3γδε小鼠脾臟中獲得的cd4+和cd8+t細胞的vβ組庫多克隆性。

圖6a至圖6b展示了用lcmv克隆13感染(圖6a)或者在先用lcmvarmstrong克隆感染之后用lcmv克隆13感染(圖6b)的野生型對照或人源化cd3γδε小鼠的脾臟中的病毒lcmv滴度。

圖7是來自野生型(wt)、雜合人源化cd3γδε(hcd3γδεhet)或純合人源化cd3γδε(hcd3γδεho)小鼠的脾細胞用兩個同樣與猴cd3交叉反應的抗人cd3抗體(ah/mfcd3-2和ah/mfcd3-1)、兩個為人cd3特異性的抗人cd3抗體(ahcd3-1和ahcd3-2)、對照抗小鼠cd3抗體(amcd3-2c11)、無關(guān)的對照人igg(對照higg)以及僅二抗對照(僅二抗)進行分選的facs分析數(shù)據(jù)。在每張圖下方的表中列出了mfi值。

圖8展示了人源化cd3γδε小鼠中對抗cd3抗體的應答。圖8a展示了用抗cd3抗體處理的小鼠血液中的瞬時t細胞和b細胞耗盡，其中包括所示的每種抗體在第1天的t細胞耗盡(左圖)，以及所測試的每種抗體在14天中的t細胞和b細胞的耗盡和恢復(中圖和右圖)。圖8b示出了用所示抗體處理2小時之后釋放的細胞因子(ifnγ、kc、tnfα、il-6和il-10)的濃度增加。

圖9展示了在野生型(wt)和人源化cd3γδε純合(hcd3γδεho)小鼠中用增加量的所示抗體處理之后脾細胞的增殖(僅以細胞的活化倍數(shù)測量)。

圖10是概述人源化cd3小鼠模型的各種性質(zhì)的表格。

圖11a展示了在植入腫瘤的同時開始處理的情況下抗cd3抗體(ab-1；識別cd3和cd20的雙特異性抗體，在兩個不同濃度下測試)對b16f10.9/cd20腫瘤的腫瘤體積的影響(預防模型)。圖11b展示了抗cd3抗體(ab-1；識別cd3和cd20的雙特異性抗體，在兩個不同濃度下測試)對已確定的b16f10.9/cd20腫瘤的腫瘤體積的影響(治療模型)。

具體實施方式

定義

本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾的非人類動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，該動物表達人源化cd3蛋白，例如人源化cd3ε、cd3δ、cd3γ和/或cd3ζ蛋白。本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾的非人類動物，該動物基因組中(例如，生殖細胞系中)包含編碼人源化cd3蛋白(例如，嵌合人/小鼠cd3蛋白)的經(jīng)遺傳修飾的cd3基因座。本發(fā)明還提供了包含上述cd3基因座的胚胎、細胞和組織，制備上述cd3基因座的方法，以及使用上述cd3基因座的方法。除非另有定義，否則本文所用的所有術(shù)語和短語包括該術(shù)語或短語在本領(lǐng)域中所具有的含義，除非在使用該術(shù)語或短語的情形中有明確說明或顯而易見的相反含義。

如本文所用，“cd3”包括在t細胞上作為多分子t細胞受體(tcr)復合物的一部分表達的抗原；該多分子tcr復合物由包括一個或多個以下受體鏈的同源二聚體和/或異源二聚體結(jié)合形成：cd3-epsilon(ε)、cd3-delta(δ)、cd3-zeta(ζ)和cd3-gamma(γ)(參見圖1)。人和小鼠的cd3-delta、cd3-zeta和cd3-gamma的序列和genbank登記號在下表4中列出。在本申請全篇中，ε或epsilon也可寫作e，δ或delta也可寫作d，ζ或zeta也可寫作z，γ或gamma也可寫作g。

如本文所用，“結(jié)合cd3的抗體”或“抗cd3抗體”包括特異性識別單個cd3亞基(例如，epsilon、delta、gamma或zeta)的抗體及其抗原結(jié)合片段，以及特異性識別兩個cd3亞基的二聚體復合物(例如，gamma/epsilon、delta/epsilon和zeta/zetacd3二聚體)的抗體及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段可結(jié)合可溶性cd3和/或細胞表面表達的cd3?？扇苄詂d3包括天然cd3蛋白以及重組cd3蛋白變體，例如缺少跨膜結(jié)構(gòu)域或者以其他方式與細胞膜無關(guān)的單體或二聚體cd3構(gòu)建體。

當用于描述保守氨基酸取代時，術(shù)語“保守”包括用側(cè)鏈r基團的化學性質(zhì)(例如電荷或疏水性)相似的另一個氨基酸殘基取代某個氨基酸殘基。保守氨基酸取代可通過修飾核苷酸序列以引入將編碼保守取代的核苷酸變化來實現(xiàn)。通常，保守氨基酸取代不會實質(zhì)性改變蛋白質(zhì)的目標功能性質(zhì)，例如cd3蛋白參與t細胞受體組裝和信號轉(zhuǎn)導的能力。側(cè)鏈的化學性質(zhì)相似的氨基酸基團的例子包括脂肪族側(cè)鏈，諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂肪族-羥基側(cè)鏈，諸如絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺側(cè)鏈，諸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族側(cè)鏈，諸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈，諸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈，諸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫側(cè)鏈，諸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基團包括，例如纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實施例中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白質(zhì)中的任何天然殘基，例如在丙氨酸掃描誘變中所用。在一些實施例中，保守取代在“gonnetetal.((1992)exhaustivematchingoftheentireproteinsequencedatabase,science256:1443-45)”(gonnet等人，1992年，“整個蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的詳盡匹配”，《科學》，第256卷，第1443-1445頁)中公開的pam250對數(shù)似然矩陣中具有正值，該文獻據(jù)此以引用方式并入本文。在一些實施例中，取代是適度的保守取代，其中所述取代在pam250對數(shù)似然矩陣中具有非負值。

因此，本發(fā)明包含經(jīng)遺傳修飾的非人類動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，該動物表達在本文所述的氨基酸序列中包含保守氨基酸取代的人源化cd3蛋白。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當理解，除了編碼本文所述的人源化cd3蛋白的核酸殘基之外，由于遺傳密碼具有簡并性，其他核酸也可編碼本發(fā)明的多肽。因此，除了基因組中包含編碼本文所述的人源化cd3蛋白的核苷酸序列的經(jīng)遺傳修飾的非人類動物之外，本文還提供了基因組中包含不同于本文所述的核苷酸序列的核苷酸序列的非人類動物，因為遺傳密碼具有簡并性。

當結(jié)合序列使用時，術(shù)語“同一性”包括由本領(lǐng)域已知的可用于測量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多種不同算法所確定的同一性。在本文所述的一些實施例中，同一性使用clustalwv.1.83(慢)比對法進行確定，該比對法采用10.0的開放空位罰分、0.1的擴展空位罰分，并使用gonnet相似矩陣(macvector公司的macvector^tm10.0.2，2008年(macvector^tm10.0.2,macvectorinc.,2008))。針對序列同一性進行比較的序列長度取決于具體序列。在各種實施例中，同一性是通過將成熟蛋白從n端到c端的序列進行比較來確定的。在各種實施例中，將人源化序列與人類序列進行比較時，使用人源化序列的人類部分(而不是非人類部分)進行比較，以便確定人類序列與人源化序列之間的同一性水平。

術(shù)語“有效連接”包括并置，其中這樣描述的組分處于允許以其預期方式發(fā)揮作用的關(guān)系。因此，編碼蛋白的核酸序列可有效連接至調(diào)控序列(例如，啟動子、增強子、沉默子序列等)以保持適當?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，本發(fā)明的人源化蛋白的各個部分可有效連接以保持該蛋白在細胞中適當?shù)恼郫B、加工、靶向、表達和其他功能性質(zhì)。除非另有說明，否則本發(fā)明的人源化蛋白的各個結(jié)構(gòu)域彼此有效連接。cd3蛋白的人類細胞外結(jié)構(gòu)域與非人類跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的有效連接可通過由核酸編碼序列表達這些組分作為連續(xù)融合蛋白來實現(xiàn)。

有關(guān)基因置換的術(shù)語“置換”包括將外源性遺傳物質(zhì)放置在內(nèi)源性遺傳基因座處，從而用直系同源或同源核酸序列置換內(nèi)源性基因的全部或部分。在一種情況下，內(nèi)源性非人類基因或其片段用相應人類基因或其片段置換。例如，編碼小鼠或其他非人類cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的dna可用編碼相應人類蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的dna置換。相應人類基因或其片段是這樣的人類基因或片段：其是被置換的內(nèi)源性非人類基因或其片段的直系同源物、同源物，或在結(jié)構(gòu)和/或功能上與被置換的內(nèi)源性非人類基因或其片段基本相同或一樣。如下文的實例所示，編碼內(nèi)源性非人類cd3細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列被對應于人cd3細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列置換。

如本文所用，例如有關(guān)功能蛋白的“功能”包括保持正常情況下與天然蛋白相關(guān)的至少一種生物學活性的蛋白。例如，在本發(fā)明的一些實施例中，內(nèi)源性基因座處的置換(例如，內(nèi)源性非人類cd3基因座處的置換)導致基因座不能表達功能內(nèi)源性蛋白。

如cd3基因座中的術(shù)語“基因座”包括包含cd3編碼區(qū)的基因組dna。不同的cd3基因cd3ε、cd3δ、cd3γ在同一染色體上彼此靠近定位。因此，根據(jù)情形，提及內(nèi)源性cd3基因座可能是指包括這些編碼區(qū)中的一些或全部或者單個編碼區(qū)的基因座。例如，如果只將一個人cd3(諸如cd3ε)引入非人類動物，則編碼該cd3的核酸優(yōu)選地修飾相應非人類cd3的基因座。如果將多個人cd3(諸如cd3ε、cd3δ、cd3γ)引入非人類動物，則被修飾的內(nèi)源性基因座包括cd3ε、cd3δ、cd3γ中每一者的編碼區(qū)。cd3基因座也可能是指cd3ζ的基因座，其占據(jù)不同于cd3ε、cd3δ和cd3γ的染色體。如果將人cd3ζ與人cd3ε、cd3δ和cd3γ中的任一者一起引入，則可修飾不同染色體上的兩個或更多個cd3基因座。所述cd3基因座中可包含其他序列，將這些序列引入用于遺傳操作(例如選擇表達盒、限制性位點等)目的。

有關(guān)免疫球蛋白核酸序列的術(shù)語“生殖細胞系”包括可傳遞給子代的核酸序列。

短語“免疫球蛋白分子”包括兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈。重鏈可以相同或不同，輕鏈可以相同或不同。

如本文所用，術(shù)語“抗體”包括包含四條多肽鏈的免疫球蛋白分子，其中兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈通過二硫鍵相互連接。每條重鏈包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch)。重鏈恒定結(jié)構(gòu)域包含三個結(jié)構(gòu)域：ch1、ch2和ch3。每條輕鏈包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(cl)。重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可進一步細分為超可變區(qū)，稱為互補性決定區(qū)(cdr)，該超可變區(qū)散布在更保守的區(qū)域(稱為骨架區(qū)(fr))內(nèi)。每個重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括三個cdr和四個fr，它們按下列順序從氨基末端排列至羧基末端：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(重鏈cdr可簡寫為hcdr1、hcdr2和hcdr3；輕鏈cdr可簡寫為lcdr1、lcdr2和lcdr3)。

術(shù)語“高親和性”抗體是指對靶表位的kd為約10^-9m或更低(例如，約1×10^-9m、1×10^-10m、1×10^-11m或約1×10^-12m)的抗體。

短語“雙特異性抗體”包括能夠選擇性結(jié)合兩個表位的抗體。雙特異性抗體通常包括兩個臂，每個臂結(jié)合不同表位(例如具有不同特異性的兩條重鏈)，所述不同表位在兩個不同分子上(例如，不同表位在兩個不同免疫原上)或在同一分子上(例如，不同表位在同一免疫原上)。如果雙特異性抗體能夠選擇性結(jié)合兩個不同表位(第一表位和第二表位)，則第一抗體臂對第一表位的親和性通常比第一抗體臂對第二表位的親和性低至少一個至兩個或三個或四個或更多個數(shù)量級，反之亦然。被雙特異性抗體特異性結(jié)合的表位可在相同或不同的靶標上(例如，在相同或不同的蛋白上)。示例性雙特異性抗體包括第一抗體臂對腫瘤抗原具有特異性并且第二抗體臂對細胞毒性標志物(例如，fc受體(例如fcγri、fcγrii、fcγriii等)或t細胞標志物(例如cd3、cd28等))具有特異性的雙特異性抗體。在本發(fā)明的一個實施例中，雙特異性抗體的一個臂對cd3具有特異性。此外，第一臂對腫瘤抗原具有特異性并且第二臂對毒素具有特異性的雙特異性抗體可被配對，以將毒素(例如皂草素、長春花生物堿等)遞送到腫瘤細胞。其他示例性雙特異性抗體包括第一抗體臂對激活性受體(例如b細胞受體、fcγri、fcγriia、fcγriiia、fcγri、t細胞受體等)具有特異性并且第二抗體臂對抑制性受體(例如fcγriib、cd5、cd22、cd72、cd300a等)具有特異性的雙特異性抗體。此類雙特異性抗體可被構(gòu)建用于與細胞活化相關(guān)的治療條件(例如過敏和哮喘)中。雙特異性抗體可例如通過將識別同一免疫原不同表位的重鏈進行組合來制備。例如，可將編碼識別同一免疫原不同表位的重鏈可變序列的核酸序列融合到編碼相同或不同重鏈恒定區(qū)的核酸序列中，這種序列可在表達免疫球蛋白輕鏈的細胞中表達。典型的雙特異性抗體具有兩條重鏈，每條重鏈具有三個重鏈cdr，然后是(從n端至c端)ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域，以及免疫球蛋白輕鏈，所述輕鏈不具有表位結(jié)合特異性但能與每條重鏈結(jié)合，或者可與每條重鏈結(jié)合并且可結(jié)合一個或多個被重鏈表位結(jié)合區(qū)結(jié)合的表位，或者可與每條重鏈結(jié)合并且能夠使得一條或兩條重鏈結(jié)合到一個或兩個表位。類似地，短語“多特異性抗體”包括能夠選擇性結(jié)合多個表位(例如兩個、三個、四個表位)的抗體。

短語“互補性決定區(qū)”或術(shù)語“cdr”包括由生物體的免疫球蛋白基因的核酸序列編碼的氨基酸序列，所述核酸序列通常(即在野生型動物中)出現(xiàn)在免疫球蛋白分子的輕鏈或重鏈可變區(qū)中的兩個骨架區(qū)之間。cdr可由例如生殖細胞系序列或重排或未重排序列編碼且例如由未成熟或成熟的b細胞編碼。cdr可以是體細胞突變的(例如，不同于動物的生殖細胞系中編碼的序列)、人源化的和/或通過氨基酸取代、增添或缺失進行修飾的。在一些情況下(例如對于cdr3而言)，例如由于剪接或連接序列(例如，重組v-d-j以形成重鏈cdr3)，cdr可由兩個或更多個(例如在未重排的核酸序列中)不連續(xù)的序列(例如生殖細胞系序列)，但在b細胞核酸序列中連續(xù)的序列編碼。

短語“功能片段”包含抗原結(jié)合蛋白(諸如抗體)的片段，其可被表達、分泌并以微摩爾、納摩爾或皮摩爾級的kd特異性地結(jié)合至表位。特異性識別包括具有至少在微摩爾級、納摩爾級或皮摩爾級的kd。

短語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白重鏈序列，包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列。除非另外指明，否則重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括三個重鏈cdr和四個骨架(fr)區(qū)。重鏈的片段包括cdr、cdr和fr，以及它們的組合。典型的重鏈具有在可變結(jié)構(gòu)域之后(從n端到c端)的ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域。重鏈的功能片段包括能夠特異性識別表位(例如，以微摩爾級、納摩爾級或皮摩爾級的kd識別表位)的片段，其能夠表達并從細胞分泌，并且包含至少一個cdr。重鏈可變結(jié)構(gòu)域由可變區(qū)基因序列編碼，其一般包含vh、dh和jh區(qū)段，這些區(qū)段來源于存在于種系中的vh、dh和jh區(qū)段組庫。多個物種中v、d和j重鏈區(qū)段的序列、位置和命名可在國際免疫遺傳學信息系統(tǒng)(imgt數(shù)據(jù)庫)中查詢。

短語“輕鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈序列，并且除非另外指明，否則包括人kappa和lambda輕鏈及vpreb以及替代輕鏈。除非另外指明，否則輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通常包括三個輕鏈cdr和四個骨架區(qū)(fr)。一般來講，全長輕鏈從氨基端到羧基端包括含有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的可變結(jié)構(gòu)域，以及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域由輕鏈可變區(qū)基因序列編碼，其一般包含vl和jl區(qū)段，這些區(qū)段來源于存在于種系中的v和j區(qū)段組庫。多個物種中v和j輕鏈區(qū)段的序列、位置和命名可在國際免疫遺傳學信息系統(tǒng)(imgt數(shù)據(jù)庫)中查詢。輕鏈包括例如不選擇性地結(jié)合任何表位的那些輕鏈，該表位由在其中呈現(xiàn)該表位的抗原結(jié)合蛋白(例如抗體)識別。輕鏈還包括結(jié)合并識別一個或多個表位或者幫助重鏈結(jié)合并識別一個或多個表位的那些輕鏈，所述一個或多個表位由在其中呈現(xiàn)這些表位的抗原結(jié)合蛋白(例如抗體)選擇性結(jié)合。

如本文所用的術(shù)語“抗原結(jié)合蛋白”包含抗體和多種能夠結(jié)合目標抗原的天然產(chǎn)生及人工合成的分子?？乖Y(jié)合蛋白包括例如結(jié)構(gòu)域特異性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體(例如源自駱駝和魚等)、結(jié)構(gòu)域缺失抗體、嵌合抗體、cdr移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、納抗體(例如單價納抗體、二價納抗體等)、小分子免疫藥物(smip)、鯊魚可變ignar結(jié)構(gòu)域等?？乖Y(jié)合蛋白也可包括抗原結(jié)合片段，諸如例如(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)單鏈fv(scfv)分子；(vi)dab片段和(vii)由模擬抗體超可變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單位(例如分離的互補性決定區(qū)(cdr)諸如cdr3肽)等。

術(shù)語“細胞”包含適于表達重組核酸序列的任何細胞。細胞包括原核生物和真核生物(單細胞或多細胞)細胞、細菌細胞(例如大腸桿菌(e.coli)、芽孢桿菌屬(bacillusspp.)、鏈霉菌屬(streptomycesspp.)等品系)、分支桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如釀酒酵母(s.cerevisiae)、裂殖酵母(s.pombe)、畢赤酵母(p.pastoris)、嗜甲醇畢赤酵母(p.methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如sf-9、sf-21、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾等)、非人動物細胞、人細胞或細胞融合物，諸如雜交瘤細胞或細胞雜交瘤。在一些實施例中，該細胞為人、猴、大猩猩、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施例中，該細胞為真核的，并選自以下細胞：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、視網(wǎng)膜細胞、vero、cv1、腎(例如hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo205、hb8065、hl-60(例如bhk21)、jurkat、daudi、a431(表皮)、cv-1、u937、3t3、l細胞、c127細胞、sp2/0、ns-0、mmt060562、sertoli細胞、brl3a細胞、ht1080細胞、骨髓癌細胞、腫瘤細胞，以及源自上述細胞的細胞系。在一些實施例中，該細胞包含一個或多個病毒基因，例如，表達病毒基因的視網(wǎng)膜細胞(例如per.c6^tm細胞)。在一些實施例中，該細胞為es細胞。

在一個實施例中，人源化cd3蛋白表示其中細胞外結(jié)構(gòu)域是人序列的cd3蛋白?？缒ず桶|(zhì)結(jié)構(gòu)域也可是人的，但優(yōu)選地是非人內(nèi)源性序列。包含來自不同物種，特別是人細胞外結(jié)構(gòu)域以及非人跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的cd3蛋白也可稱為嵌合cd3蛋白。

經(jīng)遺傳修飾的人源化cd3動物

在多個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)遺傳修飾的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，在其基因組中(例如在其生殖細胞基因組中)包含編碼人源化cd3蛋白(例如人源化cd3ε、cd3γ、cd3δ，或其組合)的核酸序列。在一個實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)遺傳修飾的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，在其基因組中(例如在其生殖細胞基因組中)包含編碼人源化cd3δ、人源化cd3γ和人源化cd3ε蛋白的核苷酸序列。因此，在本發(fā)明的一些實施例中，該小鼠在其t細胞表面上表達人源化cd3γδε復合物，使得該人源化cd3γδε與在同一t細胞上表達的t細胞受體形成復合物。

cd3分子通常是旨在調(diào)節(jié)t細胞免疫的試劑的靶點，并為此目的開發(fā)了多種抗cd3抗體(例如muromonab-cd3或okt3)。如okt3的抗cd3抗體用作免疫抑制劑(例如在移植排斥中)，但也研究了其在自身免疫疾病(例如克羅恩氏病、i型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎等)中的治療潛力。

此外，cd3分子也正被研究作為雙特異性試劑例如雙特異性抗體的靶點，因為抗cd3雙特異性抗體能夠?qū)細胞招募至靶細胞，例如表達特定目標抗原的細胞。示例性抗cd3雙特異性抗體在美國專利申請公開no.2014/0088295和美國專利申請公開no.2015/0266966中說明，二者都以引用方式并入本文。

在臨床前藥物開發(fā)階段，通?；谄湫Я?、毒性以及其他藥代動力學和藥效學性質(zhì)來研究候選試劑。候選試劑(諸如抗體)通常靶向人抗原，因為研究的最終目標是開發(fā)人的治療方法。許多臨床前研究在大型動物諸如靈長類中進行，因為其生理和藥物代謝與人最相似。已知多種針對cd3開發(fā)的抗體(例如okt3)不與非人cd3，特別是靈長類cd3交叉反應。為了進行關(guān)于候選藥物的效力、毒性和其他參數(shù)的有效臨床前研究，首先必須測定該候選藥物以識別靈長類cd3分子。

但是，另一個使開發(fā)抗cd3治療方法復雜化的因素是大型靈長類諸如黑猩猩是瀕危物種，在許多國家禁止使用黑猩猩進行研究；而在其他靈長類，例如食蟹獼猴(macacafascicularis)中進行的研究可引起倫理問題。例如，由于上述原因，至今沒有人腫瘤的有效靈長類模型。因此，任何可在較小的動物模型(諸如嚙齒動物，例如小鼠)中獲得的關(guān)于特定治療候選物的初步數(shù)據(jù)可有助于決定在大型靈長類中進行臨床前研究的進一步進展。

在小型動物模型諸如小鼠中進行的臨床前研究傳統(tǒng)上使用藥物替代物進行。例如，在研發(fā)靶向特定人抗原的臨床候選物時，使用特異性靶向目標抗原的小鼠同源物的分子(例如抗原結(jié)合蛋白或抗體)，在小鼠中產(chǎn)生一些臨床前數(shù)據(jù)。關(guān)于效力、多種劑量方案、毒性和副作用以及給藥的其他方面的信息從此類藥物替代物研究中獲得。但是，這些發(fā)現(xiàn)是有限的，因為被研究的不是實際開發(fā)的藥物或其人靶點。

因此，進行初步臨床前研究的最有用的小型動物模型是非人動物，例如嚙齒動物，其表達人或人源化cd3蛋白，并且允許測試也與食蟹獼猴cd3交叉反應的抗cd3候選藥物，以實現(xiàn)隨后的靈長類臨床前研究。本發(fā)明提供了此類復雜的動物模型。

因此，本文提供了經(jīng)遺傳修飾的非人動物，其基因組中包含編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在本發(fā)明的一些實施例中，cd3蛋白選自cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ，及其組合。在一些實施例中，cd3蛋白選自cd3γ、cd3δ、cd3ε，及其組合。在一些實施例中，cd3蛋白包含cd3γ、cd3δ和cd3ε多肽鏈。因此，在一些實施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物的基因組中包含編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一些此類實施例中，人cd3γ、cd3δ和cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域可由單個核酸編碼。在一些實施例中，人cd3γ、cd3δ和cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域可由單獨的核酸編碼。

在一些實施例中，本文所述非人動物保留了內(nèi)源性非人cd3啟動子和/或調(diào)節(jié)元件(例如內(nèi)源性非人cd3γ、cd3δ和/或cd3ε啟動子和/或調(diào)節(jié)元件)。在其他實施例中，非人動物包含人cd3啟動子和調(diào)節(jié)元件。

盡管已經(jīng)假定所產(chǎn)生的大部分抗cd3抗體識別cd3ε表位(參見tunnacliffeetal.(1989)internationalimmunology,1(5):546-50)(tunnacliffe等人，1989年，《國際免疫學》，第1卷，第5期，第546-550頁))，但存在多種可識別其他cd3亞基(例如cd3γ或cd3δ)或需要cd3復合物組裝的試劑。因此，基因組中包含編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列的經(jīng)遺傳修飾的非人動物提供了優(yōu)勢，因為其可適用于將結(jié)合任何cd3亞基或cd3復合物的試劑。

圖4的比對中提供了示例性cd3蛋白。小鼠cd3ε蛋白序列可通過genbank登記號np_031674和seqidno:27查看，而人cd3ε蛋白序列可通過genbank登記號np_000724和seqidno:28查看。小鼠cd3δ蛋白序列可通過genbank登記號np_038515和seqidno:29查看，而人cdδ蛋白序列可通過genbank登記號np_000723和seqidno:30查看。小鼠cd3γ蛋白序列可通過genbank登記號np_033980和seqidno:31查看，而人cd3γ蛋白序列可通過genbank登記號np_000064和seqidno:32查看。

在本發(fā)明的一些實施例中，編碼人cd3的細胞外結(jié)構(gòu)域，例如人cd3γ、人cd3δ和人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列位于內(nèi)源性非人cd3基因座處。換句話講，此類核酸修飾了內(nèi)源性cd3基因座以編碼人cd3多肽。在本發(fā)明的一些實施例中，因為內(nèi)源性基因座的遺傳修飾，非人動物不包含相應非人cd3蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域，使得功能性細胞外結(jié)構(gòu)域不被表達。在本發(fā)明的一些實施例中，編碼人cd3的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列取代相應編碼內(nèi)源性非人cd3的核酸序列。因此，在一些實施例中，編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列取代編碼內(nèi)源性非人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，編碼人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列取代編碼內(nèi)源性非人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列取代編碼內(nèi)源性非人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一些實施例中，取代不包括取代編碼內(nèi)源性信號序列的核酸序列。在另一個實施例中，取代包括用編碼人信號序列的核酸序列來取代編碼內(nèi)源性信號序列的核酸序列。

在本發(fā)明的一些方面，細胞外結(jié)構(gòu)域包括不是跨膜或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的蛋白區(qū)域，例如，出現(xiàn)于細胞表面，并且當組裝成復合物時與tcr信號轉(zhuǎn)導復合物的其他組分的細胞外結(jié)構(gòu)域(例如tcrα和β細胞外結(jié)構(gòu)域)部分地相互作用的蛋白區(qū)域。在本文所述的多種實施例中，細胞外結(jié)構(gòu)域指在細胞表面表達的蛋白的結(jié)構(gòu)域，并且除非另有說明，否則不包括信號序列，該信號序列在細胞表面表達前通常以蛋白水解的方式裂解。在本發(fā)明的一些實施例中，cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域包含seqidno:24中示出氨基酸序列的氨基酸17-130(單獨示出為seqidno:33)。在一些此類實施例中，動物包含編碼內(nèi)源性cd3ε信號序列(例如seqidno:24的氨基酸1-16處的信號序列)的核酸序列。在本發(fā)明的其他實施例中，動物包含編碼人cd3ε信號序列的核酸序列。在本發(fā)明的一些實施例中，cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域包含seqidno:25中示出氨基酸序列的氨基酸19-105(單獨示出為seqidno:34)。在一些實施例中，動物包含編碼內(nèi)源性cd3δ信號序列(例如seqidno:25的氨基酸1-18處的信號序列)的核酸序列。在本發(fā)明的其他實施例中，動物包含編碼人cd3δ信號序列的核酸序列。在一些實施例中，cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域包含seqidno:26中示出氨基酸序列的氨基酸20-116(單獨示出為seqidno:35)。在一些實施例中，動物包含編碼內(nèi)源性cd3γ信號序列(例如seqidno:26的氨基酸1-19處的信號序列)的核酸序列。在本發(fā)明的其他實施例中，動物包含編碼人cd3γ信號序列的核酸序列。

在本發(fā)明的一些方面，非人動物包含編碼內(nèi)源性cd3蛋白，例如相應內(nèi)源性cd3蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。因此，在一個實施例中，非人動物包含編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該核酸序列與編碼相應內(nèi)源性非人cd3蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接，使得包含人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域以及相應內(nèi)源性非人cd3蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白被表達。因此，在一個方面，動物在內(nèi)源性cd3基因座處包含編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該核酸序列與編碼內(nèi)源性非人cd3的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接。在一個實施例中，動物在內(nèi)源性cd3ε基因座處包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該核酸序列與編碼內(nèi)源性非人動物cd3ε的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接；在內(nèi)源性cd3δ基因座處包含編碼人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該核酸序列與編碼內(nèi)源性非人動物cd3δ的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接；在內(nèi)源性cd3γ基因座處包含編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，該核酸序列與編碼內(nèi)源性非人動物cd3γ的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接。與完全人cd3蛋白相比，使用具有人細胞外結(jié)構(gòu)域以及內(nèi)源性跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合cd3蛋白允許與具有對人cd3特異性的藥物相互作用，但也可允許再現(xiàn)與內(nèi)源性t細胞受體及其信號轉(zhuǎn)導組分的相互作用。

在本發(fā)明的一些方面，非人動物表達人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一些方面，非人動物表達seqidno:33中所示出的人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一些方面，非人動物表達seqidno:34中所示出的人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一些方面，非人動物表達seqidno:35中所示出的人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的一些實施例中，非人動物為哺乳動物。在一個方面，非人動物為例如跳鼠總科(dipodoidea)或鼠總科(muroidea)的小型哺乳動物。在一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的動物是嚙齒動物。在一個實施例中，嚙齒動物選自小鼠、大鼠和倉鼠。在一個實施例中，嚙齒動物選自鼠總科。在一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的動物來自選自以下項的科：麗倉鼠科(calomyscidae)(例如，麗倉鼠)、倉鼠科(cricetidae)(例如，倉鼠、新世界鼠、田鼠、野鼠)、鼠科(muridae)(例如，真小鼠和大鼠(truemiceandrats)、沙鼠、非洲刺毛鼠、冠鼠)、馬島鼠科(nesomyidae)(例如，攀鼠、巖鼠、白尾鼠、馬島鼠(malagasyratsandmice))、刺睡鼠科(platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)以及鼴形鼠科(spalacidae)(例如，鼴形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一個具體實施例中，經(jīng)遺傳修飾的嚙齒動物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和冠鼠。在一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠來自鼠科的成員。在一個實施例中，動物為嚙齒動物。在一個具體實施例中，嚙齒動物選自小鼠和大鼠。在一個實施例中，非人動物為小鼠。

在一個實施例中，非人動物是嚙齒動物，為c57bl品系小鼠，其選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在另一個實施例中，小鼠是129品系小鼠，選自129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如129s1/sv、129s1/svim)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2(參見例如festingetal.(1999)revisednomenclatureforstrain129mice,mammaliangenome10:836(festing等人，1999年，對129品系小鼠的重新命名，《哺乳動物基因組》，第10卷，第836頁)，亦可參見auerbachetal(2000)establishmentandchimeraanalysisof129/svev-andc57bl/6-derivedmouseembryonicstemcelllines(auerbach等人，2000年，源于129/svev和c57bl/6的小鼠胚胎干細胞系的建立和嵌合分析))品系。在一個具體實施例中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠為上述129品系與上述c57bl/6品系的混合型。在另一個具體實施例中，小鼠為上述129品系的混合型，或上述bl/6品系的混合型。在一個具體實施例中，混合型的129品系為129s6(129/svevtac)品系。在另一個實施例中，小鼠為balb品系，例如balb/c品系。在又一個實施例中，小鼠為balb品系和另一種上述品系的混合型。

在一個實施例中，非人動物為大鼠。在一個實施例中，大鼠選自wistar大鼠、lea品系、spraguedawley品系、fischer品系、f344、f6和darkagouti。在一個實施例中，大鼠品系為選自wistar、lea、spraguedawley、fischer、f344、f6和darkagouti中的兩種或更多種品系的混合型。

因此，在一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物為嚙齒動物。在一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物為小鼠或大鼠。在一個實施例中，動物為小鼠。因此，在一個實施例中，經(jīng)遺傳修飾的動物是小鼠，該小鼠在內(nèi)源性小鼠cd3基因座處包含編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在一個實施例中，小鼠包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列、編碼人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列和編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在本發(fā)明的一些實施例中，人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域包含在seqidno:33中示出的序列，人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域包含在seqidno:34中示出的序列，人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域包含在seqidno:35中示出的序列。在一些實施例中，小鼠包含編碼內(nèi)源性小鼠cd3信號序列的序列。在其他實施例中，小鼠包含編碼人cd3信號序列的序列。

在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明的小鼠表達人源化cd3蛋白。在一個實施例中，小鼠表達人源化cd3ε、人源化cd3δ和人源化cd3γ蛋白。在本發(fā)明的一些實施例中，小鼠表達人cd3ε細胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源性小鼠cd3ε跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、人cd3δ細胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源性小鼠cd3δ跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，以及人cd3γ細胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源性小鼠cd3γ跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些此類實施例中，小鼠表達人源化cd3蛋白，其中所述人源化cd3蛋白是在seqidno:24中示出的人源化cd3ε、在seqidno:25中示出的人源化cd3δ，以及在seqidno:26中示出的人源化cd3γ。

在本發(fā)明的一些方面，經(jīng)基因工程化的小鼠是具有免疫能力的小鼠。在本發(fā)明的一些實施例中，引入人源化cd3蛋白不影響小鼠的免疫系統(tǒng)功能。在本發(fā)明的一些實施例中，小鼠包含正常的t細胞和b細胞比率。在本發(fā)明的一些實施例中，小鼠能對小鼠感染產(chǎn)生正常應答。在一些方面，與野生型小鼠(例如未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠)相比，該小鼠在胸腺中呈現(xiàn)相似的cd4+與cd8+細胞比。在本發(fā)明的一些實施例中，小鼠胸腺中cd4+與cd8+細胞比在未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠的cd4+與cd8+細胞比的30％以內(nèi)，例如20％以內(nèi)，例如15％以內(nèi)，例如12％以內(nèi)，例如10％以內(nèi)，例如5％以內(nèi)，例如2％以內(nèi)。在一些方面，與未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠相比，該小鼠在脾、淋巴結(jié)和外周血中呈現(xiàn)相似的t細胞和b細胞百分比。在一些方面，與未經(jīng)遺傳修飾以表達人源化cd3蛋白的小鼠相比，該小鼠呈現(xiàn)相似的循環(huán)白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞數(shù)量。

本文還提供了制備本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動物的方法。在一些實施例中，制備經(jīng)遺傳修飾的非人動物(其中該動物表達人源化cd3蛋白)的方法包括在內(nèi)源性非人動物cd3基因座處引入編碼人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，其中該人cd3蛋白選自cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，及其組合。如果引入多個人cd3蛋白，其可在單個核酸上共同引入(如本實施例中)或單獨引入。如果是后者，單個細胞系(例如es細胞系)可進行連續(xù)修飾直至修飾為包含編碼各個所需的人cd3的核酸。在一個實施例中，動物不包含相應非人cd3蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個方面，動物在內(nèi)源性非人cd3基因座包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一些實施例中，人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域在seqidno:33中示出，人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域在seqidno:34中示出，人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域在seqidno:35中示出。在一個實施例中，動物不包含相應非人cd3蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。

在一些實施例中，制備本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的非人動物的方法包括在內(nèi)源性cd3基因座處用編碼相應人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列替換編碼非人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在一個實施例中，動物保留非人cd3蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實施例中，該替換得到包含人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域以及相應內(nèi)源性非人cd3蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。

通常將編碼人cd3蛋白的核酸序列引入細胞，并由該細胞繁殖非人動物。如實例中所述，在一些實施例中，替換方法利用通過技術(shù)制備的靶標構(gòu)建物，將該構(gòu)建物引入es細胞，并用技術(shù)將靶標的es細胞引入小鼠胚胎。

在一個實施例中，其中該方法包括用編碼人cd3ε蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源性非人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，該方法包括用人cd3ε基因的編碼外顯子2至5的部分序列替換內(nèi)源性小鼠cd3ε基因的編碼外顯子2至4的部分序列。在一個實施例中，其中該方法包括用編碼人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源性非人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，該方法包括用人cd3δ基因的編碼外顯子2至3的部分序列替換內(nèi)源性小鼠cd3δ的編碼外顯子2至3的部分序列。在一個實施例中，其中該方法包括用編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源性非人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，該方法包括用人cd3γ基因的編碼外顯子2至4的部分序列替換小鼠cd3γ的編碼外顯子2至4的部分序列。在本發(fā)明的一個實施例中，該替換包含替換cd3ε、cd3δ和cd3γ的序列。在此類實施例中，該替換可通過以下過程完成：制備整合了所有三個基因座的序列遺傳修飾的大靶向載體并將該大靶向載體引入小鼠es細胞以制備小鼠，例如，如實例1中所述。

因此，在一個實施例中，本文提供了用于制備本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的動物的大靶向載體。在一個實施例中，該大靶向載體包含5'和3'小鼠同源臂；包含cd3ε基因的dna片段，其包括用人cd3ε編碼外顯子2至5的部分序列替換小鼠cd3ε編碼外顯子2至4的部分序列；包含cd3δ基因的dna片段，其包括用人cd3δ編碼外顯子2至3的部分序列替換小鼠cd3δ編碼外顯子2至3的部分序列；包含cd3γ基因的dna片段，其包括用人cd3γ編碼外顯子2至4的部分序列替換小鼠cd3γ編碼外顯子2至4的部分序列；以及選擇表達盒。

選擇表達盒是插入靶標構(gòu)建物中以便于選擇整合了目標構(gòu)建物細胞(例如細菌細胞、es細胞)的核苷酸序列。本領(lǐng)域已知多種合適的選擇表達盒(neo、hyg、pur、cm、spec等)。此外，選擇表達盒兩側(cè)可側(cè)接重組位點，其允許在用重組酶處理后缺失表達盒。常用的重組位點是loxp和frt，分別由cre和flp酶識別，但本領(lǐng)域已知其他重組位點。選擇表達盒可位于構(gòu)建物中編碼區(qū)外的任何位置。在一個實施例中，選擇表達盒插入人cd3ε插入序列的上游。

在完成基因靶定后，對es細胞或經(jīng)遺傳修飾的非人動物進行篩選以確認目標外源核苷酸序列成功整合或者外源多肽表達。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知多種技術(shù)，包括(但不限于)southern印跡、長pcr、定量pcr(例如使用的定量pcr)、熒光原位雜交、northern印跡、流式細胞術(shù)、western分析、免疫細胞化學、免疫組化學等。在一個實例中，帶有目標遺傳修飾的非人動物(例如小鼠)可通過用valenzuelaetal.(2003)high-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,naturebiotech.21(6):652-659(valenzuela等人，2003年，小鼠基因組的高通量工程以及高分辨率表達分析，《自然生物技術(shù)》，第21卷，第6期，第652-659頁)中描述的改進的等位基因測定方法來篩選丟失小鼠等位基因和/或獲得人等位基因以進行鑒定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知悉在經(jīng)遺傳修飾的動物中識別特異性核苷酸或氨基酸序列的其他測定方法。

由上述方法得到的雜合子可通過雜交產(chǎn)生純合子。

在一個方面，提供了用于制備嵌合人/非人cd3分子的方法，包括在單個細胞中由本文所述的核苷酸構(gòu)建物表達嵌合cd3蛋白。在一個實施例中，核苷酸構(gòu)建物是病毒載體；在一個具體實施例中，病毒載體是慢病毒載體。在一個實施例中，細胞選自表達病毒核酸序列的cho、cos、293、hela和視網(wǎng)膜細胞(例如perc.6^tm細胞)。

在一個方面，提供了表達嵌合人/非人cd3蛋白的細胞。在一個實施例中，細胞包含表達載體，該表達載體包含本文所述的嵌合cd3序列。在一個實施例中，細胞選自表達病毒核酸序列的cho、cos、293、hela和視網(wǎng)膜細胞(例如perc.6^tm細胞)。

還提供了如本文所述的由非人動物制備的嵌合cd3分子，其中在一個實施例中，該嵌合cd3分子包含人cd3蛋白細胞外結(jié)構(gòu)域的全部或基本全部氨基酸序列，以及來自非人cd3蛋白(例如小鼠cd3蛋白)的至少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

除了經(jīng)遺傳修飾的非人動物，還提供了非人胚胎(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠胚胎)，其中該胚胎包含如本文所述源自非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)的供體es細胞。在一個方面，胚胎包含es供體細胞以及宿主胚胎細胞，該es供體細胞包含所述嵌合cd3基因。

還提供了組織，其中該組織源自如本文所述的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)，并表達嵌合cd3蛋白。

此外，提供了從如本文所述的非人動物分離的非人細胞。在一個實施例中，該細胞為es細胞。在一個實施例中，該細胞為t細胞。在一個實施例中，該細胞為cd8+t細胞。在一個實施例中，該細胞為cd4+t細胞。

在一些實施例中，本文還提供了包含本文所述的編碼人源化cd3蛋白的核酸序列的遺傳基因座。

用于測試人類療法的小鼠模型

在一些方面，本文提供了用于測試靶向cd3(“抗cd3”)治療劑的小鼠模型。在一些實施例中，本文提供了用于測試抗cd3抗原結(jié)合蛋白的小鼠模型。在一些實施例中，本文提供了用于測試抗cd3抗體的小鼠模型。在一些此類實施例中，提供了用于測試抗cd3多特異性(例如雙特異性)抗原結(jié)合蛋白或抗cd3雙特異性抗體的小鼠模型。因此，抗cd3多特異性抗原結(jié)合蛋白(例如抗cd3雙特異性抗原結(jié)合蛋白)靶向或特異性結(jié)合所述人源化cd3蛋白和至少一種其他目標抗原。在各個方面，用于測試抗cd3雙特異性抗原結(jié)合蛋白的小鼠模型(其中抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合cd3和目標抗原兩者)包含編碼人源化cd3蛋白的核酸序列，其中人源化cd3蛋白選自cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ，及其組合，以及表達或包含目標抗原的細胞。在一個實施例中，小鼠包含表達所述人源化cd3蛋白的t細胞。

在一個實施例中，單特異性或雙特異性抗原結(jié)合蛋白的測試涉及進行這樣的分析或研究：其能夠測定抗原結(jié)合蛋白對表達所述人源化cd3蛋白的t細胞的效應。在另一個實施例中，雙特異性抗原結(jié)合蛋白的測試涉及進行這樣的分析或研究：其能夠測定抗原結(jié)合蛋白對表達所述人源化cd3蛋白的t細胞和表達或包含目標抗原的細胞兩者的效應，或所述表達cd3的t細胞與表達或包含目標抗原的細胞之間的相互作用。在一個實施例中，單特異性或雙特異性抗原結(jié)合蛋白的測試涉及進行這樣的分析或研究：其能夠測定表達所述人源化cd3蛋白的t細胞對表達或包含所述目標抗原的細胞的效應。在一個實施例中，這樣的分析法測量例如表達目標抗原的細胞的數(shù)目、免疫應答、細胞相互作用、細胞毒性、細胞因子釋放、細胞活化、細胞增殖、腫瘤生長或消退、病理學變化等。各種分析法包括但不限于測量補體主導的細胞毒性(cdc)、抗體依賴型細胞毒性(adcc)、抗體依賴型細胞吞噬作用(adcp)、pbmc增殖、cd69激活、組織學組織分析、組織和細胞生物標記物的分析(例如，為了進行分析，可從小鼠中提取細胞或組織，并通過射線照相術(shù)、mri、pet、spect、bli和基于熒光的成像模態(tài)進行分析)。

在本發(fā)明的一些實施例中，在這種小鼠模型中，目標抗原已經(jīng)被引入所述小鼠中。目標抗原可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的若干種方式引入。一些非限制性方法包括轉(zhuǎn)基因、注射、感染、組織或細胞移植。目標抗原或其片段(例如，被正在測試的抗原結(jié)合蛋白識別的片段)可靶向特定細胞類型或由特定細胞類型表達。在一些實施例中，目標抗原為由小鼠基因組編碼的人源化目標抗原。

目標抗原可為膜結(jié)合蛋白，以致其僅在細胞表面上表達?；蛘?，目標抗原或其片段(例如，被正在測試的抗原結(jié)合蛋白識別的片段)可顯示在與另一蛋白或部分復合的細胞表面。一些細胞表面抗原可與其他蛋白相聯(lián)作為共受體復合物，或結(jié)合細胞外分子或?qū)毎夥肿泳哂杏H和力。因此，小鼠模型可用于測試與各個細胞系統(tǒng)中的t細胞相互作用的雙特異性抗原結(jié)合分子。

在一個實施例中，小鼠模型表達人cd3ε、cd3δ、cd3γ細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，小鼠表達cd3ε、cd3δ和cd3γ的小鼠跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；并且在一個實施例中，跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域為內(nèi)源性小鼠結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，小鼠模型表達cd3ε、cd3δ和cd3γ，它們各自包含人細胞外結(jié)構(gòu)域和小鼠(例如內(nèi)源性小鼠)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的各種實施例中，抗原結(jié)合蛋白在小鼠模型中結(jié)合cd3和目標抗原兩者。在一個實施例中，目標抗原為人抗原。在一個實施例中，目標抗原為靈長類動物抗原，例如食蟹猴抗原。在一個實施例中，抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人和猴來源的相同目標抗原。在一個實施例中，抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人和猴cd3。

在一個實施例中，小鼠模型包含表達目標抗原的腫瘤異種移植物。在一個實施例中，在所述小鼠中表達或包含目標抗原的細胞為無限增殖化細胞，諸如腫瘤細胞。因此，小鼠模型用于測試抗cd3雙特異性抗原結(jié)合蛋白在阻斷或影響表達目標抗原的腫瘤細胞中的活性。

因此，在本發(fā)明的實施例中，其中表達或包含目標抗原的細胞為腫瘤細胞，目標抗原可為腫瘤相關(guān)抗原(taa)。各種腫瘤抗原在t細胞限定的腫瘤抗原的數(shù)據(jù)庫中列出(vanderbruggenp,stroobantv,vigneronn,vandeneyndeb.peptidedatabase:tcell-definedtumorantigens.cancerimmun2013(vanderbruggenp、stroobantv、vigneronn、vandeneyndeb，肽數(shù)據(jù)庫：t細胞限定的腫瘤抗原，《癌癥免疫學》，2013年))。示例性腫瘤相關(guān)抗原包括但不限于alk、bage蛋白、birc5(存活素)、birc7、ca9、calr、ccr5、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd27、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd52、cd56、cd79、cdk4、ceacam3、ceacam5、clec12a、egfr、egfr變體iii、erbb2(her2)、erbb3、erbb4、epcam、epha2、epha3、fcrl5、flt3、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、gpnmb、gm3、gpr112、il3ra、kit、kras、lgr5、ebv衍生的lmp2、l1cam、mage蛋白、mlana、msln、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ankrd30a、ny-eso1(ctag1b)、ox40、pap、pax3、pax5、plac1、prlr、pmel、prame、psma(folh1)、rage蛋白、ret、rgs5、ror1、sart1、sart3、slamf7、slc39a6(liv1)、steap1、steap2、tert、tmprss2、thompson-nouvelle抗原、tnfrsf17、tyr、upk3a、vtcn1、wt1。在一個實例中，如本文實例3中所述的那樣，目標抗原可為cd20，例如人或人源化cd20。

在本發(fā)明的另一個實施例中，小鼠模型用于確定候選雙特異性抗原結(jié)合蛋白是否能夠阻斷或影響目標抗原，即傳染性疾病相關(guān)抗原。在本發(fā)明的一個實施例中，小鼠被傳染性制劑感染。在本發(fā)明的一個實施例中，傳染性疾病相關(guān)抗原為病毒抗原。在一個方面，病毒抗原選自hiv、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒(例如，hsv-1、hsv-2、cmv、hav-6、vzv、eb病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、htlv、登革病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、jc病毒、埃博拉病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒抗原。

在本發(fā)明的另一個實施例中，其中目標抗原為傳染性疾病相關(guān)抗原，目標抗原為細菌抗原。在本發(fā)明的一些方面中，細菌抗原選自衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄狀球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎球菌、淋球菌、克雷白氏桿菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽桿菌、瘟疫、鉤端螺旋體和萊姆病細菌抗原。

在本發(fā)明的一些方面中，基于cd3的雙特異性抗原結(jié)合蛋白為基于人cd3的抗原結(jié)合蛋白。在一個實施例中，抗原結(jié)合蛋白為抗體，例如人抗體或其抗原結(jié)合片段。

在本發(fā)明的一些實施例中，小鼠模型為有免疫活性的小鼠模型。在本發(fā)明的一些實施例中，小鼠模型能夠測試目標抗原結(jié)合蛋白的功效和/或毒性。功效的量度將取決于由雙特異性劑靶向的目標抗原。在一些實施例中，功效的量度為t細胞殺死表達抗原的細胞的能力。在其它實施例中，功效的量度為病毒的中和作用。在其它實施例中，功效的量度可為動物的活力。在又一個實施例中，功效的量度可為表達目標抗原的細胞的消除、t細胞的增殖、細胞因子(例如，ifng、tnfa、il-1、il-2、il-10、il4、il-6、顆粒酶、穿孔素等)的產(chǎn)生。

在本發(fā)明的一些實施例中，動物身上的毒性可通過動物身上的不良事件來衡量，例如，體重、食欲、消化系統(tǒng)的變化，血細胞計數(shù)的變化，脾腫大，器官的組織學變化，肝酶功能的變化，尿液分析的變化，器官毒性，出血，脫水，脫毛和長皮屑，或其他發(fā)病癥狀。一種量度可為測定抗原結(jié)合蛋白與無關(guān)抗原的交叉反應性，在一個實施例中，該交叉反應性可通過器官組織學檢測，具體地講為檢測已知不表達目標抗原的組織或細胞類型中的抗原結(jié)合蛋白。

使用經(jīng)遺傳修飾的非人動物

本發(fā)明也提供了使用本文所述的經(jīng)遺傳修飾的非人動物的各種方法。

在一個實施例中，本文提供了一種篩選靶向目標抗原的候選治療性藥物的方法，該方法包括(a)提供或接收經(jīng)遺傳修飾的小鼠，該小鼠在其內(nèi)源性小鼠cd3基因座處包含編碼選自下列的人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列：cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ζ及其組合；(b)將目標抗原引入所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠；(c)使所述小鼠接觸目標候選藥物，其中候選藥物針對人cd3和目標抗原；以及(d)確定候選藥物對預防、減少或消除通過目標抗原的存在或表達來表征的細胞是否有效。在各個實施例中，小鼠在其t細胞表面表達功能性人源化cd3蛋白。在所述方法的一個實施例中，所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠在內(nèi)源性小鼠cd3基因座處包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在本文所述方法的一個實施例中，小鼠不包含編碼對應小鼠蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在所述方法的一些實施例中，人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域有效連接至相應內(nèi)源性小鼠cd3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在所述方法的各個此類實施例中，人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域示于seqidno:33，人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域示于seqidno:34，并且人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域示為seqidno:35。在本文所述方法的各個實施例中，小鼠可表達seqidno:24所示的人源化cd3ε蛋白、seqidno:25所示的人源化cd3δ蛋白以及seqidno:26所示的人源化cd3γ。

在本文所述方法的各個實施例中，可采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法來完成將目標抗原引入本文所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠中，這些方法可包括但不限于轉(zhuǎn)基因、注射、感染、組織或細胞移植。因此，引入可通過在小鼠中表達目標抗原來實現(xiàn)，這可包括遺傳修飾所述小鼠以表達目標抗原?；蛘?，引入可包括將表達目標抗原的細胞引入所述小鼠中，例如，如在細胞或組織移植中那樣。引入也可包括用目標抗原感染所述小鼠，例如，如在細菌或病毒感染中那樣。在一個實施例中，目標抗原可為人目標抗原。在另一個實施例中，它可為細菌或病毒目標抗原。

目標抗原可為腫瘤相關(guān)抗原，如在上文中詳細描述的那樣?？乖部蔀閭魅拘约膊∠嚓P(guān)抗原如細菌或病毒抗原，如在上文中詳細描述的那樣。

在篩選候選治療性藥物的方法的各個實施例中，候選藥物可為抗原結(jié)合蛋白例如抗體(如雙特異性抗體)。在各個方面，這種候選藥物能夠結(jié)合人cd3和目標抗原。目標抗原可為人抗原。目標抗原也可為靈長類動物(例如猴)抗原。因此，用于篩選的候選藥物除結(jié)合人cd3之外，可能能夠結(jié)合人抗原和相應靈長類動物抗原兩者。候選藥物也可能能夠結(jié)合靈長類動物(例如猴)cd3。因此，候選藥物可能能夠結(jié)合人和靈長類動物(例如猴)cd3兩者；并且，在一個實施例中，還能夠結(jié)合人目標抗原。在另一個實施例中，目標抗原可為細菌或病毒抗原，并且候選藥物可能能夠結(jié)合人和靈長類動物(如猴)cd3兩者以及細菌或病毒目標抗原。

在一些方面，治療性候選物為抗體，即人抗體。在其他方面，它可為人源化抗體。例如，治療性候選物可為在小鼠(美國專利編號8,502,018，以引用方式并入本文)中生成的抗體；因此，初始抗體候選物可包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)?？贵w候選物的小鼠恒定區(qū)可通過表達小鼠中所選與人恒定區(qū)有效連接的人可變區(qū)而被改造成為人來源。

在本文所述方法的各種實施例中，治療性候選物能夠緩解、消除或預防疾病。在一個實施例中，疾病為腫瘤，并且與不靶向目標抗原的試劑相比，治療性候選物能夠緩解、消除或預防腫瘤生長。在所述方法的這類實施例中，可使用腫瘤體積分析、腫瘤細胞殺傷分析、腫瘤中凋亡標記物的誘導、腫瘤血管生長減緩、免疫細胞滲入腫瘤等測定候選藥物對預防、減少或消除通過目標抗原的存在或表達來表征的細胞是否有效。在另一個實施例中，疾病為傳染性疾病，并且與不靶向目標抗原的試劑相比，治療性候選物能夠降低、消除或預防細菌或病毒感染。在所述方法的此類實施例中，可使用細菌或病毒滴度的量度、受感染細胞中凋亡標記物的誘導等測定候選藥物對預防、減少或消除通過目標抗原的存在或表達來表征的細胞是否有效。

還提供了使用本發(fā)明的人源化cd3小鼠的其他方法。例如，可使用非人動物(如本文所述的人源化cd3小鼠)來研究藥物作用機制。在本發(fā)明動物開發(fā)之前很難研究藥物作用機制，因為此類研究通常不在人和靈長類動物身上進行且通常需要有免疫活性的動物模型。了解藥物作用機制可致使開發(fā)更強的抗體。在本發(fā)明的各個實施例中，人源化cd3小鼠為有免疫活性的小鼠。例如，本發(fā)明的人源化cd3小鼠(該小鼠具有所有免疫細胞類型完好發(fā)育和完全互補且免疫信號通路完整的健康正常的免疫系統(tǒng))可用于研究各種治療性候選物對特定細胞類型、細胞因子、趨化因子等的效果。然后該小鼠可用于解答與候選藥物功能相關(guān)的機制問題。

此外，人源化cd3小鼠可用于涉及測試雙特異性抗cd3候選藥物對腫瘤移植的效果的方法中。先前開發(fā)的小鼠模型為免疫功能不全的小鼠模型以能夠?qū)崿F(xiàn)適當?shù)娜四[瘤移植。人源化cd3小鼠具有完全免疫活性并實現(xiàn)了表達目標抗原的腫瘤細胞的引入和生長，因此可研究對免疫應答的全面影響，包括但不限于回答機制問題、早期毒性問題、早期功效問題等。

在又一個實施例中，人源化cd3小鼠可用于研究動物模型中聯(lián)合藥物療法的效果，具體地講例如其中一種藥物為結(jié)合cd3的抗原結(jié)合蛋白，而另一種藥物為此前被批準用于特定適應癥的試劑的聯(lián)合藥物療法。在進行任何人體試驗之前，有關(guān)藥物劑量及其效果的具體問題可在動物模型中得到解答。

實例

提供了下面的實例以便向本領(lǐng)域的技術(shù)人員描述如何制備本發(fā)明的組合物和如何使用本發(fā)明的方法，并且這些實例并非旨在限制本發(fā)明人視作其發(fā)明的范圍。已盡量確保所使用的數(shù)字(例如量、溫度等)的準確性，但應考慮到一些實驗誤差和偏差。這些實例不包括本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法(分子克隆技術(shù)等)的詳細描述。除非另外指明，否則份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是平均分子量，溫度以攝氏度表示，而壓力是大氣壓或接近大氣壓。

實例1.人源化cd3基因座的構(gòu)建

實例1.1.人源化cd3的構(gòu)建γδε

小鼠cd3基因座通過采用技術(shù)由人和小鼠細菌人工染色體(bac)dna構(gòu)建獨特的靶向載體而被人源化(參見例如，美國專利no.6,586,251和valenzuelaetal.(2003)high-throughputengineeringofthemousegenomecouplewithhigh-resolutionexpressionanalysis.nat.biotech.21(6):652-659(valenzuela等人，2003年，與高解析度表達分析相結(jié)合的小鼠基因組高通量工程改造，《自然生物技術(shù)》，第21卷，第6期，第652-659頁)，這兩篇文獻均以引用的方式并入本文)。小鼠bacbmq-425k11的dna通過同源重組被修飾，以分別用來源于人bacrp11-414g21的cd3ε、cd3δ和cd3γ基因(人cd3基因在11號染色體上位于彼此緊鄰的位置)的對應部分替換小鼠cd3ε、cd3δ和cd3γ基因(小鼠cd3基因在9號染色體上位于彼此緊鄰的位置)的基因組dna編碼部分。

具體地講，為產(chǎn)生人源化cd3γδε小鼠，首先在單個靶向事件中使用包含spec盒的靶向載體并使用小鼠同源臂，通過用939bp的人cd3d序列(對應于cd3d基因的人編碼外顯子2-3的部分序列)替換714bp的小鼠cd3d序列(對應于cd3d基因的小鼠編碼外顯子2-3的部分序列)來修飾小鼠bac。

用對應人序列替換cd3d基因的小鼠編碼外顯子2-3的部分序列的小鼠bac隨后同樣在單個靶向事件中使用另一含spec盒的載體和小鼠同源臂，通過用1,639bp的人cd3g序列(對應于cd3g基因的人編碼外顯子2-4的部分序列)替換1,738bp的小鼠cd3g序列(對應于cd3g基因的小鼠編碼外顯子2-4的部分序列)而被修飾。

最后，用對應人基因替換小鼠cd3d和cd3g基因的bac通過用6,817bp的人序列替換6,213bp的小鼠cd3e序列(對應于用人cd3e基因的人編碼外顯子2-5的部分序列替換小鼠cd3e基因的小鼠編碼外顯子2-4的部分序列)而被進一步修飾。將4,996bp的floxed新霉素盒插入人cd3e序列敲入的上游。

所得用于插入es細胞的人源化大靶向載體示于圖2a中，其中a、b、c、d、e、f和g表示不同的小鼠/人或小鼠/neo盒或人/neo盒接合區(qū)。接合區(qū)的序列示于下表1中。

表1.大靶向載體的接合序列

所靶向bacdna用于電穿孔包含小鼠cd3基因座缺失的小鼠es細胞，以形成經(jīng)修飾的es細胞，用于產(chǎn)生在其t細胞表面上表達人源化cd3ε、cd3δ和cd3γ的小鼠。通過定量taqman^tm分析來鑒定包含插入人cd3ε、cd3δ和cd3γ序列的es細胞(參見例如，lieandpetropoulos,1998.curr.opin.biotechnology9:43-48(lie和petropoulos，1998年，《生物技術(shù)當前述評》，第9卷，第43-48頁)，該文獻以引用方式并入本文)。特異性引物組和探針被設(shè)計成用于檢測人序列的插入(等位基因獲得，goa)和小鼠序列的缺失(等位基因丟失，loa)。表2示出了在定量pcr分析中采用的每個引物/探針組的名稱和位置。

表2：用于基因分型的引物/探針對

上述所靶向的es細胞用作供體es細胞，并通過方法被引入8細胞期小鼠胚胎(參見例如，美國專利no.7,294,754和poueymirouetal.(2007)f0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedescellsallowingimmediatephenotypicanalysesnaturebiotech.25(1):91-99(poueymirou等人，2007年，“基本上完全來源于供體基因靶向的es細胞的f0代小鼠實現(xiàn)了即時表型分析”，《自然生物技術(shù)》，第25卷第1期，第91-99頁))。采用等位基因分析(檢測是否存在獨特的人cd3基因序列)的變型形式(參見上文)，通過基因分型鑒定獨立攜帶人源化cd3基因的(完全來源于供體es細胞的f0小鼠)。

選擇盒可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法除去。例如，攜帶人源化cd3基因座的es細胞可用表達cre的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，以便除去floxed盒。選擇盒可任選地通過與表達cre重組酶的小鼠嫁接除去。任選地，選擇盒保留在小鼠體內(nèi)。在除去選擇盒之后，人源化cd3ε等位基因的小鼠/人接合區(qū)(在圖2b中示為a-b)，示于下表3中。其余接合區(qū)序列與靶向載體中的接合區(qū)序列相同，并示于上表1中。

表3.人源化等位基因的接合序列

所得人源化cd3ε、cd3δ和cd3γ蛋白的序列示于圖3中，并包括在序列表中。另外，小鼠-人序列的比對以及在所插入人序列的5’和3’處的接合區(qū)在圖4中分別示為*和**。cd3ε、cd3δ和cd3γ蛋白的genbank蛋白登錄號匯總于下表4中。

表4genbank蛋白登錄號

實例2.人源化cd3小鼠的表征

實例2.1.人源化cd3小鼠中的免疫細胞發(fā)育

人cd3εδγ小鼠的胸腺及外周中的免疫細胞發(fā)育采用熒光激活細胞分選(facs)分析和微分細胞計數(shù)來評估。從野生型(wt，無人cd3γδε)、雜合(het，一個hcd3γδε等位基因)和純合(ho，兩個hcd3γδεδ等位基因)小鼠群采集胸腺、脾和淋巴結(jié)。外周血通過心臟穿刺或眼眶后穿刺流入edta涂覆的microtainer管(bd)得到。單細胞懸浮液是通過機械破碎脾、ln和胸腺制備的，并用akc裂解緩沖液裂解除去脾、胸腺和全血中的紅細胞。在室溫下將細胞與抗cd16/cd32(fcblock)的純化抗體一起溫育10分鐘，通過fc受體阻斷非特定性結(jié)合，然后在4℃下與直接綴合到t和b細胞標記物上的抗體混合物一起溫育30分鐘。這些細胞用含1％bsa的冷pbs洗滌兩次，然后重懸浮于緩沖液中并在facscantoii^tm流式細胞分析儀(bd生物科學公司(bdbiosciences))上采用流式細胞術(shù)進行分析。首先通過前向散射和側(cè)向散射門控，然后通過b220群上的門控鑒定出胸腺細胞。在外周中，t細胞被標識為cd45+/tcrb+/b220-，b細胞被標識為cd45+/tcrb-/b220+。在hemavet950fs血液分析儀上獲得絕對計數(shù)。

如圖5a和5b中所示，人源化cd3γδε小鼠看起來具有正常的胸腺細胞發(fā)育并在胸腺、外周血和脾中具有正常的t細胞和b細胞比。另外，淋巴結(jié)中t細胞和b細胞百分比看起來很正常，并且脾和淋巴結(jié)的絕對細胞計數(shù)(該數(shù)據(jù)未示出)處于正常范圍內(nèi)。wt、het和ho小鼠之間血液中的cd4和cd8細胞數(shù)目近似。循環(huán)白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿粒細胞看起來均處于正常范圍內(nèi)(該數(shù)據(jù)未示出)。因此，在人源化cd3εδγ小鼠中觀察到正常的免疫細胞發(fā)育。

為了確定人源化cd3εδγ小鼠是否具有多克隆vβcd4+和cd8+t細胞組庫，從四種人源化小鼠和五種品系匹配的對照小鼠中分離出脾細胞并檢查這些細胞是否可用于tcrvβ。收集脾并如上文所述的那樣制備單細胞脾細胞。在室溫下將細胞與抗cd16/cd32(fcblock；biolegend)的純化抗體一起溫育10分鐘，通過fc受體阻斷非特定性結(jié)合，然后重懸于直接綴合到小鼠cd4(biolegend)和小鼠cd8(biolegend)上的抗體混合物中。然后將直接綴合到tcrvβ上的抗體添加到各個孔中，并在4℃下溫育30分鐘。用冷pbs洗滌這些細胞并在室溫下將其與活力染料(live/dead可固定水性死細胞染料，美國生命技術(shù)公司(lifetechnologies))一起溫育15分鐘。這些細胞用含2％fbs的冷pbs洗滌兩次，然后重懸浮于緩沖液中，并用bd穩(wěn)定緩沖液固定，然后在lsrfortessa^tm流式細胞分析儀(bd生物科學公司(bdbiosciences))上采用流式細胞術(shù)進行分析。首先通過前向散射和側(cè)向散射門控，然后通過活體群上的門控鑒定出cd4和cd8t細胞。然后檢查cd4t細胞(cd4+cd8-)和cd8t細胞(cd4-cd8+)是否可用于tcrvβ。

如圖5c中可見，人源化cd3εδγ小鼠中的cd4和cd8t細胞均使用的vβ組庫表現(xiàn)出多克隆性，其用法與品系匹配的對照小鼠沒有顯著區(qū)別。

實例2.2.t細胞對人源化cd3小鼠感染的反應

為了確定人源化cd3小鼠(人源化cd3γδε小鼠)是否對感染表現(xiàn)出正常的反應，測試人源化小鼠清除淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lcmv)的能力。lcmv是一種小鼠熱帶病毒，是否感染取決于病毒菌株。被armstrong菌株感染可導致急性感染，在這種感染中小鼠可迅速產(chǎn)生t細胞響應對抗病毒并在約一周內(nèi)清除感染。在另一方面，clone13病毒不能被清除，因此t細胞漸漸“耗盡”，形成慢性感染。因為慢性和急性感染均取決于t細胞活性，所以lcmv是測試t細胞功能的理想模型。

用2×10⁵ffu的armstrongi.p.和/或2×10⁶ffu的用于clone13感染的clone13i.v.感染6-8周齡的人源化cd3小鼠或品系匹配的對照小鼠，感染兩周后，收集脾并通過噬斑試驗測量病毒滴度。在對照和hucd3小鼠中病毒滴度均相似(圖6a)，這表明cd3人源化對t細胞耗盡表型沒有影響，因為在兩小鼠品系中t細胞均可將病毒控制于近似水平。對于armstrong菌株感染，在初始amstrong菌株感染兩周后，用clone13感染小鼠，并在被clone13感染兩周之后在脾中測量病毒滴度。在對照或人源化cd3小鼠中均未檢測到病毒(圖6b)。數(shù)據(jù)顯示已清除急性armstrong感染。此外，這表明，在兩小鼠品系中由armstrong感染引起的記憶t細胞足以保護小鼠免受后續(xù)的clone13感染。

實例3.人源化cd3小鼠作為用于測試基于抗cd3的治療性候選物的模型

實例3.1.用于測試食蟹猴交叉反應的抗人cd3抗體的人源化cd3小鼠

采用熒光激活細胞分選(facs)分析測試不同的人限制型抗cd3抗體或食蟹猴交叉反應的抗cd3抗體結(jié)合來自野生型(wt)或人源化cd3γδε(ho＝純合的，het＝雜合的)小鼠的腺細胞的能力。

在4℃下將剛分離的腺細胞(每孔2×10⁵個)與抗cd3抗體(15μg/ml)一起溫育30分鐘。溫育之后，洗滌細胞兩次并加入合適的二級抗體(例如，熒光標記的pe抗人igg和直接綴合到t細胞標記物的抗體)，在4℃下再溫育30分鐘，然后洗滌兩次。使用下面的抗體：ah/mfcd3-2和ah/mfcd3-1為識別人和猴cd3兩者的兩種抗體；ahcd3-2和ahcd3-1為只識別人cd3的兩種抗體；amcd3-2c11為只識別小鼠cd3的抗體；對照人igg為不相關(guān)的對照抗體；以及僅二級抗體為僅用于對照的二級抗體。這些細胞用含1％bsa的冷pbs洗滌兩次，然后重懸浮于緩沖液中并在facscantoii^tm流式細胞分析儀(bd生物科學公司(bdbiosciences))上采用流式細胞術(shù)進行分析。t細胞被標識為cd45+/tcrb+/b220-。用經(jīng)改造包含higg1的抗mcd3-2c11鑒定wt小鼠脾細胞上的t細胞。

如圖7中所示，只識別人cd3的抗cd3抗體能夠結(jié)合人源化cd3γδε小鼠脾細胞表面上的cd3；類似地，識別人和猴cd3的抗cd3抗體能夠結(jié)合人源化cd3γδε小鼠表面上的cd3。因此，所有三種cd3ε、cd3δ和cd3γ人源化的小鼠對于基于cd3的候選藥物的早期預臨床研究是相關(guān)的，然后可對食蟹猴開展功效和毒性研究跟進。

實例3.2.人源化cd3小鼠中的t細胞活化

測試抗人cd3抗體在人源化cd3小鼠中引發(fā)免疫應答的能力。向cd3γδε人源化小鼠(每組2個)腹腔內(nèi)注射10μg不同的人限制型抗cd3抗體或食蟹猴交叉反應的抗cd3抗體(所有higg1)。為了得到細胞組合物和血漿細胞因子水平，注射后2小時開始從眶后竇取血，將血液抽入edt涂覆的microtainer管(bd)中。通過facs評估外周t細胞和b細胞數(shù)目。簡而言之，在4℃下將50μl全血與直接綴合至t和b細胞標記物的抗體混合物一起溫育30分鐘。用akc裂解緩沖液裂解除去紅細胞，并用含1％bsa的冷pbs洗滌所標記細胞一次。洗滌之后，將細胞重懸于冷緩沖液中，并在facscantoii^tm流式細胞分析儀(bd生物科學公司(bdbiosciences))上采用流式細胞術(shù)進行分析。t細胞被標識為活cd45+/tcrb+/b220-，b細胞被標識為活cd45+/tcrb-/b220+。通過加入已知量的countbrighttm絕對計數(shù)珠來確定絕對細胞計數(shù)。使用小鼠促炎7-plex超靈敏試劑盒(mouseproinflammatory7-plexultra-sensitivekit(meso-scalediscovery))評估注射后2小時得到的血液中的血漿細胞因子水平。

如圖8a中所示，注射10μg的抗cd3抗體引起瞬態(tài)t細胞和b細胞耗減，這在初始抗體治療4天后大部分恢復。另外，注射抗cd3抗體(僅識別人cd3的抗cd3抗體(ahcd3-1和ahcd3-3)以及識別人和猴cd3兩者的抗cd3抗體(ah/mfcd3-1和ah/mfcd3-2))引起cd3γδε人源化小鼠產(chǎn)生細胞因子(圖8b)。

此外，采用atp催化定量(celltiter)評估抗人cd3抗體、抗人/食蟹猴cd3抗體或抗小鼠抗體誘導來自野生型或人源化cd3γδε小鼠的脾細胞增殖的能力。小鼠脾細胞的活化導致驅(qū)動細胞增殖的細胞因子的釋放。使用下面的方案采集增殖數(shù)據(jù)：將源自野生型(wt)或人源化純合cd3γδε(hcd3γδεho)的脾細胞(5×10⁵/孔)加入96孔板中，該96孔板已在4℃下用遞減量的人限制型抗cd3抗體、食蟹猴交叉反應的抗cd3抗體或鼠科動物特異性抗cd3抗體涂覆過夜。將500ng/ml抗小鼠cd28加入培養(yǎng)物中，并在37℃下溫育72h。溫育之后，加入celltiter并使用victorx5多標記讀板機(珀金埃爾默公司(perkinelmer))測量發(fā)光強度。使用prism(加利福尼亞州圣地亞哥的graphpadsoftware公司(graphpadsoftware,sandiego,ca))確定ec50細胞活力(atp催化定量)。使用4參數(shù)非線性回歸分析計算數(shù)值。

如圖9中所示，通過食蟹猴交叉反應的cd3抗體誘導來自人源化cd3γδε小鼠的脾細胞增殖。

wt和cd3γδε小鼠各種特性的匯總示于圖10中。如圖中可見，來自cd3γδε小鼠的淋巴細胞能夠結(jié)合抗人cd3抗體并響應于抗人cd3抗體(尤其已知與猴cd3交叉反應的那些)，這是治療劑的一個重要方面，因為對候選藥物的預臨床研究通常是在大型動物諸如食蟹猴中開展的。

實例3.3.人源化cd3小鼠中腫瘤耗減研究

通過使在cd3基因座處人源化的小鼠與在cd20基因座處人源化的小鼠雜交產(chǎn)生cd3(上述人源化cd3γδε小鼠)和cd20兩者雙重人源化的小鼠。所得動物表達兩種人源化蛋白。具體地講，為產(chǎn)生人源化cd20小鼠，用從第二氨基酸到3’非翻譯區(qū)下游107bp、橫跨8482bp的對應cd20人編碼區(qū)域(humanchr.11)替換從第二氨基酸(第一氨基酸為met，)到3’非翻譯區(qū)下游167bp、橫跨9312bp的整個小鼠ms4a1(cd20)編碼區(qū)域(murinechr.19)。小鼠和人cd20均具有六個外顯子。用于下述實驗中的動物在cd3和cd20基因座處的替換均為純合的，并通過在各個基因座處修飾過的小鼠雜交產(chǎn)生。

人源化cd3/cd20小鼠經(jīng)皮下植入2×10⁵個經(jīng)人cd20轉(zhuǎn)染的b16f10.9黑素瘤腫瘤細胞。在第0天(腫瘤移植之日)開始，每周兩次用載體(pbs；n＝5)、0.4mg/kg對照ab2(對cd20抗原不顯示交叉反應性的對照抗體；n＝5)、0.4mg/kgab1(抗cd3/cd20雙特異性抗體，參見wo2014121087a1，2014年8月7日公布，n＝5)或0.004mg/kgab1(n＝5)以腹腔內(nèi)給藥方式治療小鼠。測量腫瘤體積，如圖11a中所示。當腫瘤體積大于約1500mm³時殺死小鼠。如圖11a中所示，當治療與腫瘤移植同時開始時，用ab1處理延緩了腫瘤生長。

在單獨的實驗中，還測試了ab1在已成形腫瘤中抑制腫瘤生長的能力(圖11b)。人源化cd3/cd20小鼠經(jīng)皮下植入2×10⁵個表達人cd20的b16f10.9黑素瘤腫瘤細胞。在腫瘤植入后第10天，按照腫瘤大小將小鼠隨機分組成以下治療組，每組5只小鼠：載體(pbs)組、4mg/kg對照ab2(對cd20抗原不顯示交叉反應性的對照抗體)組、4mg/kg的ab1組或0.4mg/kg的ab1組。所有小鼠均用腹腔注射，每周2次。當腫瘤體積大于約1500mm³時殺死小鼠。如圖11b中所示，用ab1治療延緩了已成形腫瘤的腫瘤生長，表明人源化cd3小鼠對早期候選藥物研究是有利的。

等同方案

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，或能夠使用不超過常規(guī)實驗的手段確定本文所述發(fā)明的具體實施例的許多等同方案。這些等同方案旨在包括在以下權(quán)利要求中。

在整個本申請中所引用的所有非專利文獻的整體內(nèi)容、登錄號、網(wǎng)站等、專利申請和專利出于所有目的全文以引用方式并入本文，其程度如同每一篇被單獨引用。如果登錄號或其他引用內(nèi)容在不同時間與不同內(nèi)容相關(guān)，則指在本申請的有效申請日期有效的內(nèi)容，有效申請日期為參考所引用內(nèi)容的最早優(yōu)先權(quán)申請的申請日期，如果該日期不存在，則為實際申請日期。

除非根據(jù)情形顯見，否則任何實施例、方面、元件、特征、步驟等可與任何其他實施例、方面、元件、特征、步驟等組合。

序列表

<110>雷杰納榮制藥公司(regeneronpharmaceuticals,inc.)

<120>表達人源化cd3復合物的非人動物

<130>7310p1

<150>62/083,653

<151>2014-11-24

<150>62/106,999

<151>2015-01-23

<160>35

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>223

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>1

cgactttcttgacttctatttgttaaacactgtgcattcacatcgaatgctagaagtttc60

ctcgtcccgcttcctcctgaattgcctgggatcctctgcttgatgccctgtaggaaacgt120

cctttcctgtggtatagaaatgactgctcgagataacttcgtataatgtatgctatacga180

agttatatgcatggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgc223

<210>2

<211>224

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>2

tgtatcttatcatgtctggaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgctagt60

aactataacggtcctaaggtagcgagctagccttccacagacaccaatgttcaaaatgga120

ggcttgggggcaaaattcttttgctatgtctctagtcgtccaaaaaatggtcctaacttt180

ttctgactcctgcttgtcaaaaattgtgggctcatagttaatgc224

<210>3

<211>227

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>3

aggggagaatggccttcatgcactccctcctcacctccagcgccttgtgttttccttgct60

tagtgatttcccctctccccaccccaccccccacagtgtgtgagaactgcatggagatgg120

atgtgatgtcggtggccataatcatcattgttgacatctgtatcactctgggcttgctga180

tggtcatttattactggagcaagaataggaaggccaaggccaagcct227

<210>4

<211>220

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>4

gaaagagagagtctttctgctaactaacccccagaaggccttccggtctcatgtcctgca60

aagcagtagacgcccaaagccaggagcagagttgcgatgaggtcaatgaagatgacacca120

gccacggtggctggatccagctccacacagctctggcacactgtgggggaagggaggaga180

gaggagaggttgagagcctttaagatcagggaaccatcct220

<210>5

<211>226

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>5

caagagagacagaagtcacaagaaaaagccttcagaaagttccccaccaactgcaggggt60

caagggggacatgaggatgccattcaagcgtcgacgagcgtaggcagcttattgctctgc120

atacttacagaccatttgtgtagtaagggacatgatgccgagtgaaaggggcaggagcaa180

ccagagggagatttcaggaagttctccagggactcgaggttcgtga226

<210>6

<211>224

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>6

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tcatggatttggatctttcttcatcttggcctcaaataaccatg224

<210>7

<211>216

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>7

gcattattgcagacaggcaggagaaaacgaaccaggaaaaacaactttcgcaacctgaag60

gtttgtctctccttttccctacagtgtgtcagaactgcattgaactaaatgcagccacca120

tatctggctttatcttcgctgaggtcatcagcatcttcttccttgctcttggtgtatatc180

tcattgcgggacaggatggacaataccctgtcttaa216

<210>8

<211>356

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>8

cgactttcttgacttctatttgttaaacactgtgcattcacatcgaatgctagaagtttc60

ctcgtcccgcttcctcctgaattgcctgggatcctctgcttgatgccctgtaggaaacgt120

cctttcctgtggtatagaaatgactgctcgagataacttcgtataatgtatgctatacga180

agttatgctagtaactataacggtcctaaggtagcgagctagccttccacagacaccaat240

gttcaaaatggaggcttgggggcaaaattcttttgctatgtctctagtcgtccaaaaaat300

ggtcctaactttttctgactcctgcttgtcaaaaattgtgggctcatagttaatgc356

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>9

cctctgccatgtaggtttgtgtac24

<210>10

<211>27

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>10

tgccgtgatgtttgttcaatgaccaaa27

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>11

gttctgagaaaggcgttcttaagtg25

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>12

ccaggcgtacttgctgttctg21

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>13

tgggcttaccatccaggacga21

<210>14

<211>25

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>14

gctactcttcccacaaactgcttag25

<210>15

<211>25

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>15

ccagcagtaagttccactgttctag25

<210>16

<211>24

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>16

tgtagaaatggctgtgacccagca24

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>17

gggctgtgttgcagtatgac20

<210>18

<211>23

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>18

accgtgcaagttcattatcgaag23

<210>19

<211>24

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>19

acgtgcttcctgaaccctttgggt24

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>20

tctcacatccagaagccctatc22

<210>21

<211>24

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>21

cgagggatgtatcagtgtaaagga24

<210>22

<211>29

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>22

cacagaacaagtcaaaaccactccaagtg29

<210>23

<211>23

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>合成

<400>23

gctcaccagaacagcaaatactg23

<210>24

<211>207

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>嵌合蛋白

<400>24

metargtrpasnthrphetrpglyileleucysleuserleuleuala

151015

valglyvaltrpglyglnaspglyasngluglumetglyglyilethr

202530

glnthrprotyrlysvalserileserglythrthrvalileleuthr

354045

cysproglntyrproglysergluileleutrpglnhisasnasplys

505560

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65707580

hisleuserleulysgluphesergluleugluglnserglytyrtyr

859095

valcystyrproargglyserlysprogluaspalaasnphetyrleu

100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

<210>25

<211>173

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>嵌合蛋白

<400>25

metgluhisserglyileleualaserleuileleuilealavalleu

151015

proglnvalserprophelysileproileglugluleugluasparg

202530

valphevalasncysasnthrserilethrtrpvalgluglythrval

354045

glythrleuleuseraspilethrargleuaspleuglylysargile

505560

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65707580

asplysgluserthrvalglnvalhistyrargmetcysglnsercys

859095

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100105110

ilealathrleuleuleualaleuglyvaltyrcysphealaglyhis

115120125

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165170

<210>26

<211>182

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>嵌合蛋白

<400>26

metgluglnarglysglyleualaglyleupheleuvalileserleu

151015

leuglnglythrleualaglnserilelysglyasnhisleuvallys

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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165170175

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180

<210>27

<211>189

<212>prt

<213>小家鼠

<400>27

metargtrpasnthrphetrpglyileleucysleuserleuleuala

151015

valglythrcysglnaspaspalagluasnileglutyrlysvalser

202530

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354045

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65707580

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115120125

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<213>小家鼠

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權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種經(jīng)遺傳修飾的非人動物，包括經(jīng)遺傳修飾成人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域、人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域和人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性非人類cd3基因座。

2.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的動物，其中所述內(nèi)源性非人cd3基因座經(jīng)遺傳修飾以不表達對應于所述人cd3蛋白的非人cd3蛋白的功能性細胞外結(jié)構(gòu)域。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物，其中所述動物：

在內(nèi)源性cd3ε基因座處包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述核酸序列有效連接至編碼所述內(nèi)源性非人動物的cd3ε的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列，

在內(nèi)源性cd3δ基因座處包含編碼人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述核酸序列有效連接至編碼所述內(nèi)源性非人動物的cd3δ蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列，并且

在內(nèi)源性cd3γ基因座處包含編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述核酸序列有效連接至編碼內(nèi)源性非人動物cd3γ的cd3γ蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；

其中所述非人動物在其t細胞表面上表達嵌合的cd3ε、cd3δ和cd3γ蛋白。

4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的動物，其中所述動物包含人cd3蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域，所述人cd3蛋白包含seqidno:33、seqidno:34和seqidno:35的所述序列。

5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的動物，其中所述動物為哺乳動物。

6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的動物，其中所述動物為嚙齒動物。

7.根據(jù)權(quán)利要求8所述的動物，其中所述動物為小鼠。

8.根據(jù)權(quán)利要求9所述的小鼠，其中所述小鼠包含：

在內(nèi)源性小鼠cd3ε基因座處包含編碼人cd3ε的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述核酸序列有效連接至編碼內(nèi)源性小鼠cd3ε的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列，

在內(nèi)源性小鼠cd3δ基因座處包含編碼人cd3δ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述核酸序列有效連接至編碼內(nèi)源性小鼠cd3δ的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列，并且

在內(nèi)源性小鼠cd3γ基因座處包含編碼人cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列，所述核酸序列有效連接至編碼內(nèi)源性小鼠cd3γ的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸序列，并且

其中所述小鼠在其t細胞表面上表達嵌合的cd3ε、cd3δ和cd3γ蛋白。

9.根據(jù)權(quán)利要求10所述的小鼠，其中所述嵌合的cd3ε蛋白的所述氨基酸序列示于seqidno:24，所述嵌合的cd3δ蛋白的所述氨基酸序列示于seqidno:25，并且所述嵌合的cd3γ蛋白的所述氨基酸序列示于seqidno:26。

10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的動物，所述動物對于所述經(jīng)修飾的內(nèi)源性非人cd3基因座而言為雜合的。

11.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的動物，所述動物對于所述經(jīng)修飾的內(nèi)源性非人cd3基因座而言為純合的。

12.一種制備如前述權(quán)利要求中任一項所述的經(jīng)遺傳修飾的非人動物的方法，包括：

在內(nèi)源性cd3基因座處將編碼人cd3ε、cd3δ和cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域的核酸序列引入非人動物細胞的所述基因組中；以及

由所述細胞繁殖所述經(jīng)遺傳修飾的非人動物。

13.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細胞為單個es細胞，并且所述單個es細胞被引入小鼠胚胎中以繁殖小鼠。

14.一種用于測試基于cd3的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的小鼠模型，其中所述抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合cd3和非小鼠目標抗原兩者，所述小鼠模型包括：經(jīng)遺傳修飾以編碼人cd3ε、cd3δ和cd3γ的細胞外結(jié)構(gòu)域，并且包括表達或包括所述非小鼠目標抗原的細胞的小鼠。

15.根據(jù)權(quán)利要求16所述的小鼠模型，其中所述小鼠如前述權(quán)利要求中任一項所定義。

16.一種篩選靶向目標抗原的候選藥物的方法，包括：

a.將所述目標抗原引入如前述權(quán)利要求中任一項所述的經(jīng)遺傳修飾的小鼠中；

b.使目標候選藥物接觸所述小鼠，其中所述候選藥物針對所述人cd3和所述目標抗原；以及

c.測定所述候選藥物對預防、減少或消除通過所述目標抗原的存在或表達來表征的細胞是否有效。

17.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述引入步驟包括在所述小鼠中表達所述目標抗原。

18.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的方法，其中所述引入步驟包括用所述目標抗原感染所述小鼠。

19.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在所述小鼠中表達所述目標抗原的所述步驟包括遺傳修飾所述小鼠以表達所述目標抗原。

20.根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的方法，其中所述引入步驟包括將表達所述目標抗原的細胞引入所述小鼠中。

21.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求22所述的方法或小鼠模型，其中所述細胞為腫瘤細胞。

22.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求22所述的方法或小鼠模型，其中所述細胞為細菌細胞。

23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述感染包括進行病毒或細菌感染。

24.根據(jù)權(quán)利要求16至25中任一項所述的方法或小鼠模型，其中所述小鼠為具有免疫能力的小鼠。

25.根據(jù)權(quán)利要求16至26中任一項所述的方法或小鼠模型，其中所述目標抗原為腫瘤相關(guān)抗原。

26.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法或小鼠模型，其中所述腫瘤相關(guān)抗原選自alk、bale蛋白、birc5(存活素)、birc7、ca9、calr、ccr5、cd19、cd20(ms4a1)、cd22、cd27、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd52、cd56、cd79、cdk4、ceacam3、ceacam5、clec12a、egfr、egfr變體iii、erbb2(her2)、erbb3、erbb4、epcam、epha2、epha3、fcrl5、flt3、folr1、gage蛋白、gd2、gd3、gpnmb、gm3、gpr112、il3ra、kit、kras、lgr5、ebv衍生的lmp2、l1cam、mage蛋白、mlana、msln、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、muc16、mum1、ankrd30a、ny-es01(ctag1b)、0x40、pap、pax3、pax5、plac1、prlr、pmel、prame、psma(folh1)、rage蛋白、ret、rgs5、ror1、sart1、sart3、slamf7、slc39a6(liv1)、steap1、steap2、tert、tmprss2、thompson-nouvelle抗原、tnfrsf17、tyr、upk3a、vtcn1和wt1。

27.根據(jù)權(quán)利要求16至26中任一項所述的方法或小鼠模型，其中所述目標抗原為傳染性疾病抗原。

28.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法或小鼠模型，其中所述傳染性疾病抗原為病毒抗原。

29.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法或小鼠模型，其中所述病毒抗原選自hiv、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒(例如，hsv-1、hsv-2、cmv、hav-6、vzv、eb病毒)、腺病毒、流感病毒、黃熱病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩基病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流腮病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、htlv、登革病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、jc病毒、埃博拉病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒抗原。

30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法或小鼠模型，其中所述傳染性疾病抗原為細菌抗原。

31.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法或小鼠模型，其中所述細菌抗原選自衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、淋菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫、鉤旋體和萊姆病細菌抗原。

32.根據(jù)權(quán)利要求18至33中任一項所述的方法，其中所述候選藥物為抗體。

33.根據(jù)權(quán)利要求18至33中任一項所述的方法，其中所述候選藥物為抗原結(jié)合蛋白。

34.根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的方法，其中所述候選藥物為雙特異性抗體或雙特異性抗原結(jié)合蛋白。

35.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述雙特異性抗體或所述雙特異性抗原結(jié)合蛋白能夠同時結(jié)合人cd3蛋白和所述目標抗原。

36.根據(jù)權(quán)利要求18至37中任一項所述的方法，其中所述候選藥物能夠識別猴cd3蛋白。

37.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中與不靶向所述目標抗原的試劑相比，所述候選藥物能夠緩解、消除或預防腫瘤生長。

38.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述測定步驟包括腫瘤體積分析。

39.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述測定步驟包括t細胞介導的腫瘤細胞死亡分析。

40.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中與不靶向所述目標抗原的試劑相比，所述候選藥物能夠緩解、消除或預防細菌或病毒感染。

41.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述測定步驟包括測量病毒或細菌滴度。

42.根據(jù)權(quán)利要求16至18所述的方法或小鼠模型，其中所述目標抗原為人目標抗原。