交叉引用

本申請要求2014年11月10日提交的美國臨時申請?zhí)?2/077,774的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其通過引用整體并入本文。

序列表

本申請含有序列表，其已經(jīng)以ascii格式電子地提交，且特此通過引用整體并入。所述ascii副本(創(chuàng)建于2015年11月10日)被命名為p32407wo_pctsequencelisting.txt且具有52,874字節(jié)的大小。

本發(fā)明涉及腎病的非人轉(zhuǎn)基因動物模型和用于鑒別治療劑的方法。

背景技術(shù)：

載脂蛋白l1(apol1)是包括信號肽的6-基因家族中的唯一成員，且與載脂蛋白a1一起，歸入高密度脂蛋白(hdl)顆粒的一個特別致密亞種(hdl3)中(duchateau等人，1997)。apol1是針對非洲錐蟲布魯斯錐蟲布魯斯亞種(trypanosomabruceibrucei)(其為非洲昏睡病的成因)的人先天性免疫應(yīng)答的主要組分。錐蟲的一個亞種，布魯斯錐蟲羅德西亞亞種(t.b.rhodesiense)對野生型apol1(也被稱作g0)具有抗性。但是，apol1的兩個獨特等位基因(被稱作g1和g2)(它們在非洲染色體中常見，但是在歐洲染色體中不存在)賦予對抗布魯斯錐蟲羅德西亞亞種感染的保護(參見us7,585,511、us2012/0128682)。g1和g2等位基因也會增加發(fā)生腎病的風險，且變體與例如局灶性節(jié)段性腎小球硬化(focalsegmentalglomerulosclerosis，fsgs)、高血壓有關(guān)的腎病(hypertensionassociatednephropathy，htn)和hiv有關(guān)的腎病(hivassociatednephropathy，hivan)相關(guān)(參見us2012/0195902、us2012/0003644)。與高加索人相比，在非洲裔美國人中，fsgs更早發(fā)生，且更快4-5倍地發(fā)展成末期腎病(esrd)(hsu等人，2003；kopp等人，2011；parsa等人，2013)。apol1變體與高7倍幾率的“高血壓屬性的”esrd(不論糖尿病狀態(tài))(freedman等人，2010；freedman等人，2011；parsa等人，2013)、高17倍幾率的特發(fā)性fsgs(kopp等人，2011)，和高29倍幾率的hiv相關(guān)的腎病(kopp等人，2011)相關(guān)。所述遺傳關(guān)聯(lián)是關(guān)于常見病的最強曾經(jīng)報道之一，并為非裔美籍人相對于高加索人的更高腎病率提供了解釋。這些疾病造成許多痛苦，并且在美國導(dǎo)致數(shù)百億美元的支出。目前不可得到用于保護過濾器屏障功能和防止腎病的靶向療法。

因此，非常有利的和合乎需要的是，具有用于治療這樣的疾病的治療劑。此外，適合用在將藥劑鑒別為潛在治療劑的方法中的腎病動物模型將是有價值的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種表達apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物以及一種用于制備它們的方法。還提供了一種用于鑒別能夠減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的藥劑的方法。此外，提供了一種分離的抗體，其結(jié)合apol1的人變體。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種表達人apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物表達i)apol1的g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的g2變體(seqidno：03)，iv)apol1的g0變體和apol1的g1變體，v)apol1的g0變體和apol1的g2變體，vi)apol1的g1變體和apol1的g2變體，或vii)apol1的g0變體，apol1的g1變體和apol1的g2變體。在某些實施方案中，所述動物是嚙齒動物。在某些實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物患有腎病。在某些實施方案中，所述腎病是hiv相關(guān)的腎病。在某些實施方案中，所述腎病是多柔比星誘導(dǎo)的腎病。

在另一個方面，本發(fā)明提供了從如本文中所述的非人轉(zhuǎn)基因動物衍生出的細胞或組織。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種確定藥劑是否能夠降低人apol1的血清濃度的方法，所述方法包括以下步驟：測量非人轉(zhuǎn)基因動物中的人apol1的血清濃度，將所述藥劑施用給所述非人轉(zhuǎn)基因動物，和測量所述非人轉(zhuǎn)基因動物中的人apol1的血清濃度，其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物中的人apol1的血清濃度的下降指示，所述藥劑能夠降低人apol1的血清濃度。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物是表達人apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物表達i)apol1的g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的g2變體(seqidno：03)，iv)apol1的g0變體和apol1的g1變體，v)apol1的g0變體和apol1的g2變體，vi)apol1的g1變體和apol1的g2變體，或vii)apol1的g0變體，apol1的g1變體和apol1的g2變體。在某些實施方案中，所述動物是嚙齒動物。在某些實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物患有腎病。在某些實施方案中，所述腎病是hiv相關(guān)的腎病。在某些實施方案中，所述腎病是多柔比星誘導(dǎo)的腎病。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種鑒別能夠減輕腎病進展的藥劑的方法，所述方法包括以下步驟：在非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病，將所述藥劑施用給所述非人轉(zhuǎn)基因動物，和基于所述非人轉(zhuǎn)基因動物的腎的病理學表型評估腎病的進展(如在實施例中所述)，其中與未施用所述藥劑的非人轉(zhuǎn)基因動物相比更低發(fā)展的腎病將所述藥劑鑒別為能夠減輕腎病進展。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物是表達人apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物表達i)apol1的g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的g2變體(seqidno：03)，iv)apol1的g0變體和apol1的g1變體，v)apol1的g0變體和apol1的g2變體，vi)apol1的g1變體和apol1的g2變體，或vii)apol1的g0變體，apol1的g1變體和apol1的g2變體。在某些實施方案中，所述動物是嚙齒動物。在某些實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在某些實施方案中，通過施用多柔比星誘導(dǎo)所述腎病。在某些實施方案中，通過在所述非人轉(zhuǎn)基因動物中表達含有人免疫缺陷病毒的一部分的轉(zhuǎn)基因，誘導(dǎo)所述腎病。在某些實施方案中，所述藥劑結(jié)合i)apol1的人g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的人g0變體和apol1的人g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的人g0變體和apol1的人g2變體(seqidno：03)，或iv)apol1的人g0變體，apol1的人g1變體和apol1的人g2變體。在某些實施方案中，所述藥劑是抗體。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生腎病的動物模型的方法，所述方法包括：在表達人apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病。在某些實施方案中，通過在所述非人動物中表達含有人免疫缺陷病毒的一部分的轉(zhuǎn)基因，誘導(dǎo)所述腎病。在某些實施方案中，通過施用多柔比星誘導(dǎo)所述腎病。在某些實施方案中，以從15mg/kg至40mg/kg的濃度施用多柔比星。在某些實施方案中，以從20mg/kg至30mg/kg的濃度施用多柔比星。在某些實施方案中，以從24mg/kg至26mg/kg的濃度施用多柔比星。在某些實施方案中，以25mg/kg的濃度施用多柔比星。在某些實施方案中，以單次劑量施用多柔比星。在某些實施方案中，將多柔比星施用進尾靜脈。在某些實施方案中，每天用皮下流體處理所述非人動物以防止脫水。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物表達i)apol1的g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的g2變體(seqidno：03)，iv)apol1的g0變體和apol1的g1變體，v)apol1的g0變體和apol1的g2變體，vi)apol1的g1變體和apol1的g2變體，或vii)apol1的g0變體，apol1的g1變體和apol1的g2變體。在某些實施方案中，所述動物是嚙齒動物。在某些實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的抗體，其結(jié)合apol1的人g0變體(seqidno：01)且結(jié)合apol1的人g1變體(seqidno：02)和apol1的人g2變體(seqidno：03)中的一個或兩個。在某些實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在某些實施方案中，所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在某些實施方案中，所述抗體是全長igg1抗體。在某些實施方案中，所述抗體能夠阻斷apol1變體的多聚化。在某些實施方案中，所述抗體能夠降低人apol1的血清濃度。在某些實施方案中，所述抗體能夠減輕腎病的進展。在某些實施方案中，所述腎病是apol1介導(dǎo)的腎病。在某些實施方案中，所述apol1介導(dǎo)的腎病選自：hiv相關(guān)的腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化相關(guān)的腎病、鐮狀細胞腎病、與移植后同種異體移植物損失有關(guān)的腎病和狼瘡腎炎相關(guān)的腎病。在某些實施方案中，所述apol1介導(dǎo)的腎病是高血壓有關(guān)的腎病。在某些實施方案中，所述apol1介導(dǎo)的腎病是糖尿病性腎病。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸，其編碼本文描述的抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其包含上述的核酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)上述宿主細胞從而生產(chǎn)所述抗體。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，其包含如本文中所述的抗體和藥學上可接受的載體。在另一個方面，本發(fā)明提供了用作藥物的如本文中所述的抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供了本文描述的抗體在藥物制備中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過給個體施用本文描述的抗體來治療患有腎病的個體的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種減輕受試者中的腎病進展的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的本文描述的抗體。

附圖說明

圖1顯示了apol1的g0變體(圖1a)、apol1的g1變體(圖1b)和apol1的g2變體(圖1c)的轉(zhuǎn)基因的示意圖。

圖2(a-h)表明，使用超速離心密度梯度，可以在主要脂蛋白種類的hdl3和vhdl級分中檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中的血清學apol1的檢測?？s寫：vldl是極低密度脂蛋白，if是中間級分，hdl是高密度脂蛋白，vhdl是極高密度脂蛋白。

圖3解釋了使用來自apol1的g0變體(野生型)(圖3a)或apol1的g2變體(圖3b)的血清用于標準曲線，通過elisa確定的轉(zhuǎn)基因小鼠和人供體中的血清學apol1濃度。

圖4顯示了通過定量pcr確定的腎、肝和肺中的apol1的表達(圖4a，圖4a’)。使用多克隆抗體執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡，所述多克隆抗體針對來自pbs灌注的小鼠的肝和肺的勻漿物上的apol1(圖4b)。在cho-1k細胞中使用apol1、apol2或?qū)φ账矔r轉(zhuǎn)染的裂解物，使用兔多克隆抗體執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡(圖4c)。

圖5顯示了未治療的轉(zhuǎn)基因的陰性小鼠和表達apol1的g0變體(野生型)和apol1的g2變體的小鼠中的尿蛋白值。

圖6解釋了分別在第5-7天和第9-11天之前不同多柔比星劑量對尿蛋白的影響(n＝3-5/基因型，且平均值是±sem)。

圖7解釋了向25mg/kg的多柔比星短暴露直到7天的影響(圖7a，n＝3-6/用25mg/kg的多柔比星治療的基因型，且平均值是±sem。p-值表示具有相等方差的雙尾t檢驗)。以下動物的蘇木精-曙紅染色的腎組織：用多柔比星治療的轉(zhuǎn)基因陰性動物(圖7b)，用pbs治療的轉(zhuǎn)基因陰性動物(圖7c)，表達apol1的g0變體(野生型)(圖7d，圖7e)或apol1的g2變體(圖7f，圖7g)的轉(zhuǎn)基因小鼠。

圖8顯示了21天以后多柔比星治療的、表達apol1g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠的重量減輕(n＝5/基因型，且平均值是±sem，p-值表示具有相等方差的雙尾t檢驗)。

圖9顯示了用多柔比星治療的、表達apol1的g2變體的小鼠中的蛋白尿。將白蛋白濃度歸一化至肌酸酐水平(n＝3-5/用25mg/kg的多柔比星治療的基因型，且平均值是±sem。p-值表示具有相等方差的雙尾t檢驗)。

圖10顯示了以下小鼠中的足細胞在5000x的透射電子顯微術(shù)圖像：pbs治療的小鼠(圖10a)，多柔比星治療的轉(zhuǎn)基因陰性小鼠(圖10b)，表達apol1的g0變體(圖10c)和apol1的小鼠g2變體(圖10d)的小鼠。進一步描述了多個足突(fp)和插入裂孔隔膜(箭頭)。

圖11(a-t)顯示了在分別用多柔比星或pbs治療的轉(zhuǎn)基因動物中處于不同放大率(5x、20x)和不同染色(h&e、pas、masson氏三色染料)的腎損傷的進展。

圖12(a-c)顯示了在轉(zhuǎn)基因動物中表達的apol1的g0變體和apol1的g2變體對多柔比星誘導(dǎo)的腎病模型中的腎臟疾病進展的影響(n＝9-10/基因型，平均值是±sem，且p-值表示具有相等方差的雙尾t檢驗)。

圖13(a-d)顯示了在非轉(zhuǎn)基因動物中通過腺病毒遞送表達的apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體對多柔比星誘導(dǎo)的腎病模型中的腎臟疾病進展的影響。相對于對照(表達觸珠蛋白相關(guān)蛋白(hpr)的小鼠)顯示了所述影響(n＝6-8/基因型，平均值是±sem，且p-值表示具有相等方差的雙尾t檢驗，頭蓋骨(skull)和十字(crossbone)符號指示在研究結(jié)束之前死亡的動物)。

圖14顯示了apol1構(gòu)建體的示意圖。pfd：形成孔的結(jié)構(gòu)域，mad：膜定位的結(jié)構(gòu)域，sra-id：血清抗性相關(guān)蛋白-相互作用結(jié)構(gòu)域，gpi：糖基磷脂酰肌醇錨，gd：單純皰疹病毒糖蛋白d錨。

圖15描繪了在表達apol1的g0變體(黑色)、apol1的g1變體(灰色)或apol1的g2變體(帶陰影線)的cho細胞上通過facs分析的抗-apol1抗體的交叉反應(yīng)性。在1μg/ml濃度使用抗體。作為陽性對照，使用商購可得的多克隆抗體，其非特異性地結(jié)合載脂蛋白l家族的超過一種成員。在y軸上繪制平均熒光強度(mfi)。

圖16顯示了溶錐蟲活性的體外阻斷的結(jié)果。在有1％正常人血清(nhs)存在下將在小鼠中制備的單克隆抗-apol1抗體加給布魯斯錐蟲布魯斯亞種20小時。以熒光活性(由于基于刃天青的染料(阿拉瑪藍)的存在)的方式測量活錐蟲的數(shù)目。將阻斷活性歸一化至無抗體對照并繪制為活錐蟲的百分比。

具體實施方式

除非另外定義，否則在本文中使用的技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology第2版，j.wiley&sons(newyork，n.y.1994)和march，advancedorganicchemistryreactions，mechanismsandstructure第4版，johnwiley&sons(newyork，n.y.1992)給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了在本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。

i.定義

為了解釋本說明書的目的，以下定義將適用且在適當時，以單數(shù)形式使用的術(shù)語也包括復(fù)數(shù)形式，反之亦然。在下述的任何定義與通過引用并入本文的任何文件沖突的情況下，以下述的任何定義為準。

在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，對“一種蛋白”或一種“抗體”的提及分別包括多種蛋白或抗體；對“一個細胞”的提及包括多個細胞等。

術(shù)語“apol1”或“人apol1”表示人載脂蛋白l1，即作為包括信號肽的6-基因家族中的唯一成員的多肽。在人群中存在三種不同變體，即apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體。apol1的g0變體表示具有seqidno：01的氨基酸序列的野生型人apol1蛋白(在本文中也被稱作“野生型”)。apol1的g1變體表示具有seqidno：02的氨基酸序列的、具有兩個氨基酸置換(s342g，i384m)的人apol1蛋白的變體。apol1的g2變體表示具有seqidno：03的氨基酸序列的、具有兩個氨基酸缺失(n388和y389)的人apol1蛋白的變體。

術(shù)語“檢測”在本文中以最寬的含義用于包括靶分子的定性和/或定量測量，即檢測包括僅僅鑒別靶分子在樣品中的存在以及確定樣品中的靶分子的水平。

本文中使用的術(shù)語“多柔比星”表示具有cas編號23214-92-8的化學化合物。多柔比星在本文中也被稱作或adr。

本文中使用的術(shù)語“腎病”表示其中發(fā)生腎損傷的生理狀況，所述腎損傷破壞它的適當?shù)卣{(diào)節(jié)血液和尿中的溶質(zhì)濃度的能力。這可以通過許多方法(通常包括血清肌酸酐濃度、尿蛋白濃度、尿蛋白與肌酸酐比率)或通過使用示蹤化合物(諸如鄰苯二甲酸酯)來評估。腎病經(jīng)常歸類為明顯不同的臨床狀況，例如局灶性節(jié)段性腎小球硬化、hiv感染、鐮狀細胞貧血、移植后同種異體移植物損失、高血壓、狼瘡腎炎、糖尿病和非糖尿病慢性腎臟疾病。腎病還可以在組織學上歸類為以選自以下一種或多種的病理學變化為特征：腎小球大小、小葉或粘附力、簇的纖維化、bowman氏膠囊的纖維化、膨脹、毛細血管變窄、基膜增厚、在bowman氏空間中的蛋白、增加的細胞構(gòu)成(腎小球系膜的或內(nèi)皮的)、白細胞浸潤、毛細管血栓、小管-萎縮、壞死、空泡和透明微滴變化、基膜增厚、膨脹、腔中的炎癥細胞和脫落物(cast)、間質(zhì)組織-纖維化、水腫、急性和慢性白細胞浸潤、微動脈-纖維化、血栓形成、透明變化和變窄。

本文中使用的術(shù)語“apol1介導(dǎo)的腎病”表示如上定義的腎病，其中apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體中的一種或多種的存在會增加腎病的進展。

術(shù)語“標記”或“可檢測標記”表示可以與要檢測或定量的物質(zhì)(例如，抗體)連接的任何化學基團或部分。通常，標記是適合用于物質(zhì)的靈敏檢測或定量的可檢測標記。可檢測標記的例子包括、但不限于：發(fā)光標記，例如，熒光的、磷光的、化學發(fā)光的、生物發(fā)光的和電化學發(fā)光的標記，放射性標記，酶，顆粒，磁性物質(zhì)，電活性物質(zhì)等?？商鎿Q地，可檢測標記可以通過參與特異性結(jié)合反應(yīng)發(fā)出它存在的信號。這樣的標記的例子包括半抗原、抗體、生物素、抗生蛋白鏈菌素、his-標簽、次氮基三乙酸、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽等。

術(shù)語“多肽”和“蛋白”在本文中互換地用于表示任意長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直鏈的或支鏈的，它可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，且它可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語也包括已經(jīng)天然地或通過干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；⒘姿峄蛉我馄渌僮骰蛐揎?，諸如與標記組分綴合。在該定義內(nèi)還包括，例如，含有一個或多個氨基酸類似物(包括、例如，非天然的氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。本文中使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白”具體地包括抗體。

“純化的”多肽(例如，抗體或免疫粘附素)是指，所述多肽已經(jīng)增加純度，使得它的存在形式比它在它的天然環(huán)境中和/或在實驗室條件下最初合成和/或擴增時更純。純度是一個相對術(shù)語，且不一定是指絕對純度。

“結(jié)合”目標抗原的抗體是這樣的抗體：其以足夠的親和力結(jié)合抗原，使得所述抗體可用作治療劑或測定試劑，例如，用作捕獲抗體或用作檢測抗體。通常，這樣的抗體不會與其它抗原顯著地交叉反應(yīng)。術(shù)語“結(jié)合x的抗體”和“抗-x抗體”應(yīng)當具有相同的含義(其中x是目標抗原(例如蛋白)的名稱)。結(jié)果，術(shù)語“結(jié)合apol1的抗體”可以在本文中與“抗-apol1抗體”可互換地使用。

就多肽與靶分子的結(jié)合而言，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶標上的表位或?qū)ζ洹熬哂刑禺愋浴笔侵?，可測量地不同于非特異性相互作用的結(jié)合?？梢詼y量特異性結(jié)合，例如，通過確定靶分子的結(jié)合相對于對照分子的結(jié)合，所述對照分子通常是不具有結(jié)合活性的類似結(jié)構(gòu)的分子。

“親和力”表示分子(例如，抗體)的單個結(jié)合位點和它的結(jié)合配偶體(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另外指出，否則本文中使用的“結(jié)合親和力”表示反映結(jié)合對(例如，抗體和抗原)的成員之間的1∶1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子x對它的配偶體y的親和力通?？梢杂山怆x常數(shù)(kd)表示。通過本領(lǐng)域已知的常見方法(包括本文描述的那些)，可以測量親和力。

本文中的術(shù)語“抗體”以最寬的含義使用，且包括多種抗體結(jié)構(gòu)，包括、但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。

抗體是具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子，都基于免疫球蛋白折疊。例如，igg抗體具有兩個“重”鏈和兩個“輕”鏈，它們通過二硫鍵鍵合以形成功能性抗體。每個重鏈和輕鏈自身包含“恒定的”(c)和“可變的”(v)區(qū)域。v區(qū)域決定抗體的抗原結(jié)合特異性，且c區(qū)域在與免疫效應(yīng)物的非抗原特異性相互作用中提供結(jié)構(gòu)支持和功能?？贵w或抗體的抗原結(jié)合片段的抗原結(jié)合特異性是抗體的特異性地結(jié)合特定抗原的能力。

抗體的抗原結(jié)合特異性取決于可變或v區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征。術(shù)語“可變”表示這樣的事實：可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在抗體之間存在廣泛的序列差異，并被用在每種特定抗體對它的特定抗原的結(jié)合和特異性中。但是，變異性并不均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。它集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的被稱作高變區(qū)的三個區(qū)段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分被稱作框架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個fr，主要采用β-折疊構(gòu)型，通過三個高變區(qū)連接，這形成β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)連接，且在某些情況下，形成β-折疊結(jié)構(gòu)的組成部分。在每個鏈中的高變區(qū)由fr保持緊密靠在一起，且與來自其它鏈的高變區(qū)一起，促進抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991))。所述恒定結(jié)構(gòu)域直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，諸如所述抗體在抗體依賴性的細胞的細胞毒性(adcc)中的參與。

術(shù)語“高變區(qū)”當在本文中使用時表示負責抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。所述高變區(qū)可以包含來自“互補性決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(例如，在vl中約殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)周圍，和在vh中約31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)周圍(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991))和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基(例如在vl中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)，和在vh中的殘基26-32(h1)、52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和leskj.mol.biol.196：901-917(1987))。

“框架”或“fr”殘基是除了在本文中定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選地包含其抗原結(jié)合區(qū)域。抗體片段的例子包括fab、fab′、f(ab′)2和fv片段；雙體；串聯(lián)的雙體(tadb)、直鏈抗體(例如，美國專利號5,641,870，實施例2；zapata等人，proteineng.8(10)：1057-1062(1995))；一臂抗體，單個可變結(jié)構(gòu)域抗體，微體，單鏈抗體分子；從抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括、但不限于，db-fc、tadb-fc、tadb-ch3、(scfv)4-fc、二-scfv、雙-scfv或串聯(lián)的(雙、三)-scfv)；和雙特異性的t-細胞銜接物(bite)。

抗體的木瓜蛋白酶消化會產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段(被稱作“fab”片段，各自具有單個抗原結(jié)合位點)和一個殘余的“fc”片段(其名稱反映了它的容易結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處理會產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合位點且仍然能夠交聯(lián)抗原的f(ab′)2片段。

“fv”是含有完全抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密地非共價結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。正是在該構(gòu)型，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個高變區(qū)相互作用以限定vh-vl二聚體的表面上的抗原結(jié)合位點。共同地，所述六個高變區(qū)給抗體賦予抗原結(jié)合特異性。但是，甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或fv的一半，其僅包含三個對抗原特異性的高變區(qū))具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管在比整個結(jié)合位點更低的親和力。

所述fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(chl)。fab’片段與fab片段的差別在于幾個殘基在重鏈chl結(jié)構(gòu)域的羧基端處的添加，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。fab′-sh在本文中為fab′命名，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基帶有至少一個游離巰基。f(ab′)2抗體片段最初生產(chǎn)為fab′片段對，所述fab′片段之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)也是已知的。

基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將來自任意脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”分配至兩個明顯不同的種類(被稱作kappa(κ)和lambda(λ))之一。

取決于它們的重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將抗體分配至不同的種類。存在五大類完整抗體：iga、igd、ige、igg和igm，且這些中的幾個可以進一步細分成亞類(同種型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。與抗體的不同種類對應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。

“單鏈fv”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。在某些實施方案中，所述fv多肽還包含在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使scfv能夠形成對于抗原結(jié)合而言期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scfv的綜述，參見plückthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore編，springer-verlag，newyork，第269-315頁(1994)。

術(shù)語“雙體”表示具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，所述片段包含在相同多肽鏈(vh-vl)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)。通過使用因為太短而不允許在相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并建立兩個抗原結(jié)合位點。雙體更完整地描述在，例如，ep404,097；wo93/11161；和hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa，90：6444-6448(1993)中。

術(shù)語“多特異性抗體”以最寬的含義使用，且具體地涵蓋具有多肽特異性的抗體。這樣的多特異性抗體包括、但不限于：包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗體，其中vhvl單元具有多肽特異性；具有兩個或更多個vl和vh結(jié)構(gòu)域的抗體，其中每個vhvl單元結(jié)合不同的表位；具有兩個或更多個單個可變結(jié)構(gòu)域的抗體，其中每個單個可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同的表位；全長抗體；抗體片段諸如fab、fv、dsfv、scfv；雙體，雙特異性的雙體，三體，三功能性抗體，已經(jīng)共價地或非共價地連接的抗體片段。“多肽特異性”表示特異性地結(jié)合相同或不同靶標上的兩個或更多個不同表位的能力?！皢翁禺愋缘摹北硎緝H結(jié)合一個表位的能力。根據(jù)一個實施方案，所述多特異性抗體是以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm、或0.1μm至0.001pm的親和力結(jié)合每種表位的igg抗體。

表述“單結(jié)構(gòu)域抗體”(sdab)或“單個可變結(jié)構(gòu)域(svd)抗體”通常表示其中單個可變結(jié)構(gòu)域(vh或vl)可以賦予抗原結(jié)合的抗體。換而言之，所述單個可變結(jié)構(gòu)域不需要與另一個可變結(jié)構(gòu)域相互作用才能識別靶抗原。單結(jié)構(gòu)域抗體的例子包括從駱駝科(美洲駝和駱駝)和軟骨魚(例如，鉸口鯊)衍生出的那些以及通過重組方法從人類和小鼠抗體衍生出的那些(nature(1989)341：544-546；devcompimmunol(2006)30：43-56；trendbiochemsci(2001)26：230-235；trendsbiotechnol(2003)：21：484-490；wo2005/035572；wo03/035694；febslett(1994)339：285-290；wo00/29004；wo02/051870)。

本文中使用的術(shù)語“單克隆抗體”表示從基本上均勻的抗體群體得到的抗體，即，構(gòu)成所述群體的各個抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，但是在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的可能變體除外，這樣的變體通常以微量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相比，每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性以外，所述單克隆抗體是有利的，因為它們未被其它免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆的”指示所述抗體得自基本上同源的抗體群體的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法生產(chǎn)所述抗體。例如，要根據(jù)本文提供的方法使用的單克隆抗體可以通過kohler等人，nature256：495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組dna方法制備(參見，例如，美國專利號4,816,567)。使用例如在clackson等人，nature352：624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.222：581-597(1991)中描述的技術(shù)，也可以從噬菌體抗體文庫分離“單克隆抗體”。

本文中的單克隆抗體特異性地包括“嵌合的”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的其余部分與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，以及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性(美國專利號4,816,567；morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa81：6851-6855(1984))。本文中的目標嵌合抗體包括“靈長類源化的”抗體，其包含從非人靈長類動物(例如舊大陸猴，諸如狒狒、恒河猴或食蟹猴)衍生出的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(美國專利號5,693,780)。

為了本文中的目的，“完整抗體”是包含重和輕可變結(jié)構(gòu)域以及fc區(qū)的抗體。所述恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，所述完整抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。

“天然抗體”經(jīng)常是約150,000道爾頓的雜四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕(l)鏈和兩個相同的重(h)鏈組成。每個輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間變化。每個重鏈和輕鏈還具有規(guī)則分布的鏈內(nèi)二硫鍵。每個重鏈具有在一端的可變結(jié)構(gòu)域(vh)，繼之以許多恒定結(jié)構(gòu)域。每個輕鏈具有在一端的可變結(jié)構(gòu)域(vl)和在它的另一端的恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。認為特定氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。

“裸抗體”是沒有與異源分子(諸如檢測部分或標記)綴合的抗體(如本文中定義)。

術(shù)語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養(yǎng)物”互換使用，且表示其中已經(jīng)引入了外源核酸的細胞，包括這樣的細胞的后代。宿主細胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細胞”，其包括原代轉(zhuǎn)化的細胞和由其來源的后代(不考慮傳代數(shù))。后代在核酸內(nèi)容物方面可以與親本細胞不完全相同，但是可以含有突變。針對最初轉(zhuǎn)化的細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性的突變體后代被包括在本文中。

“分離的”核酸表示已經(jīng)與它的天然環(huán)境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色體外或在不同于其天然染色體位置的染色體位置。

術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”指抗體重鏈或輕鏈的參與所述抗體與抗原的結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別為vh和vl)通常具有類似的結(jié)構(gòu)，其中每個結(jié)構(gòu)域包含四個保守的框架區(qū)(fr)和三個高變區(qū)(hvr)(參見，例如，kindt等人.kubyimmunology，第6版，w.h.freemanandco.，第91頁(2007))。單個vh或vl結(jié)構(gòu)域可能足以賦予抗原-結(jié)合特異性。此外，結(jié)合特定抗原的抗體可以使用來自結(jié)合所述抗原的抗體的vh或vl結(jié)構(gòu)域分離，以分別篩選互補vl或vh結(jié)構(gòu)域的文庫。參見，例如，portolano等人，j.immunol.150：880-887(1993)；clarkson等人，nature352：624-628(1991)。

本文中使用的術(shù)語“載體”表示能夠擴增與其連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)的載體以及整合進它已經(jīng)引入其中的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的核酸的表達。這樣的載體在本文被稱為“表達載體”。

本文中對“約”值或參數(shù)的提及包括(和描述)指向該值或參數(shù)本身的變化。例如，提及“約x”的描述包括“x”的描述。

ii.動物模型、組合物和方法

a.腎病的動物模型

本文提供了腎病的動物模型。由于apol1僅存在于人類、非洲綠猴和大猩猩中，我們建立了基于轉(zhuǎn)基因動物的動物模型。建立后，所述非人動物僅表達g0、g1或g2中的任一種。但是，通過使所述動物雜交，可能制備表達三種變體的組合的轉(zhuǎn)基因動物。因而，在一個方面，在本文中提供了表達人apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物表達i)apol1的g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的g2變體(seqidno：03)，iv)apol1的g0變體和apol1的g1變體，v)apol1的g0變體和apol1的g2變體，vi)apol1的g1變體和apol1的g2變體，或vii)apol1的g0變體，apol1的g1變體和apol1的g2變體。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物是嚙齒動物。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物選自小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、狗、貓、豬、母牛和山羊。在某些實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物是小鼠。為了提供腎病的模型，所述動物表達apol1，且在非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病。因此，在某些實施方案中，所述人轉(zhuǎn)基因動物患有腎病。存在不同的在非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病的方法。一種可能性是，除了apol1以外，還在非人轉(zhuǎn)基因動物中表達含有人免疫缺陷病毒(hiv)的一部分的轉(zhuǎn)基因。表達hiv轉(zhuǎn)基因會導(dǎo)致急性腎病的發(fā)展。在一個特定實施方案中，所述腎病因此是hiv相關(guān)的腎病。在非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病的另一種可能性是通過化學暴露。多柔比星經(jīng)常在人類中用作化學療法中的藥物。但是，還已知所述物質(zhì)會在動物中誘導(dǎo)腎病。因此，在一個特定實施方案中，本文描述的腎病是多柔比星誘導(dǎo)的腎病。

在另一個方面，本說明書是指從上述的非人轉(zhuǎn)基因動物衍生出的細胞或組織。

如本文證實的，循環(huán)apol1(包括apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體)可以介導(dǎo)腎病的進展。因此，減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的一種可能性是除去循環(huán)apol1。通過抗體與apol1的結(jié)合，可以增加apol1的清除，從而導(dǎo)致降低的apol1的血清濃度，并從而導(dǎo)致減弱的對apol1介導(dǎo)的腎病的進展的影響。因而，在一個方面，提供了確定藥劑是否能夠降低人apol1的血清濃度的方法，所述方法包括下述步驟：測量本文描述的非人轉(zhuǎn)基因動物中的人apol1的血清濃度，將所述藥劑施用給所述非人轉(zhuǎn)基因動物，和測量所述非人轉(zhuǎn)基因動物中的人apol1的血清濃度，其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物中的人apol1的血清濃度的下降指示，所述藥劑能夠降低人apol1的血清濃度。

可替換地，藥劑(諸如抗體)與apol1的結(jié)合可以導(dǎo)致apol1的滅活，即抗體-apol1-復(fù)合物不可具有與單獨的apol1相比相同的生理效應(yīng)，由此減弱對apol1介導(dǎo)的腎病的進展的影響。另一種可能性是，結(jié)合的抗體可以阻止apol1的多聚化并減弱對apol1介導(dǎo)的腎病的進展的影響。

因此，通過基于所述非人轉(zhuǎn)基因動物的腎的病理學表型評估藥劑對apol1介導(dǎo)的腎病的進展的影響，鑒別能夠減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的藥劑將是有利的。因而，在另一個方面，提供了一種鑒別能夠減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的藥劑的方法，所述方法包括以下步驟：在如本文公開的非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病，將所述藥劑施用給所述非人轉(zhuǎn)基因動物，和基于所述非人轉(zhuǎn)基因動物的腎的病理學表型評估apol1介導(dǎo)的腎病的進展，其中與未施用所述藥劑的非人轉(zhuǎn)基因動物相比更低發(fā)展的apol1介導(dǎo)的腎病將所述藥劑鑒別為能夠減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展。如已提及的，存在不同的在非人轉(zhuǎn)基因動物中建立腎病的方法。在一個實施方案中，通過施用多柔比星來誘導(dǎo)腎病。在另一個實施方案中，通過在所述非人轉(zhuǎn)基因動物中表達含有人免疫缺陷病毒的一部分的轉(zhuǎn)基因來誘導(dǎo)腎病。藥劑的減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的能力可以是基于它與人apol1的一種或多種變體的結(jié)合。在一個特定實施方案中，所述藥劑結(jié)合i)apol1的人g0變體(seqidno：01)，ii)apol1的人g0變體和apol1的人g1變體(seqidno：02)，iii)apol1的人g0變體和apol1的人g2變體(seqidno：03)，或iv)apol1的人g0變體，apol1的人g1變體和apol1的人g2變體。在一個特定實施方案中，所述藥劑是抗體。在一個特定實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在一個特定實施方案中，所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在一個特定實施方案中，所述抗體是全長igg1抗體。

此外，本文提供了一種用于產(chǎn)生腎病的動物模型的方法。因而，在一個方面，提供了一種產(chǎn)生腎病的動物模型的方法，所述方法包括：在表達人apol1的非人轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)腎病。在一個特定實施方案中，所述非人動物是如上文中所述的非人轉(zhuǎn)基因動物。在一個特定實施方案中，通過在所述非人動物中表達含有人免疫缺陷病毒的一部分的轉(zhuǎn)基因來誘導(dǎo)腎病。在一個特定實施方案中，通過施用多柔比星來誘導(dǎo)腎病。在一個特定實施方案中，以從10mg/kg至50mg/kg的濃度施用多柔比星。在一個特定實施方案中，以從15mg/kg至40mg/kg的濃度施用多柔比星。在一個特定實施方案中，以從20mg/kg至30mg/kg的濃度施用多柔比星。在一個特定實施方案中，以從24mg/kg至26mg/kg的濃度施用多柔比星。在一個特定實施方案中，以至少25mg/kg的濃度施用多柔比星。在一個特定實施方案中，以25mg/kg的濃度施用多柔比星。測量mg/kg表示施用的多柔比星的質(zhì)量(mg)/動物的體重的質(zhì)量(kg)。在一個特定實施方案中，以多次劑量施用多柔比星。在一個特定實施方案中，以單次劑量施用多柔比星。在一個特定實施方案中，靜脈內(nèi)施用多柔比星。在一個特定實施方案中，將多柔比星施用進尾靜脈。

用多柔比星處理動物會導(dǎo)致脫水。因而，在一個特定實施方案中，每天用皮下流體處理非人動物以防止脫水。在一個特定實施方案中，以0.5-5ml的體積施用皮下流體。在一個特定實施方案中，以1-4ml的體積施用皮下流體。在一個特定實施方案中，以1.5-3ml的體積施用皮下流體。在一個特定實施方案中，以2ml的體積施用皮下流體。在一個特定實施方案中，所述皮下流體是含乳酸鹽的林格氏溶液。

b.示例性的抗-apol1抗體

為了減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展，制備了結(jié)合apol1的抗體。因而，在一個方面，提供了一種分離的抗體，其結(jié)合apol1的人g0變體(seqidno：01)且結(jié)合apol1的人g1變體(seqidno：02)和apol1的人g2變體(seqidno：03)中的一個或兩個。在一個特定實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在一個特定實施方案中，所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在一個特定實施方案中，所述抗體是全長igg1抗體。在一個特定實施方案中，所述抗體能夠阻斷apol1變體的多聚化。在一個特定實施方案中，所述抗體能夠降低人apol1的血清濃度。在一個特定實施方案中，所述抗體能夠減輕腎病的進展。在一個特定實施方案中，所述腎病是apol1介導(dǎo)的腎病。在一個特定實施方案中，所述apol1介導(dǎo)的腎病選自：hiv相關(guān)的腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化相關(guān)的腎病、鐮狀細胞腎病、與移植后同種異體移植物損失有關(guān)的腎病和狼瘡腎炎相關(guān)的腎病。在某些實施方案中，所述apol1介導(dǎo)的腎病是高血壓有關(guān)的腎病。在某些實施方案中，所述apol1介導(dǎo)的腎病是糖尿病性腎病。

此外，在一個方面，提供了一種分離的核酸，其編碼如本文中所述的抗體。在另一個方面，提供了一種宿主細胞，其包含如上所述的核酸。在另一個方面，提供了一種生產(chǎn)抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)上述的宿主細胞從而生產(chǎn)所述抗體。此外，在一個方面，提供了藥物制劑，其包含如本文中所述的抗體和藥學上可接受的載體。此外，在一個方面，提供了用作藥物的如本文中所述的抗體。此外，在一個方面，提供了如本文中所述的抗體在藥物制備中的用途。此外，在一個方面，提供了一種通過給個體施用本文描述的抗體來治療患有腎病的個體的方法。此外，在一個方面，提供了一種減輕受試者中的腎病進展的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的本文描述的抗體。

在本發(fā)明的另一個方面，根據(jù)以上實施方案中的任一個的抗-apol1抗體是單克隆抗體，包括嵌合的、人源化的或人的抗體。在一個實施方案中，抗-apol1抗體是抗體片段，例如，fv、fab、fab’、scfv、雙體或f(ab’)2片段。在另一個實施方案中，所述抗體是全長抗體，例如，完整的igg1抗體或如本文中定義的其它抗體類型或同種型。

在另一個方面，根據(jù)以上實施方案中的任一個的抗-apol1抗體可以包含在下面部分1-7中所述的任意特征(單一或組合)：

1.抗體親和力

在某些實施方案中，本文中提供的抗體具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10^-8m或更小，例如從10^-8m至10^-13m，例如，從10^-9m至10^-13m)的解離常數(shù)(kd)。

在一個實施方案中，通過放射性地標記的抗原結(jié)合測定(ria)測量kd。在一個實施方案中，用目標抗體的fab形式和它的抗原執(zhí)行ria。例如，如下測量fab對抗原的溶液結(jié)合親和力：在有未標記的抗原的滴定系列存在下使fab與最低濃度的(¹²⁵i)-標記的抗原平衡，然后用抗-fab抗體包被的平板捕獲結(jié)合的抗原(參見，例如，chen等人，j.mol.biol.293：865-881(1999))。為了建立測定的條件，將多孔平板(thermoscientific)用在50mm碳酸鈉(ph9.6)中的5μg/ml捕獲抗-fab抗體(cappellabs)包被過夜，并隨后用在pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室溫(大約23℃)封閉2-5小時。在非吸附平板(nunc#269620)中，將100pm或26pm[¹²⁵i]-抗原與目標fab的系列稀釋物混合(例如，與抗-vegf抗體fab-12的評估一致，見presta等人，cancerres.57：4593-4599(1997))。然后將目標fab溫育過夜；但是，所述溫育可以持續(xù)較長時段(例如，約65小時)以確保達到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲平板用于在室溫溫育(例如，1小時)。然后將溶液除去，并將平板用0.1％聚山梨酯20在pbs中的溶液洗滌8次。當平板已經(jīng)干燥時，加入150μl/孔的閃爍劑(microscint-20^tm；packard)，并將平板在topcount^tmγ計數(shù)器(packard)上計數(shù)10分鐘。選擇給出小于或等于最大結(jié)合的20％的每種fab的濃度用在競爭性結(jié)合測定中。

根據(jù)另一個實施方案，使用表面等離子體共振測定測量kd。例如，使用或(biacore，inc.，piscataway，nj)的測定在25℃用固定化的抗原cm5芯片以約10個應(yīng)答單位(ru)進行。在一個實施方案中，根據(jù)供應(yīng)商的說明書，將羧甲基化的葡聚糖生物傳感器芯片(cm5，biacore，inc.)用n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化。將抗原用10mm醋酸鈉(ph4.8)稀釋至5μg/ml(約0.2μm)，隨后以5μl/分鐘的流速注射以實現(xiàn)偶聯(lián)的蛋白的大約10個應(yīng)答單位(ru)。注射抗原以后，注射1m乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團。對于動力學測量，將在具有0.05％聚山梨酯20(tween-20^tm)表面活性劑(pbst)的pbs(pbst)中的fab的兩倍系列稀釋物(0.78nm至500nm)在25℃以大約25μl/min的流速注射。使用簡單的一對一langmuir結(jié)合模型(評價軟件3.2版)，通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖(sensorgram)，計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(kd)計算為比率koff/kon。參見，例如，chen等人，j.mol.biol.293：865-881(1999)。如果通過以上表面等離子體共振測定確定結(jié)合速率超過10⁶m^-1s^-1，那么可以使用熒光淬滅技術(shù)確定結(jié)合速率，所述熒光淬滅技術(shù)在有遞增抗原濃度存在下在25℃測量在pbs(ph7.2)中的20nm抗-抗原抗體(fab形式)的熒光發(fā)射強度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的增加或減少，所述抗原濃度在光譜儀(諸如配備止流閥(stop-flow)的分光光度計(avivinstruments)或具有攪拌型比色皿的8000-系列slm-aminco^tm分光光度計(thermospectronic)中測量。

2.抗體片段

在某些實施方案中，本文提供的抗體是抗體片段?？贵w片段包括、但不限于：fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2、fv和scfv片段以及下面描述的其它片段。關(guān)于某些抗體片段的綜述，參見hudson等人.nat.med.9：129-134(2003)。關(guān)于scfv片段的綜述，參見，例如，pluckthün，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore編，(springer-verlag，newyork)，第269-315頁(1994)；也參見wo93/16185；和美國專利號5,571,894和5,587,458。關(guān)于包含結(jié)合補救受體的表位殘基且具有增加的體內(nèi)半衰期的fab和f(ab’)2片段的討論，參見美國專利號5,869,046。

雙體是具有兩個抗原結(jié)合位點(其可以是二價或雙特異性的)的抗體片段。參見，例如，ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，nat.med.9：129-134(2003)；和hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993)。三體和四體也描述在hudson等人，nat.med.9：129-134(2003)中。

單結(jié)構(gòu)域抗體是這樣的抗體片段：其包含抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分或者輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分。在某些實施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體(domantis，inc.，waltham，ma；參見，例如，美國專利號6,248,516b1)。

可以通過多種技術(shù)制備抗體片段，所述技術(shù)包括、但不限于，如本文中所述的完整抗體的蛋白水解消化以及通過重組宿主細胞(例如，大腸桿菌或噬菌體)的生產(chǎn)。

3.嵌合抗體和人源化抗體

在某些實施方案中，本文提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體描述在，例如，美國專利號4,816,567；和morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa，81：6851-6855(1984))中。在一個實施例中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)(例如，從小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人靈長類動物諸如猴衍生出的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在另一個實施例中，嵌合抗體是“類別轉(zhuǎn)換的”抗體，其中所述類或亞類已經(jīng)從親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。

在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以減少對于人類的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含這樣的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域：其中hvr例如cdr(或其部分)源自非人抗體并且fr(或其部分)源自人抗體序列。人源化抗體任選地也包含人恒定區(qū)的至少一部分。在某些實施方案中，將人源化抗體中的一些fr殘基置換為來自非人抗體(例如，從其衍生出hvr殘基的抗體)的相應(yīng)殘基，例如，以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。

人源化抗體和制造它們的方法綜述在，例如，almagro和fransson，front.biosci.13：1619-1633(2008)，且進一步描述在，例如，riechmann等人，nature332：323-329(1988)；queen等人，proc.nat’lacad.sci.usa86：10029-10033(1989)；美國專利號5,821,337，7,527,791、6,982,321和7,087,409；kashmiri等人，methods36：25-34(2005)(描述了特異性決定區(qū)(sdr)移植)；padlan，mol.immunol.28：489-498(1991)(描述了“表面再建”)；dall’acqua等人，methods36：43-60(2005)(描述了“fr改組”)；和osbourn等人，methods36：61-68(2005)和klimka等人，br.j.cancer，83：252-260(2000)(描述了用于fr改組的“指導(dǎo)選擇”方案)。

可以用于人源化的人框架區(qū)包括、但不限于：使用“最佳擬合”方法選擇的框架區(qū)(參見，例如，sims等人.j.immunol.151：2296(1993))；從輕鏈或重鏈可變區(qū)的特定亞組的人抗體的共有序列衍生出的框架區(qū)(參見，例如，carter等人.proc.natl.acad.sci.usa，89：4285(1992)；和presta等人。j.immunol.，151：2623(1993))；人成熟的(體細胞突變的)框架區(qū)或人種系框架區(qū)(參見，例如，almagro和fransson，front.biosci.13：1619-1633(2008))；和從篩選fr文庫來源的框架區(qū)(參見，例如，baca等人，j.biol.chem.272：10678-10684(1997)和rosok等人，j.biol.chem.271：22611-22618(1996))。

4.人抗體

在某些實施方案中，本文提供的抗體是人抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)生產(chǎn)人抗體。人抗體通常描述在vandijk和vandewinkel，curr.opin.pharmacol.5：368-74(2001)和lonberg，curr.opin.immunol.20：450-459(2008)。

可以通過將免疫原施用給轉(zhuǎn)基因動物來制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)經(jīng)過修飾以響應(yīng)于抗原攻擊而產(chǎn)生完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。這樣的動物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替換內(nèi)源免疫球蛋白基因座或其在染色體外存在或隨機整合進動物的染色體中。在這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠中，內(nèi)源免疫球蛋白基因座通常已經(jīng)被滅活。關(guān)于從轉(zhuǎn)基因動物獲得人抗體的方法的綜述，參見lonberg，nat.biotech.23：1117-1125(2005)。也參見，例如，描述xenomouse^tm技術(shù)的美國專利號6,075,181和6,150,584；描述技術(shù)的美國專利號5,770,429；描述k-m技術(shù)的美國專利號7,041,870；和描述技術(shù)的美國專利申請公開號us2007/0061900)?？梢赃M一步修飾來自從這類動物產(chǎn)生的完整抗體的人可變區(qū)，例如，通過與不同的人恒定區(qū)組合。

還可以通過基于雜交瘤的方法制備人抗體。已經(jīng)描述了用于生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系(參見，例如，kozborj.immunol.，133：3001(1984)；brodeur等人，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，第51-63頁(marceldekker，inc.，newyork，1987)；和boerner等人，j.immunol.，147：86(1991))。在li等人，proc.natl.acad.sci.usa，103：3557-3562(2006)中也描述了通過人b-細胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的人抗體。另外的方法包括例如在以下文獻中描述的那些方法：美國專利號7,189,826(描述了從雜交瘤細胞系生產(chǎn)單克隆人igm抗體)和ni，xiandaimianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人雜交瘤)。在vollmers和brandlein，histologyandhistopathology，20(3)：927-937(2005)以及vollmers和brandlein，methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology，27(3)：185-91(2005)中也描述了人雜交瘤技術(shù)(trioma技術(shù))。

通過分離選自人-來源的噬菌體展示文庫的fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列，也可以產(chǎn)生人抗體。這樣的可變結(jié)構(gòu)域序列隨后可以與期望的人恒定結(jié)構(gòu)域組合。下文描述了用于從抗體文庫選擇人抗體的技術(shù)。

5.文庫來源的抗體

通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體，可以分離本發(fā)明的抗體。例如，本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫并對這類文庫篩選擁有期望的結(jié)合特征的抗體的多種方法。這類方法綜述在，例如，hoogenboom等人.methodsinmolecularbiology178：1-37(o’brien等人，ed.，humanpress，totowa，nj，2001)，且進一步描述在，例如，mccafferty等人，nature348：552-554；clackson等人，nature352：624-628(1991)；marks等人，j.mol.biol.222：581-597(1992)；marks和bradbury，methodsinmolecularbiology248：161-175(lo，編，humanpress，totowa，nj，2003)；sidhu等人，j.mol.biol.338(2)：299-310(2004)；lee等人，j.mol.biol.340(5)：1073-1093(2004)；fellouse，proc.natl.acad.sci.usa101(34)：12467-12472(2004)；和lee等人，j.immunol.methods284(1-2)：119-132(2004)。

在某些噬菌體展示法中，vh和vl基因的組庫分別通過聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)克隆并且在噬菌體文庫中隨機地重組，其隨后可以針對抗原結(jié)合噬菌體進行篩選，如在winter等人，ann.rev.immunol.，12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示抗體片段，作為單鏈fv(scfv)片段或作為fab片段。來自免疫過的來源的文庫會提供針對免疫原的高親和力抗體，無需構(gòu)建雜交瘤。可替換地，可以(例如，從人)克隆原初庫以在沒有任何免疫接種的情況下提供針對廣泛類型的非自身抗原以及自身抗原的抗體的單一來源，如griffiths等人，emboj，12：725-734(1993)所述。最后，通過從干細胞克隆未重排的v-基因區(qū)段并使用含有隨機序列以編碼高度可變的cdr3區(qū)并實現(xiàn)體外重排的pcr引物，也可以合成地產(chǎn)生原初文庫，如hoogenboom和winter，j.mol.biol.，227：381-388(1992)所述。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開包括例如美國專利號5,750,373和美國專利公開號2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

從人抗體文庫分離的抗體或抗體片段被認為是本文中的人抗體或人抗體片段。

6.多特異性抗體

在某些實施方案中，本文提供的抗體是多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，所述結(jié)合特異性之一是針對apol1，且另一個是針對任意其它抗原。在一個特定實施方案中，所述結(jié)合特異性之一是針對apol1，且第二個結(jié)合特異性觸發(fā)含有apol1的hdl顆粒的胞吞作用。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結(jié)合apol1的兩個不同表位。雙特異性抗體可以被制備為全長抗體或抗體片段。

用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括、但不限于重組共表達具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見milstein和cuello，nature305：537(1983))，wo93/08829，和traunecker等人，emboj.10：3655(1991))，和“凸起-進入-孔洞”工程改造(參見，例如，美國專利號5,731,168)。也可以通過以下方式制備多特異性抗體：工程改造靜電操縱效應(yīng)用于制備抗體fc-異源二聚體分子(wo2009/089004a1)；交聯(lián)兩個或更多個抗體或片段(參見，例如，美國專利號4,676,980，和brennan等人，science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)雙特異性抗體(參見，例如，kostelny等人，j.immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“雙體”技術(shù)以制備雙特異性抗體片段(參見，例如，hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa，90：6444-6448(1993))；和使用單鏈fv(sfv)二聚體(參見，例如，gruber等人，j.immunol.，152：5368(1994))；以及制備三特異性抗體，如在例如tutt等人.j.immunol.147：60(1991)中所述。

本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合位點的經(jīng)工程改造的抗體，包括“章魚抗體(octopusantibodies)”(參見，例如，us2006/0025576a1)。

本文中的抗體或片段還包括“雙效fab”或“daf”，其包含結(jié)合apol1以及另一種不同抗原的抗原結(jié)合位點(參見，例如，us2008/0069820)。

7.抗體變體

在某些實施方案中，預(yù)見到本文提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可能合乎需要的是，改善抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學特性。通過向編碼抗體的核苷酸序列中引入適當?shù)男揎椈蛲ㄟ^肽合成，可以制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括，例如，從抗體的氨基酸序列刪除殘基和/或?qū)埢迦胨霭被嵝蛄兄泻?或置換所述氨基酸序列內(nèi)的殘基?？梢灾苽淙笔А⒉迦牒椭脫Q的任意組合以獲得最終構(gòu)建體，前提條件是，所述最終構(gòu)建體具有期望的特征，例如，抗原結(jié)合。

a)置換變體、插入變體和缺失變體

在某些實施方案中，提供了具有一個或多個氨基酸置換的抗體變體。用于置換誘變的目標位點包括hvr和fr。在表1中在“優(yōu)選置換”的標題下顯示了保守置換。在表1中在“示例性置換”的標題下提供了更實質(zhì)性變化，并且參考氨基酸側(cè)鏈類別在下面進一步描述。可以將氨基酸置換引入目標抗體中并且針對期望的活性(例如，保留的/改善的抗原結(jié)合、降低的免疫原性、或改善的adcc或cdc)來篩選產(chǎn)物。

表1

氨基酸可以根據(jù)共同的側(cè)鏈特性分組：

(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性親水的：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性的：asp、glu；

(4)堿性的：his、lys、arg；

(5)影響鏈取向的殘基：gly、pro；

(6)芳族的：trp、tyr、phe。

非保守置換需要將這些分類之一的成員交換為另一個分類的成員。

一類置換變體涉及置換親本抗體(例如，人源化抗體或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進一步研究的所得變體相對于親本抗體在某些生物學特性上具有修飾(例如，改善)(例如，增加的親和力、降低的免疫原性)，和/或具有親本抗體的基本上保留的某些生物學特性。一種示例性的置換變體是親和力成熟的抗體，所述抗體可以例如使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)(諸如本文描述的那些)方便地產(chǎn)生。簡而言之，將一個或多個hvr殘基突變并且將變體抗體在噬菌體上展示和針對特定生物活性(例如結(jié)合親和力)進行篩選。

可以在hvr中做出改變(例如，置換)，例如，以改善抗體親和力。這類改變可以在hvr“熱點”(即，在體細胞成熟過程中以高頻率經(jīng)歷突變的密碼子所編碼的殘基(參見，例如，chowdhury，methodsmol.biol.207：179-196(2008))，和/或接觸抗原的殘基中做出，并對得到的變體vh或vl試驗結(jié)合親和力。通過構(gòu)建次級文庫并從中重新選擇而實現(xiàn)的親和力成熟已經(jīng)描述在，例如，hoogenboom等人.methodsinmolecularbiology178：1-37(o’brien等人，編，humanpress，totowa，nj，(2001))。在親和力成熟的一些實施方案中，通過多種方法(例如，易出錯的pcr、鏈改組或寡核苷酸-指導(dǎo)的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用于成熟的可變基因中。隨后建立次級文庫。隨后篩選該文庫以鑒定具有期望親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及hvr-指導(dǎo)的方案，其中將幾個hvr殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化?？梢蕴貏e地鑒定參與抗原結(jié)合的hvr殘基，例如，使用丙氨酸掃描誘變或建模。特別地經(jīng)常靶向cdr-h3和cdr-l3。

在某些實施方案中，置換、插入或缺失可以出現(xiàn)在一個或多個hvr內(nèi)部，只要這類改變不實質(zhì)上降低抗體的結(jié)合抗原的能力。例如，可以在hvr中做出不實質(zhì)上降低結(jié)合親和力的保守改變(例如，如本文中提供的保守置換)。這類改變可以例如在hvr的抗原接觸殘基的外部。在上文提供的變體vh和vl序列的某些實施方案中，每個hvr未改變或含有不超過一個、兩個或三個氨基酸置換。

一種用于鑒定可以被靶向以便誘變的抗體殘基或區(qū)域的有用方法稱作“丙氨酸掃描誘變”，如cunningham和wells(1989)science，244：1081-1085所述。在這種方法中，鑒定一個殘基或靶殘基組(例如，帶電荷殘基諸如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性的或帶負電荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響?？梢栽趯Τ跏贾脫Q顯示出功能敏感性的氨基酸位置處引入其它置換?？商鎿Q地或額外地，可以使用抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定抗體和抗原之間的接觸點?？梢园邢蚧蛳@類接觸殘基和鄰近殘基作為置換候選物?？梢院Y選變體以確定它們是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括長度在從1個殘基至含有一百個或更多個殘基的多肽的范圍內(nèi)的氨基端和/或羧基端融合體，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有n-端甲硫氨?；鶜埢目贵w?？贵w分子的其它插入變體包括抗體的n-或c-端與酶(例如針對adept的酶)或增加所述抗體的血清半衰期的多肽的融合體。

b)糖基化變體

在某些實施方案中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體被糖基化的程度。通過改變氨基酸序列從而建立或移除一個或多個糖基化位點，可以方便地實現(xiàn)對抗體添加或刪除糖基化位點。

在抗體包含fc區(qū)的情況下，可以改變與之連接的碳水化合物。哺乳動物細胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含分枝的雙天線寡糖，所述寡糖通常借助n-鍵連接至fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的asn297。參見，例如，wright等人.tibtech15：26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙?；咸前?glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及與雙天線寡糖結(jié)構(gòu)的“莖部”中的glcnac連接的巖藻糖。在一些實施方案中，可以修飾本發(fā)明的抗體中的寡糖以便建立具有某些改善的特性的抗體變體。

在一個實施方案中，提供具有碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體變體，所述碳水化合物結(jié)構(gòu)缺少與fc區(qū)(直接地或間接地)連接的巖藻糖。例如，這類抗體中巖藻糖的量可以是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。通過以下方式確定巖藻糖的量：相對于如通過maldi-tof質(zhì)譜法(例如，如wo2008/077546中所述)所測量的與asn297連接的全部糖結(jié)構(gòu)(例如復(fù)雜結(jié)構(gòu)、雜合結(jié)構(gòu)和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和，計算糖鏈內(nèi)在asn297處的巖藻糖的平均量。asn297表示位于fc區(qū)中約位置297處的天冬酰胺殘基(fc區(qū)殘基的eu編號)；但是，由于抗體中的微小序列變異，asn297也可以位于位置297的上游或下游約±3個氨基酸附近，即，在位置294和300之間。這樣的巖藻糖基化變體可以具有改善的adcc功能。參見，例如，美國專利公開號us2003/0157108(presta，l.)；us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.，ltd)。與“去巖藻糖基化的”或“巖藻糖-缺陷型”抗體變體相關(guān)的出版物的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki等人.j.mol.biol.336：1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等人.biotech.bioeng.87：614(2004)。能夠生產(chǎn)去巖藻糖基化抗體的細胞系的例子包括蛋白巖藻糖基化缺陷型的lec13cho細胞(ripka等人.arch.biochem.biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請?zhí)杣s2003/0157108a1，presta，l；和wo2004/056312a1，adams等人，特別在實施例11)，和敲除的細胞系，諸如α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因fut8敲除的cho細胞(參見，例如，yamane-ohnuki等人.biotech.bioeng.87：614(2004)；kanda，y等人，biotechnol.bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和wo2003/085107)。

還可以為抗體變體提供雙分的寡糖，例如，其中與抗體的fc區(qū)連接的雙天線寡糖由glcnac對分。這樣的抗體變體可以具有減少的巖藻糖化和/或改善的adcc功能。這樣的抗體變體的例子例如描述在wo2003/011878(jean-mairet等人)；美國專利號6,602,684(umana等人)；和us2005/0123546(umana等人)。還提供了具有與fc區(qū)連接的、在寡糖中的至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這樣的抗體變體可以具有改善的cdc功能。這樣的抗體變體例如描述在wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju，s.)；和wo1999/22764(raju，s.)。

c)fc區(qū)變體

在某些實施方案中，可以將一個或多個氨基酸修飾引入本文中提供的抗體的fc區(qū)中，由此產(chǎn)生fc區(qū)變體。該fc區(qū)變體可以包含人fc區(qū)序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4fc區(qū))，所述人fc區(qū)序列包含在一個或多個氨基酸位置處的氨基酸修飾(例如，置換)。

在某些實施方案中，本發(fā)明預(yù)見到具有一些但并非全部效應(yīng)子功能的抗體變體，這使所述抗體變體成為下述應(yīng)用的合乎需要的候選物：其中抗體的體內(nèi)半衰期是重要的，而某些效應(yīng)子功能(諸如補體和adcc)是不必要的或有害的。可以實施體外和/或體內(nèi)細胞毒性測定以證實cdc和/或adcc活性的降低/耗盡。例如，可以實施fc受體(fcr)結(jié)合測定以確保抗體缺少fcγr結(jié)合(因此可能缺少adcc活性)，但是保留fcrn結(jié)合能力。用于介導(dǎo)adcc的原代細胞(nk細胞)僅表達fcγriii，而單核細胞表達fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9：457-492(1991)的第464頁上的表3中總結(jié)了造血細胞上的fcr表達。評估目標分子的adcc活性的體外測定的非限制性例子描述在美國專利號5,500,362(參見，例如hellstrom，i.等人.proc.nat’lacad.sci.usa83：7059-7063(1986))和hellstrom，i等人，proc.nat’lacad.sci.usa82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見bruggemann，m.等人，j.exp.med.166：1351-1361(1987))中。可替換地，可以采用非放射性測定方法(參見，例如，用于流式細胞計量術(shù)的actitm非放射性的細胞毒性測定(celltechnology，inc.mountainview，ca；和cytotox非放射性的細胞毒性測定(promega，madison，wi)。用于這樣的測定的有用效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細胞。可替換地或額外地，可以在體內(nèi)評估目標分子的adcc活性，例如，在動物模型中，諸如在clynes等人.proc.nat’lacad.sci.usa95：652-656(1998)公開的動物模型中。也可以實施c1q結(jié)合測定以證實抗體不能結(jié)合c1q且因此缺少cdc活性。參見，例如，wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結(jié)合elisa。為了評估補體激活，可以進行cdc測定(參見，例如，gazzano-santoro等人，j.immunol.methods202：163(1996)；cragg，m.s.等人，blood101：1045-1052(2003)；和cragg，m.s.和m.j.glennie，blood103：2738-2743(2004))。也可以使用本領(lǐng)域已知的方法執(zhí)行fcrn結(jié)合和體內(nèi)清除率/半衰期確定(參見，例如，petkova，s.b.等人，int’l.immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

具有減少的效應(yīng)子功能的抗體包括具有fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個的置換的那些(美國專利號6,737,056)。這樣的fc突變體包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的兩個或更多個位置處的置換的fc突變體，包括將殘基265和297置換成丙氨酸的所謂的“dana”fc突變體(美國專利號7,332,581)。

描述了具有改善的或減少的與fcr的結(jié)合的某些抗體變體。參見，例如，美國專利號6,737,056；wo2004/056312，和shields等人，j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001)。

在某些實施方案中，抗體變體包含具有改善adcc的一個或多個氨基酸置換(例如，在fc區(qū)的位置298、333和/或334(殘基的eu編號)處的置換)的fc區(qū)。

在某些實施方案中，在fc區(qū)中做出改變，其導(dǎo)致改變的(即，提高的或減少的)c1q結(jié)合和/或補體依賴性的細胞毒性(cdc)，例如，如在美國專利號6,194,551、wo99/51642和idusogie等人.j.immunol.164：4178-4184(2000)中所述。

在us2005/0014934a1(hinton等人.)中描述了具有增加的半衰期和提高的與新生兒fc受體(fcrn)的結(jié)合的抗體，所述新生兒fc受體負責母親igg向胎兒的轉(zhuǎn)移(guyer等人，j.immunol.117：587(1976)和kim等人，j.immunol.24：249(1994))。那些抗體包含其中具有一個或多個置換的fc區(qū)，所述置換改善fc區(qū)與fcrn的結(jié)合。這樣的fc變體包括在一個或多個fc區(qū)殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434處具有置換的那些，例如，fc區(qū)殘基434的置換(美國專利號7,371,826)。

關(guān)于fc區(qū)變體的其它例子，也參見duncan&winter，nature322：738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；和wo94/29351。

d)半胱氨酸工程改造的抗體變體

在某些實施方案中，可能合乎需要的是，建立半胱氨酸工程改造的抗體，例如，“硫代mab”，其中抗體的一個或多個殘基用半胱氨酸殘基置換。在特定實施方案中，置換的殘基出現(xiàn)在抗體的可到達位點處。通過用半胱氨酸置換那些殘基，由此使反應(yīng)性巰基位于抗體的可到達位點處并且可以用于將抗體綴合至其它部分(諸如藥物部分或接頭-藥物部分)以產(chǎn)生免疫綴合物，如本文中進一步所述。在某些實施方案中，可以用半胱氨酸置換以下殘基中的任何一個或多個：輕鏈的v205(kabat編號)；重鏈的a118(eu編號)；和重鏈fc區(qū)的s400(eu編號)?？梢匀缋缑绹鴮＠?,521,541中所述產(chǎn)生半胱氨酸工程改造的抗體。

e)抗體衍生物

在某些實施方案中，可以進一步修飾本文提供的抗體以含有本領(lǐng)域已知的且容易得到的額外非蛋白性部分。適合用于衍生化抗體的部分包括、但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括、但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧雜環(huán)戊烷、聚-1，3，6-三氧雜環(huán)己烷、亞乙基/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或無規(guī)共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它們的混合物。由于它在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的優(yōu)點。所述聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。與抗體連接的聚合物的數(shù)目可以變動，并且如果連接超過一個聚合物，它們可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型可以基于以下考慮事項確定：包括、但不限于待改善的抗體的特定特性或功能，抗體衍生物是否將用在確定條件下的療法中等。

在另一個實施方案中，提供了抗體和非蛋白性部分的綴合物，所述非蛋白性部分可以通過暴露于輻射而選擇性地加熱。在一個實施方案中，非蛋白性部分是碳納米管(kam等人，proc.natl.acad.sci.usa102：11600-11605(2005))。所述輻射可以具有任何波長，并包括、但不限于這樣的波長：其不傷害普通細胞，但是其將非蛋白性部分加熱至殺傷在抗體-非蛋白性部分附近的細胞的溫度。

b.重組方法和組合物

使用重組方法和組合物(例如，如在美國專利號4,816,567中所述)，可以生產(chǎn)抗體。在一個實施方案中，提供了分離的核酸，其編碼本文描述的抗-apol1抗體。所述核酸可以編碼包含所述抗體的vl的氨基酸序列和/或包含所述抗體的vh的氨基酸序列(例如，所述抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個實施方案中，提供了一種或多種包含所述核酸的載體(例如，表達載體)。在另一個實施方案中，提供了包含所述核酸的宿主細胞。在一個這樣的實施方案中，宿主細胞包含以下載體(例如，已經(jīng)用以下載體轉(zhuǎn)化)：(1)包含特定核酸的載體，所述核酸編碼包含所述抗體的vl的氨基酸序列和包含所述抗體的vh的氨基酸序列，或(2)第一載體和第二載體，所述第一載體包含特定核酸，所述核酸編碼包含所述抗體的vl的氨基酸序列，所述第二載體包含特定核酸，所述核酸編碼包含所述抗體的vh的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述宿主細胞是真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(cho)細胞或淋巴樣細胞(例如，y0、ns0、sp20細胞)。在一個實施方案中，提供了一種制備抗-apol1抗體的方法，其中所述方法包括在適合表達所述抗體的條件下培養(yǎng)如上所述的包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞，和任選地，從宿主細胞(或宿主細胞培養(yǎng)基)回收抗體。

為了重組生產(chǎn)抗-apol1抗體，將編碼抗體(例如，如上所述)的核酸分離，并將其插入到一種或多種載體中用以在宿主細胞中進一步克隆和/或表達?？梢允褂贸Ｒ?guī)方法容易地對這樣的核酸進行分離和測序(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。

適用于克隆或表達編碼抗體的載體的宿主細胞包括本文中所述的原核和真核細胞。例如，抗體可以在細菌中制備，尤其是在不需要糖基化和fc效應(yīng)子功能時。關(guān)于在細菌中表達抗體片段和多肽，參見，例如，美國專利號5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也參見charlton，methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo，編，humanapress，totowa，nj，2003)，第245-254頁，其描述了抗體片段在大腸桿菌中的表達)。在表達后，抗體可以分離自可溶級分中的細菌細胞糊，并且可以被進一步純化。

除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是編碼抗體的載體的合適克隆或表達宿主，包括其糖基化途徑已經(jīng)被“人源化”的真菌和酵母菌株，從而導(dǎo)致具有部分地或完全地人糖基化模式的抗體的生產(chǎn)。參見gerngross，nat.biotech.22：1409-1414(2004)，和li等人，nat.biotech.24：210-215(2006)。

適合用于表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞的生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒別出眾多可以與昆蟲細胞結(jié)合使用的桿狀病毒菌株，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細胞。

植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。參見，例如，美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)抗體的plantibodies^tm技術(shù))。

脊椎動物細胞也可以用作宿主。例如，適合懸浮培養(yǎng)的哺乳動物細胞系可能是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是用sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1系(cos-7)；人胚腎系(293或293細胞，其描述在例如graham等人，j.genvirol.36：59(1977)中)；幼倉鼠腎細胞(bhk)；小鼠塞爾托利細胞(tm4細胞，其描述在例如mather，biol.reprod.23：243-251(1980)中)；猴腎細胞(cv1)；非洲綠猴腎細胞(vero-76)；人宮頸癌細胞(hela)；犬腎細胞(mdck；水牛鼠肝細胞(brl3a)；人肺細胞(w138)；人肝細胞(hepg2)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562)；tri細胞，其描述在例如mather等人，annalsn.y.acad.sci.383：44-68(1982)中；mrc5細胞；和fs4細胞。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細胞，包括dhfr-cho細胞(urlaub等人，proc.natl.acad.sci.usa77：4216(1980))；和骨髓瘤細胞系諸如y0、ns0和sp2/0。關(guān)于適合用于抗體生產(chǎn)的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見，例如，yazaki和wu，methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo，編，humanapress，totowa，nj)，第255-268頁(2003)。

c.測定

通過本領(lǐng)域已知的各種測定，可以針對它們的物理/化學性能和/或生物活性鑒別、篩選或表征本文中提供的本文提供的抗-apol1抗體。

1.結(jié)合測定和其它測定

在一個方面，針對它的抗原結(jié)合活性試驗本發(fā)明的抗體，例如，通過已知方法諸如elisa、蛋白質(zhì)印跡等，或競爭錐蟲血清抗性抗原(sra)結(jié)合。在另一個方面，可以使用競爭測定來鑒別與如本文中所述的抗體競爭結(jié)合apol1的抗體。在某些實施方案中，這樣的競爭抗體會結(jié)合被如本文中所述的抗體結(jié)合的相同表位(例如，直鏈或構(gòu)象表位)。用于描繪抗體所結(jié)合的表位的詳細示例性方法提供在morris(1996)“epitopemappingprotocols”，methodsinmolecularbiology第66卷(humanapress，totowa，nj)中。

在一種示例性的競爭測定中，將固定化的apol1在溶液中溫育，所述溶液包含結(jié)合至apol1(例如，如本文中所述的抗體)的第一種標記的抗體和第二種未標記的抗體，所述第二種未標記的抗體針對它的與第一抗體競爭結(jié)合apol1的能力進行了試驗。所述第二抗體可以存在于雜交瘤上清液中。作為對照，將固定化的apol1在包含第一種標記的抗體、但是不包含第二種未標記的抗體的溶液中溫育。在允許第一抗體與apol1結(jié)合的條件下溫育以后，將多余的未結(jié)合的抗體除去，并測量與固定化的apol1結(jié)合的標記的量。如果試驗樣品中與固定化的apol1結(jié)合的標記的量相對于對照樣品大幅下降，那么指示，第二抗體與第一抗體競爭對apol1的結(jié)合。參見harlow和lane(1988)antibodies：alaboratorymanual第14章(coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny)。

2.活性測定

在一個方面，提供了用于鑒別具有生物活性的其抗-apol1抗體的測定。生物活性可以包括，例如，結(jié)合apol1，由此降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展。還提供了具有這樣的體內(nèi)和/或體外生物活性的抗體。

在某些實施方案中，針對這樣的生物活性試驗了本發(fā)明的抗體。在某些實施方案中，針對降低apol1的溶錐蟲活性的抗體進行篩選。在某些實施方案中，針對降低apol1在足細胞毒性體外模型中的毒性的抗體進行篩選。在某些實施方案中，如在實施例中所述使用測定。

d.藥物制劑

通過將具有期望純度的這類抗體與一種或多種任選的藥學上可接受的載體(remington’spharmaceuticalsciences第16版，osol，a.編(1980))組合，以低壓凍干制劑或水溶液的形式制備如本文中所述的抗-apol1抗體的藥物制劑。藥學上可接受的載體在采用的劑量和濃度對接受者而言通常是無毒的，且包括、但不限于：緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖類、二糖類和其它碳水化合物類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑諸如edta；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的抗衡離子諸如鈉；金屬絡(luò)合物(例如zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑，諸如聚乙二醇(peg)。示例性的藥學上可接受的載體在本文中還包括間質(zhì)(insterstitial)藥物分散劑，諸如可溶性的中性活性的透明質(zhì)酸酶糖蛋白(shasegp)，例如，人可溶性的ph-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，諸如rhuph20(baxterinternational，inc.)。包括rhuph20在內(nèi)的某些示例性shasegp和使用方法描述在美國專利公開號2005/0260186和2006/0104968中。在一個方面，將shasegp與一種或多種另外的糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。

示例性的低壓凍干的抗體制劑描述在美國專利號6,267,958中。水性抗體制劑包括在美國專利號6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后者制劑包括組氨酸-乙酸鹽緩沖液。

本文中的制劑還可以含有正在治療的特定適應(yīng)癥需要的超過一種活性成分，優(yōu)選地具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些。例如，可能合乎需要的是，進一步提供護理標準。這樣的活性成分適當?shù)匾詫τ陬A(yù)期目的而言有效的量聯(lián)合存在。

活性成分可以包埋在例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊(分別例如，羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊劑)中或在大乳劑中。這樣的技術(shù)公開在remington′spharmaceuticalsciences第16版，osol，a.編(1980)。

可以制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)呈成形制品(例如薄膜或微膠囊)的形式。

要用于體內(nèi)施用的制劑通常是無菌的?？梢匀菀椎貙崿F(xiàn)無菌度，例如，通過穿過無菌過濾膜過濾。

e.治療方法和組合物

本文中提供的任何抗-apol1抗體可以用在治療方法中。

在一個方面，提供了用作藥物的抗-apol1抗體。在其它方面，提供了用于治療腎病的抗-apol1抗體。在某些實施方案中，提供了用在治療方法中的抗-apol1抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用在治療患有腎病的個體的方法中的抗-apol1抗體，所述方法包括給所述個體施用有效量的抗-apol1抗體。在一個這樣的實施方案中，所述方法還包括給所述個體施用有效量的至少一種另外的治療劑，例如，如下所述。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的抗-apol1抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于在個體中降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的方法中的抗-apol1抗體，所述方法包括給所述個體施用有效量的抗-apol1抗體以降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展。根據(jù)以上實施方案中的任一個的“個體”優(yōu)選地是人。

在另一個方面，本發(fā)明提供了抗-apol1抗體在藥物的制造或制備中的用途。在一個實施方案中，所述藥物是用于治療腎病。在另一個實施方案中，所述藥物是用在治療腎病的方法中，所述方法包括給患有腎病的個體施用有效量的藥物。在一個這樣的實施方案中，所述方法還包括給所述個體施用有效量的至少一種另外的治療劑，例如，如下所述。在另一個實施方案中，所述藥物是用于降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展。在另一個實施方案中，所述藥物是用于在個體中降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的方法中，所述方法包括給所述個體施用有效量的藥物以降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展。根據(jù)以上實施方案中的任一個的“個體”可以是人。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療腎病的方法。在一個實施方案中，所述方法包括給患有腎病的個體施用有效量的抗-apol1抗體。在一個這樣的實施方案中，所述方法還包括給所述個體施用有效量的至少一種另外的治療劑，如下所述。根據(jù)以上實施方案中的任一個的“個體”可以是人。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種在個體中降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展的方法。在一個實施方案中，所述方法包括給所述個體施用有效量的抗-apol1抗體以降低apol1的血清濃度和/或減輕apol1介導(dǎo)的腎病的進展。在一個實施方案中，“個體”是人。

在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文中提供的任何抗-apol1抗體的藥物制劑，例如，用在任何以上治療方法中。在一個實施方案中，藥物制劑包含本文中提供的任何抗-apol1抗體和藥學上可接受的載體。在另一個實施方案中，藥物制劑包含本文中提供的任何抗-apol1抗體和至少一種另外的治療劑，例如，如下所述。

本發(fā)明的抗體可以單獨地或與其它藥劑組合地用在療法中。例如，本發(fā)明的抗體可以與至少一種另外的治療劑共同施用。

上面指出的這樣的聯(lián)合治療包括組合施用(其中將兩種或更多種治療劑包括在相同制劑或單獨制劑中)和分開施用，在后一種情況下，本發(fā)明的抗體的施用可以發(fā)生在另外的治療劑或試劑的施用之前、同時和/或之后。在一個實施方案中，抗-apol1抗體的施用和另外的治療劑的施用發(fā)生在彼此的約1個月內(nèi)，或在約1、2或3個周內(nèi)，或在約1、2、3、4、5或6天內(nèi)。

本發(fā)明的抗體(和任何另外的治療劑)可以通過任意合適的方式施用，包括胃腸外、肺內(nèi)和鼻內(nèi)施用，并且，如果需要局部治療，病灶內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。定量給藥可以是通過任意適當?shù)耐緩?，例如通過注射，諸如靜脈內(nèi)或皮下注射，部分地取決于施用是否是短暫的或長期的。各種定量給藥計劃包括但不限于在不同時間點單次或多次施用，推注施用，并且在本文中預(yù)見到脈沖輸注。

以與良好醫(yī)學實踐一致的方式，配制、定量給藥和施用本發(fā)明的抗體。在該背景下考慮的因素包括正在治療的特定障礙、正在治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀況、障礙的起因、藥劑的遞送位點、施用方法、施用調(diào)度和醫(yī)學從業(yè)人員已知的其它因素?？贵w不需要、但任選地與一種或多種當前用于預(yù)防或治療討論的障礙的藥劑一起使用。這樣的其它藥劑的有效量取決于存在于所述制劑中的抗體的量，障礙或治療的類型，和上文討論的其它因素。這些通常以相同劑量并且以本文所述的施用途徑使用，或以本文所述的劑量的約1至99％、或以經(jīng)驗上/臨床上確定為合適的任意劑量和任意途徑使用。

為了預(yù)防或治療疾病，本發(fā)明的抗體(當單獨地或與一種或多種其它另外的治療劑聯(lián)合使用時)的適當劑量將取決于要治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和進程、施用抗體是否為了預(yù)防或治療目的、以前的治療、患者的臨床史和對抗體的應(yīng)答、以及主治醫(yī)師的判斷。適當?shù)貙⒖贵w一次性地或在一系列治療中施用給患者。取決于疾病的類型和嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體可以是用于施用給患者的最初候選劑量，例如，不論通過一次或多次單獨施用，還是通過連續(xù)輸注。一個典型的日劑量可能是在約1μg/kg至100mg/kg或更多的范圍內(nèi)，取決于上面提及的因素。對于在幾天或更長時間內(nèi)的重復(fù)施用，取決于病癥，所述治療通常持續(xù)至發(fā)生疾病征狀的期望抑制?？贵w的一種示例性劑量是在約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍內(nèi)。因而，可以將一劑或多劑約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它們的任意組合)施用給患者?？梢蚤g歇地(例如，每周或每3周)施用這樣的劑量(例如，使得患者接受約2至約20、或例如約6劑抗體)?？梢允┯米畛醯妮^高負荷劑量，繼之以一個或多個較低劑量。通過常規(guī)技術(shù)和測定容易地監(jiān)測該治療的進展。

應(yīng)當理解，使用本發(fā)明的免疫綴合物替代抗-apol1抗體或者與抗-apol1抗體組合，可以實現(xiàn)任何以上制劑或治療方法。

f.制成品

在發(fā)明的另一方面，提供了制成品，其含有用于治療、預(yù)防和/或診斷上文所述的障礙的材料。所述制成品包含容器和貼在容器上或與容器結(jié)合的標簽或包裝說明書。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、靜脈內(nèi)溶液袋等。容器可以由多種材料制成，例如玻璃或塑料。所述容器容納單獨的組合物或與另一種可有效地治療、預(yù)防和/或診斷病癥的組合物組合的組合物，且可以具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的瓶子)。組合物內(nèi)的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體。所述標簽或包裝說明書指示，所述組合物用于治療選擇的病癥。此外，制成品可以包含(a)具有包含在其中的組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)具有包含在其中的組合物的第二容器，其中所述組合物包含另一種細胞毒性治療劑或其它的治療劑。本發(fā)明的該實施方案中的制成品還可以包含包裝說明書，所述包裝說明書指示所述組合物可以用于治療特定病癥?？商鎿Q地，或另外，制品可以進一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含藥學上可接受的緩沖液，諸如抑制細菌注射用水(bwfi)、磷酸鹽緩沖鹽水、含乳酸鹽的林格氏溶液和右旋糖溶液。制品可以進一步包含從商業(yè)和用戶觀點看合乎需要的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。

應(yīng)當理解，任何以上制成品可以包括本發(fā)明的免疫綴合物替代抗-apol1抗體或與抗-apol1抗體組合。

實施例

下面是本發(fā)明的方法和組合物的實施例。應(yīng)當理解，鑒于上文提供的一般描述，可以實施多種其它的實施方案。

倫理

根據(jù)genentechinstitutionalanimalcareandusecommittee(genentech動物實驗管理小組)批準的方案操作所有動物。將小鼠群體維持在genentech的隔離設(shè)施中，符合加利福尼亞州動物護理的法律和倫理標準。

實施例1：apol1轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和基因分型

為了鑒別載脂蛋白l1(apol1)在腎臟疾病進展中的作用，我們使用含有人apol1基因的細菌人工染色體(bac)的44kb部分來制備三個系列的轉(zhuǎn)基因小鼠，其表達apol1的g0變體以及兩種常見序列變體(g1，g2)，所述兩種常見序列變體提供對錐蟲感染的抗性和增加非洲人群中的腎臟疾病風險(kao等人，2008；kopp等人，2008)。

轉(zhuǎn)基因的制備

使用確立的重組方法和galk正和反選擇(基本上如在warming等人，nucleicacidsres2005，v33，e36中所述)，修飾含有人apol1基因(rp11-826p13)的bac(細菌人工染色體)。轉(zhuǎn)化進sw102大腸桿菌中以后和在每個修飾步驟以后，使用spei-消化的bac微量制備dna通過指紋法表征bacdna。由blueheronbiotech/origene合成用于陽性和陰性選擇的兩步盒。每個盒在所述修飾的每一側(cè)上具有約200bp的同源性。將所述盒設(shè)計成允許使用ecori和spei/bamhi位點插入galk選擇標志物以制備陽性選擇盒用于bac修飾和用于隨后無縫除去galk(使用bfuaitypeii限制)，隨后自我連接以制備反選擇盒用于bac修飾。通過noti消化使靶向盒從puc載體主鏈釋放。在該工作中使用的兩個盒的序列被包括在表2中(asci、noti、ecori、bamhi、spei和bfuai的識別序列(ii型酶的上或下鏈)標有下劃線；在g1盒中，編碼兩個g1突變(s342g和i384m)的dna變化以粗體顯示)。

g2突變是氨基酸n388和y389(堿基對aattat)的缺失。g1突變由兩個置換s342g和i384m(分別是agc至ggc和att至atg)組成。從bac除去galk盒以后，使用重組法將apol1bac的經(jīng)修飾的基因組區(qū)域恢復(fù)(亞克隆)進pbr322中，得到44kb轉(zhuǎn)基因。另外，通過從未修飾的apol1bac恢復(fù)來制備對照轉(zhuǎn)基因(野生型)。使用確立的方法，將轉(zhuǎn)基因通過noti消化進行線性化，純化，并顯微注射進來自c57bl/6n小鼠品系的合子中以制備轉(zhuǎn)基因動物。apol1野生型、g1和g2的轉(zhuǎn)基因的示意圖分別描繪在圖1的a-c中。將小鼠維持在c57bl/6背景上。

表2

小鼠的基因分型

通過標準pcr或taqman分析，執(zhí)行apol1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因分型。apol1的g0變體和apol1的g2變體的基因分型使用標準的pcr和針對apol1的引物(正向5’-tttcttgtgctggatgtag-3’(seqidno：08)和反向5’-atatctctcctggtggct-3’(seqidno：09))以及針對taci的內(nèi)部對照(正向5’-tgggtgtcaggttcttgcttcagc-3’(seqidno：10)和反向5’-cagtggatgcgcgcaggac-3’(seqidno：11))。反應(yīng)條件是94℃、4min，隨后是30個在94℃保持60s(變性)、在55℃保持30s(退火)和在72℃保持1min(延伸)的循環(huán)。使用type-itfastsnppcr主混合物(qiagenpn206042)、0.5μm每種引物和0.15μm探針(appliedbiosystems)，將tagman測定用于apol1的g1變體。apol1使用正向引物5’-tgagcagaggagtcaag-3’(seqidno：12)，反向引物5’-tgtggtcacagttcttg-3’(seqidno：13))，和探針5’-6fam-agctaaacatgctcaac-nfq-mgb-3’(seqidno：14)。針對apo的陽性對照使用正向引物5’-cacgtgggctccagcatt-3’(seqidno：15)，反向引物5’tcaccagtcatttctgcctttg-3’(seqidno：16)，和探針5’-vic-ccaatggtcgggcactgctcaa--3’(seqidno：17)。反應(yīng)條件是94℃、4min，隨后是35個94℃、60s(變性)、55℃、30s(退火)和72℃、1min(延伸)的循環(huán)。在ab7900(appliedbiosystems)上讀出使用fam和vic探針的終點pcr以從簇圖辨別等位基因。

實施例2：轉(zhuǎn)基因小鼠和人類中的血清學apol1的分析

用于從血清分級分離主要脂蛋白種類的超速離心密度梯度

根據(jù)mcpherson，等人(mcpherson等人，2007)，制備具有1.006、1.019、1.063和1.24g/ml的密度的kbr/nacl溶液。所有鹽溶液含有0.1％nan3和0.04％edta。用densito30px密度計(mettlertoledo)在25℃確認密度。通過將0.923gkbr加入0.284ml血清和2.556mlh2o中至3ml的終體積，制備具有1.21g/ml的密度的經(jīng)稀釋的血清溶液。制備梯度柱并根據(jù)chapmanmj等人使用蠕動泵(chapman等人，1981)填充。在beckmansw41ti轉(zhuǎn)子上在40,000rpm在15℃執(zhí)行離心＞48h。將級分用蠕動泵收集在1ml體積中，并然后在tris緩沖液(0.04％edta，5mmtris和50mmnacl，ph7.4)中在4℃透析過夜。對于蛋白質(zhì)印跡，將5ml每種級分加載到4-20％tris-甘氨酸凝膠上，用對apol1(proteintech11486-2-ap)、apoa1(rockland600-101-196)和igg(gena931v)特異性的抗體探測。使用eclprime(gehealthcare)檢測免疫反應(yīng)性。

apol1elism

如下開發(fā)apol1夾心elisa：在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(1.59gna2co3，2.93gnahco3，在水中，定量至1l)中在4℃將0.5μg/ml的抗-apol1多克隆抗體(proteintech11486-2-ap)包被在板(thermofisherscientific，464718)上過夜。將包被的板用5％的奶在含有0.05％吐溫20的tris-緩沖鹽水中的溶液封閉。為了制備測定標準曲線，將純化的apol1蛋白(在od280測量其濃度)在魔術(shù)緩沖液(0.5％bsa，0.05％吐溫20，5mmedtaph8，0.25％chaps，0.2％bgg，15ppmproclin在pbs中)中稀釋，并摻入10％小鼠血清(invitrogen，10410)。隨后執(zhí)行4倍系列稀釋以產(chǎn)生從10μg/ml至0.153ng/ml范圍的標準曲線。將實驗性血清樣品在魔術(shù)緩沖液中1∶10稀釋。將預(yù)包被的和預(yù)封閉的板依次與以下物質(zhì)一起溫育：標準曲線或?qū)嶒灅悠罚?.5μg/ml的針對apol1的g0變體的生物素化抗體(其使用含有人apol1異形體1的氨基酸61-398的重組融合蛋白(在genentech制備和純化)在兔中產(chǎn)生)，和過氧化物綴合的抗生蛋白鏈菌素(ge，rpn4401v)的1∶10,000稀釋物。在每個溫育步驟之間將所述板在405^tm微量培養(yǎng)板洗滌器(biotek)上使用含有0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。使用比色測量tmb底物(surmodics，tmbs1000-01)檢測apol1，用1m磷酸停止，并在spectramax250分光光度計(moleculardevices)上讀出。

在分級分離研究和elisa中對比轉(zhuǎn)基因小鼠和人中的血清學apol1

為了確定轉(zhuǎn)基因小鼠中的血清學apol1是否與hdl顆粒相關(guān)(類似于人apol1)，我們使用上述的超速離心密度梯度方法從人血清分級分離了主要脂蛋白種類(圖2a)并將它們與轉(zhuǎn)基因血清進行了對比(圖2e)。我們發(fā)現(xiàn)，如從人血清預(yù)見到的(chapman等人，1981；davidson等人，2009)，apoa1精確地分級分離，從而指示所述方法較好地工作。它主要作為hdl3存在于帶iv和if-c(級分7、8和9)中；較低水平作為hdl2存在于帶iii(級分6)中；大量作為vhdl存在于if-d(級分9和10)中；且apoa1與游離蛋白諸如igg一起沉淀(級分11和12)(圖2c，d)。人血清中的apol1存在于apoa1所在的級分子集中。少量作為hdl3存在于帶iv和if-c(級分8和9)中，而大量作為vhdl存在于if-d和帶v(級分9和10)中以及與游離蛋白一起存在于帶v和沉淀(級分11，12)中(圖2b，d)。與人載脂蛋白相一致，來自轉(zhuǎn)基因小鼠血清的apoa1作為hdl2和hdl3存在于帶iii和iv(級分6、7、8和9)中，而相對較小量作為vhdl存在于if-d(級分10)中，和與未結(jié)合的蛋白諸如igg一起(級分12)(圖2g，h)。轉(zhuǎn)基因小鼠中的apol1主要作為hdl3(級分8和9)和vhdl(if-d，級分10)存在于帶iv中，而相對較小量是在含有未脂質(zhì)化的蛋白的帶v(級分11)中，在apol1的g0變體和apol1的g2變體中是類似的(圖2f)。來自兩個轉(zhuǎn)基因系的apol1和apoa1類似地分級分離。

為了確定我們的轉(zhuǎn)基因小鼠系是否表達與人類類似的apol1濃度，使用如上所述內(nèi)部開發(fā)的特異性夾心elisa，定量轉(zhuǎn)基因小鼠中的循環(huán)apol1水平并與人血清學apol1進行對比。我們將來自非洲裔美國人供體的人血清與表達apol1的g0變體或apol1的g2變體的小鼠以及轉(zhuǎn)基因陰性同胞仔對照進行對比。盡管其他人報道了在386-15，743ng/ml范圍內(nèi)的循環(huán)apol1濃度(duchateau等人，2000；page等人，2006)，但是我們發(fā)現(xiàn)表達apol1的g0變體的動物的血清中的apol1是53-70ng/ml(±10)，表達g2變體的動物中的濃度是93-117(±14)，且人血清中的apol1是99-125(±32)。每種血清的范圍顯示在圖3中，并反映了含有apol1的g0變體(圖3a)或apol1的g2變體(圖3b)的標準曲線的用途?？傊?，我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中的血清學apol1在分級分離研究和elisa中與人apol1類似地表現(xiàn)。

實施例3：轉(zhuǎn)基因小鼠中的apol1的表達

定量pcr

從成年小鼠器官提取總rna(rneasykit，qiagen)，并包括dna酶處理(qiagen)。使用rt-pcr試劑盒(highcapacitycdnareversetranscription；appliedbiosystems)執(zhí)行rt-pcr，并使用購自appliedbiosystems的引物/探針集合針對apol1和mgapdh執(zhí)行定量pcr。

蛋白質(zhì)印跡

按照生產(chǎn)商的說明書使用fugene6(roche)和針對apol1(dna370081，nm_003661)和apol2(dna369843，nm_145637)的cdna(origene)執(zhí)行cho.k1細胞的瞬時轉(zhuǎn)染。將細胞用pbs快速地沖洗，并立即在ripa緩沖液+蛋白酶抑制劑混合液中裂解。對于灌注的組織裂解物，將小鼠用0.1-0.2mlip/20-30g體重的賽拉嗪(1mg/ml)和氯胺酮(100mg/ml)的混合液麻醉，并通過心臟灌注40ml磷酸鹽緩沖鹽水。將肝和肺取出，切成1-mm³塊，在hbss中勻漿化，沉淀，并在ripa緩沖液+蛋白酶抑制劑混合液中裂解。使用雙金雞寧酸(bca)試劑(pierce)確定蛋白濃度。給每個泳道加載30μg足細胞或組織勻漿物、15μg過表達的裂解物和0.1μlapol1轉(zhuǎn)基因小鼠血清或人血清，并使用4-20％tris-甘氨酸或4-12％bis-tris十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠通過電泳進行分離。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(invitrogen)。將印跡在5％的奶在pbs(含有0.05％吐溫-20)中的溶液封閉，然后用apol1抗體(1∶500的sigma-aldrichhpa018885，或1μg/ml的proteintech11486-2ap)探測。如下檢測信號：用辣根過氧化物酶-綴合的第二抗體對第一抗體化學發(fā)光檢測，隨后用ecl-prime試劑(ge)顯影。

足細胞培養(yǎng)和分化

從universityofbristol(bristol，uk)得到有條件地永生化的人sv40^tsa58t/htert足細胞細胞系。將未分化的足細胞在33℃保持在補充了10％fbs(sigma)和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(invitrogen)的rpmi-1640培養(yǎng)基中進行增殖。如在saleem等人(saleem等人，2002)中所述實現(xiàn)足細胞分化，基本上將40-60％匯合的未分化的足細胞熱轉(zhuǎn)換至37℃，并將它們維持另外14天，每周更換培養(yǎng)基3次。

使用定量pcr和蛋白質(zhì)印跡分析確定apol1表達

為了確定表達apol1的轉(zhuǎn)基因小鼠是否具有與人類類似的基因表達模式，我們?nèi)缟纤鲈趲讉€據(jù)報道高度表達apol1的器官(即腎、肺和肝)(genecards，www.genecards.org)上執(zhí)行定量pcr。我們的數(shù)據(jù)指示，在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達與人表達模式相一致。在全腎中存在相對低的表達，在肝(相對于腎88倍)和肺(相對于腎10倍)中具有最大表達(圖4a，a’)。來自小鼠(用pbs灌注以除去循環(huán)apol1)的肺和肝裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析(如上所述)表明，表達的蛋白與基因表達數(shù)據(jù)相關(guān)。使用多克隆抗體(proteintech，11486-2ap)檢測apol1，所述多克隆抗體使用含有人apol1異形體1的n-端238個氨基酸的重組融合蛋白在兔中產(chǎn)生(圖4b)。使用兔多克隆抗體(sigma，hpa018885)在未分化的或分化的人培養(yǎng)的足細胞中和在來自表達apol1的g0變體的轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中檢測apol1。在cho-1k細胞中的apol1、apol2或?qū)φ账矔r轉(zhuǎn)染的裂解物指示，用sigma抗體檢測到apol1和apol2(圖4c)。

實施例4：

化學物誘導(dǎo)的腎病

得到體重為20-25g且年齡為8-12周的雄性小鼠。經(jīng)由每只未麻醉的小鼠的尾靜脈注射多柔比星(再懸浮于溫熱的pbs中至0.5mg/ml；sigmad1515)一次。給年齡匹配的雄性小鼠注射相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水。將所有對照和實驗小鼠單個地圈養(yǎng)，并每天供給2ml含乳酸鹽的林格氏溶液(baxter)。每周從來自每只動物的自發(fā)地排泄的尿評估蛋白尿。使用小鼠白蛋白作為標準品(innovativeresearch)通過酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)測量尿白蛋白，并歸一化至通過比色測量測定(enzolifesciences)測量的肌酸酐。在第21天，將動物稱重，安樂死，并將腎收獲用于組織學。

免疫組織化學分析

對于所有組織學分析，將小鼠通過co2吸入處死，將腎立即解剖，通過浸漬在4％的低聚甲醛在pbs中的溶液中進行固定，在矢向上切割，并處理用于石蠟切片。按照標準方案在3μm切片上執(zhí)行退化的蘇木精和伊紅(h&e)染色。

透射電子顯微術(shù)(tem)

將組織在1/2-強度karnovsky氏固定劑(2％低聚甲醛和2.5％戊二醛在0.1m二甲基胂酸鈉緩沖液中，ph7.2)中固定，在相同緩沖液中洗滌，并在1％四氧化鋨水溶液中后固定1h。然后將樣品通過一系列乙醇和隨后的環(huán)氧丙烷脫水，并包埋在eponate12(tedpella)中。將薄片在切片機(ultracute；reichert)上切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并在顯微鏡(cm12；philips)中檢查。用可收縮的數(shù)字照相機(multiscan；gatan)捕獲圖像。

apol1加速小鼠模型中的腎臟疾病的進展

單獨的apol1表達不會誘導(dǎo)進展至末期腎病(esrd)。在25周齡之前，在表達apol1的g0變體或apol1的g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中的尿蛋白水平是正常的，且白蛋白與肌酸酐之比落到5的值以下(將白蛋白濃度歸一化至肌酸酐水平；n＝3-9/基因型，且平均值是±sem；圖5)。多柔比星誘導(dǎo)的腎病是充分確立的慢性腎臟疾病的嚙齒動物模型，其特征在于足細胞損傷和隨后的腎小球硬化、小管間質(zhì)性炎癥和纖維化(lee和harris，2011)。因此，我們在如上所述的我們的轉(zhuǎn)基因模型中化學誘導(dǎo)了腎病。在一系列初步實驗中，我們通過在8-12周齡的c57bl/6小鼠中的單次尾靜脈注射施用了多柔比星。12或15mg/kg體重的劑量對尿蛋白沒有影響(白蛋白與肌酸酐之比范圍為5-15)(圖6)，且腎組織學在多柔比星治療的小鼠和用pbs治療的同胞仔對照中是不能辨別的(數(shù)據(jù)未顯示)。20mg/kg的中間劑量在第11天之前誘導(dǎo)蛋白尿，但是apol1的存在沒有影響(圖6)。

單次注射25mg/kg的多柔比星以后，在用多柔比星治療的所有小鼠中尿蛋白在第2天之前突然升高，但是在基因型之間沒有顯著差異(圖7a)。蘇木精-曙紅染色的腎組織指示可變的腎病表型。用多柔比星(圖7b)或pbs(圖7c)治療的轉(zhuǎn)基因陰性動物是不能辨別的且不會表現(xiàn)出腎病。但是，表達apol1的g0變體(圖7d)或apol1的g2變體(圖7f，g)的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出腎小管擴張、腎小管壞死、蛋白性脫落物(cast)和腎小管細胞萎縮。但是，并非所有轉(zhuǎn)基因陽性小鼠表現(xiàn)出腎病(圖7e)，也沒有觀察到對腎小球的任何明顯損傷。在這些研究中，我們觀察到在治療組中和特別在apol1表達陽性的那些中顯著的重量減輕和死亡。

由于減少的水合和血流可以導(dǎo)致更快速的腎衰退和過早死亡，我們在另外每天施用皮下流體的同時重復(fù)了較高劑量的多柔比星。這允許所有小鼠存活直到第21天研究結(jié)束時。在研究結(jié)束時，與apol1的g0變體轉(zhuǎn)基因小鼠(10％)或轉(zhuǎn)基因陰性動物(11％)相比，用多柔比星治療的小鼠具有17％的顯著重量減輕(圖8)。在第11天在表達g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中尿白蛋白也顯著升高，具有6609的平均白蛋白與肌酸酐之比，比轉(zhuǎn)基因陰性小鼠高5.2倍(p＝0.002)。蛋白尿在第18天在這些小鼠中保持較高，具有6146的平均白蛋白與肌酸酐之比，比治療的轉(zhuǎn)基因陰性動物高3.9倍(p＝0.02)。尿白蛋白在多柔比星治療的表達apol1的g0變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有明顯更高，但值是多柔比星治療的轉(zhuǎn)基因陰性動物和表達g2變體的小鼠之間的中間值(表達apol1的g0變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中的平均白蛋白與肌酸酐之比在第11天是2768和在第18天是2880)。pbs治療的對照保持正常(圖9)。此外，tem分析揭示了pbs治療的小鼠中足細胞向規(guī)則分布的足突的確立，而用多柔比星治療的動物表現(xiàn)出足細胞足突消失，這是蛋白尿性腎小球疾病的不變特征(圖10)。如上所述執(zhí)行tem分析。

為了評估升高的尿白蛋白值是否與多柔比星治療的腎中的組織病理學相關(guān)，將小鼠在多柔比星治療以后第21天取下，并用蘇木精和伊紅(h&e)、過碘酸-希夫(pas)和masson氏三色染料染色。定性地，蘇木精-曙紅將蛋白和細胞核染色，pas將基膜染色，而三色將間質(zhì)性纖維化和基膜染色。盡管所有多柔比星治療的動物表現(xiàn)出一些病變，但是基因型之間的差異是在病變的嚴重程度和分布上，而不是在病變本身，并且表達apol1的g0變體的多柔比星治療的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因陰性和apol1g2轉(zhuǎn)基因小鼠的中間病理學表型。蘇木精-曙紅染色的腎的低放大率圖像表現(xiàn)出相對于pbs治療的小鼠的分級損傷進展(圖11a)，在非轉(zhuǎn)基因小鼠中的損傷是最小量(圖11b)，在表達apol1的g0變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中是中等(圖11c)，且在表達apol1的g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中是最嚴重的(圖11d)，在方案中，在第0天靜脈內(nèi)遞送單次劑量的多柔比星，在第21天取下，并每天施用皮下流體以防止脫水(圖11e)。用h&e(圖11f-j)、過碘酸-希夫染料(圖11k-o)和masson氏三色染料(圖11p-s)染色的多柔比星治療的腎的較高放大率證實，與正常的腎小球(圖11f、k、p)相比，多柔比星治療的動物呈現(xiàn)fsgs(圖11g-j，l-o，q-s)。bowman氏空間被擴張并填充蛋白性流體(圖11h，星)；存在主要由淋巴細胞構(gòu)成的輕度小管間質(zhì)性浸潤(圖11i，白色asterix)；蛋白積累在擴張的近側(cè)小管中(圖11o，十字)；且在近側(cè)上皮細胞的細胞質(zhì)中存在透明(蛋白)微滴的積累(圖11o，黑色箭頭)。病理學評分表明，與轉(zhuǎn)基因陰性對照或表達apol1的g0變體的小鼠相比(p＝0.03)，在表達apol1g2的多柔比星治療的小鼠中存在顯著更大的損傷(p＝0.00034)(圖11t)。

在所有多柔比星治療的小鼠中，蛋白性流體存在并擴大bowman氏空間。存在局灶性節(jié)段性腎小球硬化，其不定地影響全腎內(nèi)的腎小球簇。近側(cè)小管擴張并填充蛋白性流體和蛋白脫落物(casts)，且近側(cè)上皮細胞的細胞質(zhì)填充蛋白小球。在遍布腎的多個病灶中，存在主要由淋巴細胞構(gòu)成的輕度小管間質(zhì)性浸潤。應(yīng)用下述分級系統(tǒng)來確定腎的病理學表型，以便評估apol1介導(dǎo)的腎病的進展。在0-4量表上分級腎的四種主要結(jié)構(gòu)。0代表正常且4代表嚴重變化。對于每只動物檢查至少10個腎小球?？偡旨壥腔谒凶兓囊话阌∠?，并考慮受影響的適當結(jié)構(gòu)在整個切片中的比例。如下為每個組分分級變化：

1.腎小球-大小、小葉、粘附力、簇的纖維化、bowman氏膠囊的纖維化、膨脹、毛細血管變窄、基膜增厚、在bowman氏空間中的蛋白、增加的細胞構(gòu)成(腎小球系膜的或內(nèi)皮的)、白細胞浸潤、毛細管血栓

2.小管-萎縮、壞死、空泡和透明微滴變化、基膜增厚、膨脹、炎癥細胞和腔中的脫落物(casts)

3.間質(zhì)組織-纖維化、水腫、急性和慢性白細胞浸潤

4.微動脈-纖維化、血栓形成、透明變化和變窄

用較大的動物組群執(zhí)行一個單獨的研究。在第0天靜脈內(nèi)(iv)遞送單次劑量的多柔比星，在第28天取下，并每天施用皮下流體以防止脫水(圖12a)。歸一化至肌酸酐水平的尿白蛋白在apol1g2變體中升高，且與轉(zhuǎn)基因的陰性對照相比(p＝0.05，圖12b)。與表達apol1的g0變體的小鼠的升高的尿白蛋白值和疾病進展有關(guān)的組織病理學是表達apol1的g2變體的小鼠的中間值，且與轉(zhuǎn)基因的陰性對照進行對比。病理學評分指示，與轉(zhuǎn)基因的陰性對照相比，在多柔比星治療的表達apol1的g0變體(p＝0.003)或apol1的g2變體(p＝0.0005)的小鼠中存在顯著更大的損傷(圖12c)。與以前的研究相一致，尿白蛋白在表達apol1的g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠中在第18天顯著升高，具有5964的平均白蛋白與肌酸酐之比，比轉(zhuǎn)基因陰性小鼠高2倍(p＝0.05)。盡管尿蛋白尿的升高在表達apol1的g0變體的小鼠中與非轉(zhuǎn)基因動物相比不是顯著的，在28-天研究結(jié)束時的病理學評分指示與轉(zhuǎn)基因陰性動物相比疾病的顯著進展，其為轉(zhuǎn)基因陰性動物和表達apol1的g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠的中間值。

實施例5：apol1腺病毒遞送

使用腺病毒表達apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體。vectorbiolabs將apol1變體克隆進腺病毒載體中，生產(chǎn)，并滴定。在每只小鼠中在d(-)2和d14通過尾靜脈注射用1x10⁸pfu(在無菌pbs中調(diào)至100μl)實現(xiàn)腺病毒遞送。如上所述在d0執(zhí)行多柔比星誘導(dǎo)的腎病(參見實施例4)。每天施用皮下流體以防止脫水，在第d11和d18收集尿并在第28天取下(圖13a)。歸一化至肌酸酐水平的尿白蛋白在apol1的g0變體(p＝0.05)和g1(p＝0.03)變體中顯著升高，且與轉(zhuǎn)基因的陰性對照相比(圖13b)。與升高的尿白蛋白值和病理學評分相關(guān)的組織病理學揭示，與轉(zhuǎn)基因的陰性對照相比，在表達apol1的g0變體(p＝0.004)、apol1的g1變體(p＝0.000085)和apol1的g2變體(p＝0.03)的小鼠中觀察到顯著更大的損傷(圖13c)。apol1的水平在大多數(shù)注射了腺病毒構(gòu)建體的小鼠中較高。在尿分析和病理學評分中僅包括在第一次注射以后表達apol1的動物(圖13d)。相對于作為對照的表達觸珠蛋白相關(guān)蛋白(hpr)的小鼠顯示了apol1變體的作用。hpr是對人類特異性的血清分泌型蛋白，且通常不在小鼠中表達。總之，apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體遞送的apol1向肝的腺病毒表達證實，apol1的血清學表達會加速腎臟疾病的進展。

實施例6：制備識別apol1的抗體

通過任何標準雜交瘤方法，包括、但不限于，給小鼠或倉鼠注射重組apol1蛋白(g0、g1和g2)，產(chǎn)生針對g0、g1和g2變體的單克隆抗體。另外，對小鼠進行在合適遞送載體(pcaggs)中編碼apol1或它的g1和g2變體的dna序列的流體動力學遞送。

如下所述執(zhí)行抗體篩選。在原始抗原上使用標準的elisa選擇陽性雜交瘤。因此，將包被了apol1g0、g1或g2(具有n-端his或flag表位標簽的氨基酸d61-l398)的平板封閉，結(jié)合至雜交瘤上清液并用hrp--綴合的抗-小鼠檢測。

然后，執(zhí)行sra(血清抗性相關(guān)的蛋白)封閉elisa，以鑒別阻止apol1的sra-相互作用結(jié)構(gòu)域與sra的結(jié)合的抗體，因為該亮氨酸拉鏈區(qū)域也可能介導(dǎo)與其它仍然有待鑒別的蛋白的結(jié)合以介導(dǎo)腎機能障礙。對于封閉elisa，將apol1-flag包被的平板封閉，并與預(yù)結(jié)合至抗體上清液的sra-his一起溫育。用hrp--綴合的抗-his標簽抗體和tmb底物檢測在有sra-his(即非-sra-id封閉抗體)存在下的任何抗體結(jié)合。

隨后，使用人血清的apoa1-apol1夾心elisa鑒別能夠識別血清的hdl顆粒內(nèi)的apol1的抗體。為此目的，將平板用多克隆山羊抗-apoa1抗體包被，封閉，并在不含去污劑的緩沖液(以維持hdl顆粒完整性)中與人血清一起溫育以捕獲hdl顆粒。然后將抗-apol1單克隆溫育，并用hrp抗-小鼠檢測任何結(jié)合的抗體。如果必要的話，可以在人apol1g1和/或g2血清上進一步試驗陽性抗體。

接著，通過標準交叉-封閉elisa執(zhí)行表位結(jié)合。為此目的，可以使用任何標準方法，諸如第一抗體與重組apol1的結(jié)合，隨后與生物素化的第二抗體一起溫育，并用抗生蛋白鏈菌素-hrp檢測以確定哪些抗體競爭相同的apol1表位。

對于表位作圖，將在它們的表面上穩(wěn)定地表達可誘導(dǎo)的apol1或其片段(通過c-端工程改造的糖基磷脂酰肌醇錨)的cho細胞與雜交瘤上清液一起溫育，隨后與alexa647抗-小鼠一起溫育，以鑒別它們結(jié)合哪些結(jié)構(gòu)域。使用apol1(具有n-端單純皰疹病毒糖蛋白d(gd)表位標簽，包括它的信號序列和c-端糖基磷脂酰肌醇錨以將它錨定至細胞表面)慢病毒制備以多西環(huán)素可誘導(dǎo)的方式穩(wěn)定地表達apol1g0、g1或g2全長或結(jié)構(gòu)域片段的cho細胞從而克服毒性問題。使用下述構(gòu)建體：全長＝d610-l398；形成孔的結(jié)構(gòu)域+膜定位的結(jié)構(gòu)域＝氨基酸d61-e308；膜定位的結(jié)構(gòu)域+sra-相互作用結(jié)構(gòu)域＝g231-l398；僅sra-id＝r305-l398。

關(guān)于apol1活性的基于細胞的測定包括以下：

a)膜電位測定，其使用多西環(huán)素-可誘導(dǎo)的表達trpc6的、用卡巴膽堿刺激的穩(wěn)定293細胞。在有抗-apol1抗體存在下測定apol1的任何作用(在有或沒有podocin表達存在下)以鑒別抑制apol1對trpc6信號傳遞的作用的任一種。

b)在有抗-apol1抗體存在下測定重組apol1對人永生化的足細胞的肌動蛋白細胞骨架(alexa鬼筆環(huán)肽染色)的任何作用以確定任一種是否抑制apol1的作用。

c)腺病毒表達的apol1(特別是g1變體)破壞人永生化的足細胞的溶酶體完整性，如使用胞飲細胞染料(螢光黃ch)和酸示蹤劑lysotrackerred所評估的。理想地，使用來自被感染的足細胞的條件培養(yǎng)基從而使與抗-apol1抗體一起的預(yù)溫育能夠鑒別抑制對溶酶體的作用的任一種。

在體內(nèi)效力模型中試驗了針對不同結(jié)構(gòu)域的潛在候選抗體，即針對它們在apol1(g0、g1和g2)轉(zhuǎn)基因小鼠中抑制apol1增強的多柔比星誘導(dǎo)的蛋白尿的能力。在體內(nèi)試驗了來自不同表位的候選抗體，優(yōu)選阻斷sra結(jié)合或基于細胞的測定之一的那些。如上所述給表達apol1的g0變體、apol1的g1變體和apol1的g2變體的轉(zhuǎn)基因小鼠施用多柔比星以誘導(dǎo)腎病，如通過蛋白尿(尿中增加的白蛋白：肌酸酐比率)所評估的。如本文證實的，apol1的g0變體與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比增加蛋白尿，且apol1的g2變體具有甚至更大的作用。監(jiān)測針對apol1的抗體逆轉(zhuǎn)這種apol1介導(dǎo)的蛋白尿增加的能力。

用于體內(nèi)活性的pd標志物還包括監(jiān)測血清apol1水平以確定含有apol1的hdl顆粒是否被消除。因此，使用本文描述的apol1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在抗體施用以后在適當?shù)拈g隔抽取血液用于通過夾心elisa評估apol1水平以確定apol1是否從循環(huán)中消除。將兔多克隆apol1包被在平板上，封閉，并在有去污劑存在下與小鼠血清一起溫育，并用針對非競爭表位的生物素化的兔多克隆apol1檢測。用抗生蛋白鏈菌素-hrp檢測結(jié)合，并與重組apol1標準品進行對比以確定相對血清水平。

盡管為了清楚理解的目的已經(jīng)通過具體說明和實施例對前述發(fā)明進行了比較詳細的描述，但是所述描述和實施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內(nèi)容明確地通過引用以它們的整體并入。

實施例7：制備和表征apol1抗體

ribi佐劑來自sigma(目錄號6322)，完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑(cfa/ifa)來自bectondickinson(bd，目錄號231141/263910)，在tolllike受體(tlr)-混合液中使用的佐劑是來自invivogen(目錄號tlrl-1826-1)的cpg、來自invivogen(目錄號tlrl-r848)的r848、來自invivogen(目錄號vac-pic)的聚i：c和來自sigma(目錄號l6895)的單磷酰脂質(zhì)a(mpl)，clonacell-hy培養(yǎng)基b(目錄號03802)、培養(yǎng)基c(目錄號03803)、培養(yǎng)基d(目錄號03804)和培養(yǎng)基e(目錄號03805)來自stemcelltechnologies。用于電融合的cytofusionmediumc(目錄號lcm-c)來自cytopulsesciences。山羊抗-小鼠iggfc辣根過氧化物酶綴合的抗體來自sigma(目錄號a2554)。3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)電導(dǎo)率單組分hrp微孔底物(目錄號tmbw-1000-01)和tmb終止試劑(目錄號bstp-1000-01)來自biofxlaboratories。

體內(nèi)免疫接種

關(guān)于流體動力學尾靜脈注射(htv)免疫接種，通過尾靜脈注射以2.0ml的總體積在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中用與1μggm-csf混合的50μg/小鼠的apol1g1或g2dna構(gòu)建體(在下面表3中描繪的序列)免疫balb/c小鼠。每2周執(zhí)行注射，共6次注射。

關(guān)于蛋白免疫接種，取決于佐劑，每只小鼠用10或50μg/注射的重組人apol1g0(氨基酸d61-l398)免疫balb/c小鼠。關(guān)于ribi佐劑(sigma)和tlr-混合液佐劑(10μgcpg+10μg聚i∶c+20μgr848+50μgmpl)，可替換地腹膜內(nèi)地(ip)、皮下地(sc)或在尾巴根部(bot)以3-4天間隔注射在100μl佐劑/小鼠中的共10μg抗原，共16次注射。關(guān)于cfa/ifa佐劑，每2周腹膜內(nèi)地(ip)注射在100μl佐劑/小鼠中的50μg抗原，共7次增強。最終的融合前(pre-fusion)注射以后3天，收獲來自小鼠脾和淋巴結(jié)的淋巴細胞。

融合和elisa篩選

使用cytopulseceef-50設(shè)備(cytopulsesciences)使分離的小鼠淋巴細胞與pu-1骨髓瘤細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)融合。用cytofusionmediumc洗滌2次以后，將分離的淋巴細胞和pu-1細胞以1∶1比率混合，并然后以1000萬個細胞/ml再懸浮在cytofusionmediumc中。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書執(zhí)行電融合。將融合的細胞在7％c02培養(yǎng)箱中在clonacell-hymediumc中在37℃培養(yǎng)過夜。次日，將融合的細胞離心，并然后再懸浮于10mlclonacell-hymediumc中，并然后與90ml基于甲基纖維素的clonacell-hymediumd一起輕輕混合。將細胞鋪板在omni盤(目錄號10026，nunc)中，并允許在7％co2培養(yǎng)箱中在37℃生長。溫育6-7天以后，用clonepixfl(genetix，英國)挑取單個雜交瘤克隆并轉(zhuǎn)移進含有200μl/孔的clonacell-hymediume的96-孔細胞培養(yǎng)板(#353075，bectondickinson)中。培養(yǎng)6-7天以后，通過elisa篩選雜交瘤上清液。還將針對apol1g0的所有elisa陽性克隆的上清液收集用于流式細胞計量術(shù)測定。

如下執(zhí)行elisa測定。以100μl/孔的終體積用在0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)中的1μg/ml的apol1go、g1或g2在4℃包被96-孔微量滴定elisa平板(greiner，德國)過夜。用洗滌緩沖液(0.05％的吐溫20在pbs中的溶液，sigma)洗滌3次以后，將平板用200μl含有bsa的elisa測定稀釋劑封閉。加入100μl培養(yǎng)的上清液或稀釋的純化的mab并在室溫溫育1小時。將平板洗滌3次并與hrp綴合的山羊抗-小鼠iggfc一起溫育1小時。洗滌3次以后，通過以100μl/孔的終體積加入tmb底物(biofxlaboratories，md，usa)5min，檢測結(jié)合的hrp。通過加入100μl/孔的停止試劑(biofx，laboratories，md，usa)，停止反應(yīng)。在sunrisetecan平板讀數(shù)器上檢測od630。

mab純化和同種型確定

通過蛋白a親和色譜法純化雜交瘤上清液，然后無菌過濾(0.2μm孔徑，nalgenuncinternational，ny，usa)并在4℃在pbs中保存。在功能測定中進一步試驗之前，通過elisa證實純化的mab與apol1的結(jié)合。

通過小鼠單克隆抗體同種型確定試劑盒(rochediagnostics)，確定純化的mab的同種型。

細胞系和構(gòu)建體

全長apol1蛋白可以細分成4個結(jié)構(gòu)域(圖14)：信號序列，1-27氨基酸(aa)，形成孔的結(jié)構(gòu)域(pfd)，60-235氨基酸，膜定位的結(jié)構(gòu)域(mad)，240-303氨基酸，和sra-相互作用結(jié)構(gòu)域(sra-id)，339-398氨基酸(圖14a)。由于apol1過表達經(jīng)常是有毒的，通過病毒感染制備穩(wěn)定的多西環(huán)素-可誘導(dǎo)的表達apol1的cho細胞。為了模仿生理學上分泌的apol1，制備了表達并分泌全長apol1的g0變體(野生型)或apol1的g1變體或apol1的g2變體的cho細胞。

由于不確定這些細胞是否可用于通過流式細胞計量術(shù)(facs)評估抗體結(jié)合(由于apol1分泌)，還制備了表達錨定gpi的apol1的細胞(圖14b)以確保所述蛋白的細胞表面表達，盡管可能以不同于天然apol1的構(gòu)象。另外，錨定gpi的構(gòu)建體具有被gd(hsv糖蛋白d)表位標簽(和hsv信號序列)替代的apol1的前60個氨基酸(其不存在于其它apol家族成員中且不是apol1活性所必需的)以證實表達和實現(xiàn)抗體結(jié)合的標準化。此外，為了通過facs將抗體映射至三個apol1結(jié)構(gòu)域(pfd、mad或sra-id)，還制備了僅表達apol1結(jié)構(gòu)域中的一個或兩個(通過gpi錨附著于細胞表面，具有在n-端處的gd)的cho細胞(圖14c-e)。

如下制備細胞系。通過定位誘變(全長和截短)制備apol1的g0變體(wt，異形體a，nm_003661.3)、apol1的g1變體(s342g，i384m)和apol1的g2變體(δn388，y389)的apol1構(gòu)建體，并使用pentrdirectionaltopo克隆試劑盒(k2400-20)亞克隆進gateway進入載體中。制備非錨定gpi的和單純皰疹病毒糖蛋白d錨(gd)-標記的和錨定gpi的構(gòu)建體，并使用gatewaylrii重組亞克隆進多西環(huán)素-可誘導(dǎo)的慢病毒表達質(zhì)粒pinducer20中。通過dna測序驗證構(gòu)建體并用于使用pinducer系統(tǒng)制備編碼全長或截短的apol1的慢病毒。為了制備穩(wěn)定的可誘導(dǎo)的表達apol1的cho細胞，將慢病毒接種到cho細胞上，培養(yǎng)72h，并然后使用g418選擇。定期通過elisa估計培養(yǎng)基中的病毒p24蛋白直到它不再是可檢測的。在實驗分析之前，用5μg/ml的多西環(huán)素誘導(dǎo)apol1的表達48h。

流式細胞計量術(shù)

通過facs分析19種單克隆抗-apol1抗體對全長apol1的g0變體(野生型)、apol1的g1變體或apol1的g2變體的結(jié)合以估計交叉反應(yīng)性。所有抗體結(jié)合apol1的g0變體以及結(jié)合apol1的g1變體和apol1的g2變體二者，如平均熒光強度(mfi)所指示的(圖15)。

為了映射每種抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在表達apol1的g0變體的截短形式的細胞上執(zhí)行facs分析。在制備的19種抗-apol1抗體中，12種是pfd-特異性的，1種是mad-特異性的，5種是sra-id特異性的，且1種被視作證實敏感的結(jié)合劑，即它結(jié)合非直線表位。

如下文中所述執(zhí)行流式細胞計量術(shù)分析。將用5μg/ml多西環(huán)素誘導(dǎo)48h的apol1-cho細胞用在pbs中的5mmedta收獲，用cho培養(yǎng)基洗滌(在g6-sr離心機中在1200rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘)，并在pbs中再次洗滌。將大約0.5x10⁵細胞/樣品與1μg/ml的在pbs中的抗體一起在冰上溫育60分鐘。然后將細胞如上通過離心進行收集，用facs緩沖液(pbs+3％胎牛血清)洗滌3次，并然后再懸浮，并與2μg/ml的在pbs中的alexa488-綴合的山羊抗-小鼠/抗兔(h+l)igg一起在冰上溫育60分鐘。然后將細胞如上洗滌并再懸浮于含有碘化丙啶(pi)的pbs中，并使用熒光激活細胞分選術(shù)(facs)流式細胞計(facscalibur^tm，bdbiosciences)分析。測量每個樣品的平均熒光強度(mfi)。使用flowjo軟件(v8.4.5)分析數(shù)據(jù)。然后在從單獨的第二抗體減輕背景信號以后，將mfi輸出進msexcel中并繪圖。

錐蟲測定

基于以下假設(shè)產(chǎn)生基于錐蟲的功能測定：apol1介導(dǎo)的腎臟疾病進展機制可能與apol1的裂解錐蟲的能力有關(guān)。布魯斯錐蟲布魯斯亞種是被apol1裂解的錐蟲的人血清敏感物種。因此，針對它們的阻斷apol1介導(dǎo)的正常人血清(nhs)的裂解的能力篩選了本文描述的單克隆抗-apol1抗體。在有1％nhs存在下以細胞生存力的方式測量了阻斷活性。抗-apol1抗體在該測定中在1μg/ml的濃度具有從28％至49％范圍內(nèi)的阻斷活性(圖16)。

如下所述執(zhí)行錐蟲測定。在來自atcc的適當允許下得到布魯斯錐蟲布魯斯亞種(lister427vsg221)并在改進的hmi-9培養(yǎng)基(atcc#pra-383)中培養(yǎng)，每周傳代至少3次。不允許錐蟲生長至完全匯合以確保它們保持在增殖而不是矮胖形式。關(guān)于阻斷測定，在96孔透明板中在有或沒有1.0μg/ml抗-apol1抗體存在下將大約0.5x10⁵布魯斯錐蟲布魯斯亞種與1％正常人血清(nhs)一起在37℃溫育20h。隨后，加入10μl(invitrogen目錄號dal1025)并在4-6小時以后在530激發(fā)/590發(fā)射在熒光計中讀出細胞生存力。使用softmaxpro分析數(shù)據(jù)。將相對熒光單位(rfu)值輸出進msexcel中用于繪圖。

表3

參考文獻

chapman，m.j.，goldstein，s.，lagrange，d.，laplaud，p.m.，1981.adensitygradientultracentrifugalprocedurefortheisolationofthemajorlipoproteinclassesfromhumanserum.jlipidres22，339-358.

davidson，w.s.，silva，r.a.，chantepie，s.，lagor，w.r.，chapman，m.j.，kontush，a.，2009.proteomicanalysisofdefinedhdlsubpopulationsrevealsparticle-specificproteinclusters：relevancetoantioxidativefunction.arteriosclerthrombvascbiol29，870-876.

duchateau，p.n.，movsesyan，i.，yamashita，s.，sakai，n.，hirano，k.，schoenhaus，s.a.，o′connor-keams，p.m.，spencer，s.j.，jaffe，r.b.，redberg，r.f.，ishida，b.y.，matsuzawa，y.，kane，j.p.，malloy，m.j.，2000.plasmaapolipoproteinlconcentrationscorrelatewithplasmatriglyceridesandcholesterollevelsinnormolipidemic，hyperlipidemic，anddiabeticsubjects.jlipidres41，1231-1236.

duchateau，p.n.，pullinger，c.r.，orellana，r.e.，kunitake，s.t.，naya-vigne，j.，o′connor，p.m.，malloy，m.j.，kane，j.p.，1997.apolipoproteinl，anewhumanhighdensitylipoproteinapolipoproteinexpressedbythepancreas.identification，cloning，characterization，andplasmadistributionofapolipoproteinl.thejournalofbiologicalchemistry272，25576-25582.

freedman，b.i.，kopp，j.b.，langefeld，c.d.，genovese，g.，friedman，d.j.，nelson，g.w.，winkler，c.a.，bowden，d.w.，pollak，m.r.，2010.theapolipoproteinl1(apol1)geneandnondiabeticnephropathyinafricanamericans.jamsocnephrol21，1422-1426.

freedman，b.i.，langefeld，c.d.，lu，l.，divers，j.，comeau，m.e.，kopp，j.b.，winkler，c.a.，nelson，g.w.，johnson，r.c.，palmer，n.d.，hicks，p.j.，bostrom，m.a.，cooke，j.n.，mcdonough，c.w.，bowden，d.w.，2011.differentialeffectsofmyh9andapol1riskvariantsonfrmd3associationwithdiabeticesrdinafricanamericans.plosgenet7，e1002150.

hsu，c.y.，lin，f.，vittinghoff，e.，shlipak，m.g.，2003.racialdifferencesintheprogressionfromchronicrenalinsufficiencytoend-stagerenaldiseaseintheunitedstates.jamsocnephrol14，2902-2907.

kao，w.h.，klag，m.j.，meoni，l.a.，reich，d.，berthier-schaad，y.，li，m.，coresh，j.，patterson，n.，tandon，a.，powe，n.r.，fink，n.e.，sadler，j.h.，weir，m.r.，abboud，h.e.，adler，s.g.，divers，j.，iyengar，s.k.，freedman，b.i.，kimmel，p.l.，knowler，w.c.，kohn，o.f.，kramp，k.，leehey，d.j.，nicholas，s.b.，pahl，m.v.，schelling，j.r.，sedor，j.r.，thomley-brown，d.，winkler，c.a.，smith，m.w.，parekh，r.s.，2008.myh9isassociatedwithnondiabeticend-stagerenaldiseaseinafricanamericans.naturegenetics40，1185-1192.

kopp，j.b.，nelson，g.w.，sampath，k.，johnson，r.c.，genovese，g.，an，p.，friedman，d.，briggs，w.，dart，r.，korbet，s.，mokrzycki，m.h.，kimmel，p.l.，limou，s.，ahuja，t.s.，berns，j.s.，fryc，j.，simon，e.e.，smith，m.c.，trachtman，h.，michel，d.m.，schelling，j.r.，vlahov，d.，pollak，m.，winkler，c.a.，2011.apol1geneticvariantsinfocalsegmentalglomerulosclerosisandhiv-associatednephropathy.jamsocnephrol22，2129-2137.

kopp，j.b.，smith，m.w.，nelson，g.w.，johnson，r.c.，freedman，b.i.，bowden，d.w.，oleksyk，t.，mckenzie，l.m.，kajiyama，h.，ahuja，t.s.，berns，j.s.，briggs，w.，cho，m.e.，dart，r.a.，kimmel，p.l.，korbet，s.m.，michel，d.m.，mokrzycki，m.h.，schelling，j.r.，simon，e.，trachtman，h.，vlahov，d.，winkler，c.a.，2008.myh9isamajor-effectriskgeneforfocalsegmentalglomerulosclerosis.naturegenetics40，1175-1184.

lee，v.w.，harris，d.c.，2011.adriamycinnephropathy：amodeloffocalsegmentalglomerulosclerosis.nephrology(carlton)16，30-38.

madhavan，s.m.，o′toole，j.f.，konieczkowski，m.，ganesan，s.，bruggeman，l.a.，sedor，j.r.，2011.apol1localizationinnormalkidneyandnondiabetickidneydisease.jamsocnephrol22，2119-2128.

mcpherson，p.a.，young，i.s.，mckibben，b.，mceneny，j.，2007.highdensitylipoproteinsubfractions：isolation，composition，andtheirduplicitousroleinoxidation.jlipidres48，86-95.

page，n.m.，olano-martin，e.，lanaway，c.，turner，r.，minihane，a.m.，2006.polymorphismsintheapolipoproteinl1geneandtheireffectsonbloodlipidandglucoselevelsinmiddleagemales.genesnutr1，133-135.

parsa，a.，kao，w.h.，xie，d.，astor，b.c.，li，m.，hsu，c.y.，feldman，h.i.，parekh，r.s.，kusek，j.w.，greene，t.h.，fink，j.c.，anderson，a.h.，choi，m.j.，wright，j.t.，jr.，lash，j.p.，freedman，b.i.，ojo，a.，winkler，c.a.，raj，d.s.，kopp，j.b.，he，j.，jensvold，n.g.，tao，k.，lipkowitz，m.s.，appel，l.j.，2013.apol1riskvariants，race，andprogressionofchronickidneydisease.nengljmed369，2183-2196.

saleem，m.a.，o′hare，m.j.，reiser，j.，coward，r.j.，inward，c.d.，farren，t.，xing，c.y.，ni，l.，mathieson，p.w.，mundel，p.，2002.aconditionallyimmortalizedhumanpodocytecelllinedemonstratingnephrinandpodocinexpression.jamsocnephrol13，630-638.

序列表

<110>健泰科生物技術(shù)公司等

<120>腎病動物模型及其治療劑

<130>p32407-wo

<140>

<141>

<150>62/077,774

<151>2014-11-10

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>398

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多肽"

<400>1

metgluglyalaalaleuleuargvalservalleucysiletrpmet

151015

seralaleupheleuglyvalglyvalargalagluglualaglyala

202530

argvalglnglnasnvalproserglythraspthrglyaspprogln

354045

serlysproleuglyasptrpalaalaglythrmetaspprogluser

505560

serilepheilegluaspalailelystyrphelysglulysvalser

65707580

thrglnasnleuleuleuleuleuthraspasnglualatrpasngly

859095

phevalalaalaalagluleuproargasnglualaaspgluleuarg

100105110

lysalaleuaspasnleualaargglnmetilemetlysasplysasn

115120125

trphisasplysglyglnglntyrargasntrppheleulysgluphe

130135140

proargleulyssergluleugluaspasnileargargleuargala

145150155160

leualaaspglyvalglnlysvalhislysglythrthrilealaasn

165170175

valvalserglyserleuserileserserglyileleuthrleuval

180185190

glymetglyleualaprophethrgluglyglyserleuvalleuleu

195200205

gluproglymetgluleuglyilethralaalaleuthrglyilethr

210215220

serserthrmetasptyrglylyslystrptrpthrglnalaglnala

225230235240

hisaspleuvalilelysserleuasplysleulysgluvalargglu

245250255

pheleuglygluasnileserasnpheleuserleualaglyasnthr

260265270

tyrglnleuthrargglyileglylysaspileargalaleuargarg

275280285

alaargalaasnleuglnservalprohisalaseralaserargpro

290295300

argvalthrgluproileseralagluserglygluglnvalgluarg

305310315320

valasngluproserileleuglumetserargglyvallysleuthr

325330335

aspvalalaprovalserphepheleuvalleuaspvalvaltyrleu

340345350

valtyrgluserlyshisleuhisgluglyalalyssergluthrala

355360365

glugluleulyslysvalalaglngluleugluglulysleuasnile

370375380

leuasnasnasntyrlysileleuglnalaaspglngluleu

385390395

<210>2

<211>398

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多肽"

<400>2

metgluglyalaalaleuleuargvalservalleucysiletrpmet

151015

seralaleupheleuglyvalglyvalargalagluglualaglyala

202530

argvalglnglnasnvalproserglythraspthrglyaspprogln

354045

serlysproleuglyasptrpalaalaglythrmetaspprogluser

505560

serilepheilegluaspalailelystyrphelysglulysvalser

65707580

thrglnasnleuleuleuleuleuthraspasnglualatrpasngly

859095

phevalalaalaalagluleuproargasnglualaaspgluleuarg

100105110

lysalaleuaspasnleualaargglnmetilemetlysasplysasn

115120125

trphisasplysglyglnglntyrargasntrppheleulysgluphe

130135140

proargleulyssergluleugluaspasnileargargleuargala

145150155160

leualaaspglyvalglnlysvalhislysglythrthrilealaasn

165170175

valvalserglyserleuserileserserglyileleuthrleuval

180185190

glymetglyleualaprophethrgluglyglyserleuvalleuleu

195200205

gluproglymetgluleuglyilethralaalaleuthrglyilethr

210215220

serserthrmetasptyrglylyslystrptrpthrglnalaglnala

225230235240

hisaspleuvalilelysserleuasplysleulysgluvalargglu

245250255

pheleuglygluasnileserasnpheleuserleualaglyasnthr

260265270

tyrglnleuthrargglyileglylysaspileargalaleuargarg

275280285

alaargalaasnleuglnservalprohisalaseralaserargpro

290295300

argvalthrgluproileseralagluserglygluglnvalgluarg

305310315320

valasngluproserileleuglumetserargglyvallysleuthr

325330335

aspvalalaprovalglyphepheleuvalleuaspvalvaltyrleu

340345350

valtyrgluserlyshisleuhisgluglyalalyssergluthrala

355360365

glugluleulyslysvalalaglngluleugluglulysleuasnmet

370375380

leuasnasnasntyrlysileleuglnalaaspglngluleu

385390395

<210>3

<211>396

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多肽"

<400>3

metgluglyalaalaleuleuargvalservalleucysiletrpmet

151015

seralaleupheleuglyvalglyvalargalagluglualaglyala

202530

argvalglnglnasnvalproserglythraspthrglyaspprogln

354045

serlysproleuglyasptrpalaalaglythrmetaspprogluser

505560

serilepheilegluaspalailelystyrphelysglulysvalser

65707580

thrglnasnleuleuleuleuleuthraspasnglualatrpasngly

859095

phevalalaalaalagluleuproargasnglualaaspgluleuarg

100105110

lysalaleuaspasnleualaargglnmetilemetlysasplysasn

115120125

trphisasplysglyglnglntyrargasntrppheleulysgluphe

130135140

proargleulyssergluleugluaspasnileargargleuargala

145150155160

leualaaspglyvalglnlysvalhislysglythrthrilealaasn

165170175

valvalserglyserleuserileserserglyileleuthrleuval

180185190

glymetglyleualaprophethrgluglyglyserleuvalleuleu

195200205

gluproglymetgluleuglyilethralaalaleuthrglyilethr

210215220

serserthrmetasptyrglylyslystrptrpthrglnalaglnala

225230235240

hisaspleuvalilelysserleuasplysleulysgluvalargglu

245250255

pheleuglygluasnileserasnpheleuserleualaglyasnthr

260265270

tyrglnleuthrargglyileglylysaspileargalaleuargarg

275280285

alaargalaasnleuglnservalprohisalaseralaserargpro

290295300

argvalthrgluproileseralagluserglygluglnvalgluarg

305310315320

valasngluproserileleuglumetserargglyvallysleuthr

325330335

aspvalalaprovalserphepheleuvalleuaspvalvaltyrleu

340345350

valtyrgluserlyshisleuhisgluglyalalyssergluthrala

355360365

glugluleulyslysvalalaglngluleugluglulysleuasnile

370375380

leuasnasnlysileleuglnalaaspglngluleu

385390395

<210>4

<211>593

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>4

gcggccgctcacacgaggcattgggaaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaa60

tcttcagtcagtaccgcatgcctcagcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagc120

tgaaagcggtgaacaggtggagagggttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagagg180

agtcaagctcacggatgtggcccctgtaggcttctttcttgtgctggatgtagtctacct240

cgtgtacgaatcaaagcacttacatgagggggcaaagaatgcaggtgaattcaataaact300

cggcggatccacctgcattccaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtggctca360

ggagctggaggagaagctaaacatgctcaacaataattataagattctgcaggcggacca420

agaactgtgaccacagggcagggcagccaccaggagagatatgcctggcaggggccagga480

caaaatgcaaacttttttttttttctgagacagagtcttgctctgtcgccaagttggagt540

gcaatggtgcgatctcagctcactgcaagctctgcctcccgtgttgcggccgc593

<210>5

<211>464

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>5

gcggccgcttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagctcacggatgt60

ggcccctgtaagcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacgaatcaaagca120

cttacatgagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtggctcaggagct180

ggaggagaagctaaacattctcaacaataagactgtgcaggtgaattcggatccattaaa240

actagtacctgcattcaagattctgcaggcggaccaagaactgtgaccacagggcagggc300

agccaccaggagagatatgcctggcaggggccaggacaaaatgcaaactttttttttttt360

ctgagacagagtcttgctctgtcgccaagttggagtgcaatggtgcgatctcagctcact420

gcaagctctgcctcccgtgttcaagcgattctcctggcggccgc464

<210>6

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

寡核苷酸"

<400>6

tagtcctgtccagggccccctggccgcagacaaatgctacagacacggctggcgcgccga60

tacgcgagcgaacgtgaa78

<210>7

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

寡核苷酸"

<400>7

gtcagtggcaggtctttcttgagctcagaaaggttaggtaactagttcaggcggccgcct60

tagacgtcaggtggcact78

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>8

tttcttgtgctggatgtag19

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>9

atatctctcctggtggct18

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>10

tgggtgtcaggttcttgcttcagc24

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>11

cagtggatgcgcgcaggac19

<210>12

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>12

tgagcagaggagtcaag17

<210>13

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>13

tgtggtcacagttcttg17

<210>14

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

探針"

<400>14

agctaaacatgctcaac17

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>15

cacgtgggctccagcatt18

<210>16

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

引物"

<400>16

tcaccagtcatttctgcctttg22

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

探針"

<400>17

ccaatggtcgggcactgctcaa22

<210>18

<211>1194

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>18

atggagggagctgctttgctgagagtctctgtcctctgcatctggatgagtgcacttttc60

cttggtgtgggagtgagggcagaggaagctggagcgagggtgcaacaaaacgttccaagt120

gggacagatactggagatcctcaaagtaagcccctcggtgactgggctgctggcaccatg180

gacccagagagcagtatctttattgaggatgccattaagtatttcaaggaaaaagtgagc240

acacagaatctgctactcctgctgactgataatgaggcctggaacggattcgtggctgct300

gctgaactgcccaggaatgaggcagatgagctccgtaaagctctggacaaccttgcaaga360

caaatgatcatgaaagacaaaaactggcacgataaaggccagcagtacagaaactggttt420

ctgaaagagtttcctcggttgaaaagtaagcttgaggataacataagaaggctccgtgcc480

cttgcagatggggttcagaaggtccacaaaggcaccaccatcgccaatgtggtgtctggc540

tctctcagcatttcctctggcatcctgaccctcgtcggcatgggtctggcacccttcaca600

gagggaggcagccttgtactcttggaacctgggatggagttgggaatcacagcagctttg660

accgggattaccagtagtaccatagactacggaaagaagtggtggacacaagcccaagcc720

cacgacctggtcatcaaaagccttgacaaattgaaggaggtgaaggagtttttgggtgag780

aacatatccaactttctttccttagctggcaatacttaccaactcacacgaggcattggg840

aaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaatcttcagtcagtaccgcatgcctca900

gcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagctgaaagcggtgaacaggtggagaga960

gttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagctcacggatgtggcccct1020

gtaagcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacgaatcaaagcacttacat1080

gagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtggctcaggagctggaggag1140

aagctaaacattctcaacaataattataagattctgcaggcggaccaagaactg1194

<210>19

<211>7154

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>19

gtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60

gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180

ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240

atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300

cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360

tattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctcccca420

tctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcag480

cgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggc540

ggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagt600

ttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcggg660

cgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcc720

cgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctc780

ctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtg840

aaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgt900

gcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagc960

gctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccg1020

ggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtg1080

tgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgc1140

acccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggc1200

gtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcgggg1260

cggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccg1320

gcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagaggg1380

cgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgca1440

ccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcgggg1500

agggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtc1560

cgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtg1620

tgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagc1680

tcctgggcaacgtgctggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaagacttcggtaccg1740

cgggcccgggatccaccatggagggagctgctttgctgagagtctctgtcctctgcatct1800

ggatgagtgcacttttccttggtgtgggagtgagggcagaggaagctggagcgagggtgc1860

aacaaaacgttccaagtgggacagatactggagatcctcaaagtaagcccctcggtgact1920

gggctgctggcaccatggacccagagagcagtatctttattgaggatgccattaagtatt1980

tcaaggaaaaagtgagcacacagaatctgctactcctgctgactgataatgaggcctgga2040

acggattcgtggctgctgctgaactgcccaggaatgaggcagatgagctccgtaaagctc2100

tggacaaccttgcaagacaaatgatcatgaaagacaaaaactggcacgataaaggccagc2160

agtacagaaactggtttctgaaagagtttcctcggttgaaaagtaagcttgaggataaca2220

taagaaggctccgtgcccttgcagatggggttcagaaggtccacaaaggcaccaccatcg2280

ccaatgtggtgtctggctctctcagcatttcctctggcatcctgaccctcgtcggcatgg2340

gtctggcacccttcacagagggaggcagccttgtactcttggaacctgggatggagttgg2400

gaatcacagcagctttgaccgggattaccagtagtaccatagactacggaaagaagtggt2460

ggacacaagcccaagcccacgacctggtcatcaaaagccttgacaaattgaaggaggtga2520

aggagtttttgggtgagaacatatccaactttctttccttagctggcaatacttaccaac2580

tcacacgaggcattgggaaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaatcttcagt2640

cagtaccgcatgcctcagcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagctgaaagcg2700

gtgaacaggtggagagagttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagc2760

tcacggatgtggcccctgtaagcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacg2820

aatcaaagcacttacatgagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtgg2880

ctcaggagctggaggagaagctaaacattctcaacaataattataagattctgcaggcgg2940

accaagaactgtgagggaattcgtgagcggccgcatgatcagctggatgcatcgatcacg3000

cgtaccggtgctcgaggtaccgatgaatagctaaggtcgaggccgcaggtaagtatcaag3060

gttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactc3120

ttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccaca3180

ggtgtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaac3240

tatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctatt3300

gcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttat3360

gaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgca3420

acccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttc3480

cccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggg3540

gctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttcca3600

tggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccct3660

tcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctctt3720

ccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcct3780

ggacttcgagctcggtacgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttg3840

tttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcct3900

aataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtg3960

gggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcccagcttttgttccct4020

ttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaa4080

ttgttatccgctaattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtg4140

tggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatg4200

gggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttca4260

ttgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaa4320

atcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgc4380

tggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctg4440

ctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatatttt4500

gttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagcca4560

gatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagat4620

ccctcgacctgcagcccaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaat4680

tgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctgg4740

ggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccag4800

tcgggaaacctgtcgtgccagcggaaccgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgc4860

ccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatg4920

gctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattcc4980

agaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctaacttgtttat5040

tgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatt5100

tttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctg5160

gaaccgctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgc5220

tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta5280

tcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaag5340

aacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg5400

tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg5460

tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg5520

cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga5580

agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc5640

tccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt5700

aactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccact5760

ggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgg5820

cctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt5880

accttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggt5940

ggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcct6000

ttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttg6060

gtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt6120

aaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagt6180

gaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtc6240

gtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccg6300

cgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggcc6360

gagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgg6420

gaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctaca6480

ggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacga6540

tcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcct6600

ccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactg6660

cataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactca6720

accaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaata6780

cgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttct6840

tcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccact6900

cgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaa6960

acaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactc7020

atactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga7080

tacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccga7140

aaagtgccacctgg7154

<210>20

<211>1194

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>20

atggagggagctgctttgctgagagtctctgtcctctgcatctggatgagtgcacttttc60

cttggtgtgggagtgagggcagaggaagctggagcgagggtgcaacaaaacgttccaagt120

gggacagatactggagatcctcaaagtaagcccctcggtgactgggctgctggcaccatg180

gacccagagagcagtatctttattgaggatgccattaagtatttcaaggaaaaagtgagc240

acacagaatctgctactcctgctgactgataatgaggcctggaacggattcgtggctgct300

gctgaactgcccaggaatgaggcagatgagctccgtaaagctctggacaaccttgcaaga360

caaatgatcatgaaagacaaaaactggcacgataaaggccagcagtacagaaactggttt420

ctgaaagagtttcctcggttgaaaagtaagcttgaggataacataagaaggctccgtgcc480

cttgcagatggggttcagaaggtccacaaaggcaccaccatcgccaatgtggtgtctggc540

tctctcagcatttcctctggcatcctgaccctcgtcggcatgggtctggcacccttcaca600

gagggaggcagccttgtactcttggaacctgggatggagttgggaatcacagcagctttg660

accgggattaccagtagtaccatagactacggaaagaagtggtggacacaagcccaagcc720

cacgacctggtcatcaaaagccttgacaaattgaaggaggtgaaggagtttttgggtgag780

aacatatccaactttctttccttagctggcaatacttaccaactcacacgaggcattggg840

aaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaatcttcagtcagtaccgcatgcctca900

gcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagctgaaagcggtgaacaggtggagaga960

gttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagctcacggatgtggcccct1020

gtaggcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacgaatcaaagcacttacat1080

gagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtggctcaggagctggaggag1140

aagctaaacatgctcaacaataattataagattctgcaggcggaccaagaactg1194

<210>21

<211>7154

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>21

gtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60

gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180

ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240

atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300

cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360

tattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctcccca420

tctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcag480

cgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggc540

ggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagt600

ttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcggg660

cgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcc720

cgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctc780

ctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtg840

aaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgt900

gcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagc960

gctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccg1020

ggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtg1080

tgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgc1140

acccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggc1200

gtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcgggg1260

cggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccg1320

gcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagaggg1380

cgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgca1440

ccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcgggg1500

agggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtc1560

cgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtg1620

tgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagc1680

tcctgggcaacgtgctggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaagacttcggtaccg1740

cgggcccgggatccaccatggagggagctgctttgctgagagtctctgtcctctgcatct1800

ggatgagtgcacttttccttggtgtgggagtgagggcagaggaagctggagcgagggtgc1860

aacaaaacgttccaagtgggacagatactggagatcctcaaagtaagcccctcggtgact1920

gggctgctggcaccatggacccagagagcagtatctttattgaggatgccattaagtatt1980

tcaaggaaaaagtgagcacacagaatctgctactcctgctgactgataatgaggcctgga2040

acggattcgtggctgctgctgaactgcccaggaatgaggcagatgagctccgtaaagctc2100

tggacaaccttgcaagacaaatgatcatgaaagacaaaaactggcacgataaaggccagc2160

agtacagaaactggtttctgaaagagtttcctcggttgaaaagtaagcttgaggataaca2220

taagaaggctccgtgcccttgcagatggggttcagaaggtccacaaaggcaccaccatcg2280

ccaatgtggtgtctggctctctcagcatttcctctggcatcctgaccctcgtcggcatgg2340

gtctggcacccttcacagagggaggcagccttgtactcttggaacctgggatggagttgg2400

gaatcacagcagctttgaccgggattaccagtagtaccatagactacggaaagaagtggt2460

ggacacaagcccaagcccacgacctggtcatcaaaagccttgacaaattgaaggaggtga2520

aggagtttttgggtgagaacatatccaactttctttccttagctggcaatacttaccaac2580

tcacacgaggcattgggaaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaatcttcagt2640

cagtaccgcatgcctcagcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagctgaaagcg2700

gtgaacaggtggagagagttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagc2760

tcacggatgtggcccctgtaggcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacg2820

aatcaaagcacttacatgagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtgg2880

ctcaggagctggaggagaagctaaacatgctcaacaataattataagattctgcaggcgg2940

accaagaactgtgagggaattcgtgagcggccgcatgatcagctggatgcatcgatcacg3000

cgtaccggtgctcgaggtaccgatgaatagctaaggtcgaggccgcaggtaagtatcaag3060

gttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactc3120

ttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccaca3180

ggtgtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaac3240

tatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctatt3300

gcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttat3360

gaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgca3420

acccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttc3480

cccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggg3540

gctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttcca3600

tggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccct3660

tcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctctt3720

ccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcct3780

ggacttcgagctcggtacgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttg3840

tttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcct3900

aataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtg3960

gggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcccagcttttgttccct4020

ttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaa4080

ttgttatccgctaattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtg4140

tggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatg4200

gggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttca4260

ttgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaa4320

atcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgc4380

tggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctg4440

ctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatatttt4500

gttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagcca4560

gatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagat4620

ccctcgacctgcagcccaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaat4680

tgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctgg4740

ggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccag4800

tcgggaaacctgtcgtgccagcggaaccgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgc4860

ccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatg4920

gctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattcc4980

agaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctaacttgtttat5040

tgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatt5100

tttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctg5160

gaaccgctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgc5220

tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta5280

tcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaag5340

aacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg5400

tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg5460

tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg5520

cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga5580

agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc5640

tccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt5700

aactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccact5760

ggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgg5820

cctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt5880

accttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggt5940

ggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcct6000

ttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttg6060

gtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt6120

aaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagt6180

gaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtc6240

gtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccg6300

cgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggcc6360

gagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgg6420

gaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctaca6480

ggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacga6540

tcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcct6600

ccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactg6660

cataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactca6720

accaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaata6780

cgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttct6840

tcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccact6900

cgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaa6960

acaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactc7020

atactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga7080

tacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccga7140

aaagtgccacctgg7154

<210>22

<211>1188

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>22

atggagggagctgctttgctgagagtctctgtcctctgcatctggatgagtgcacttttc60

cttggtgtgggagtgagggcagaggaagctggagcgagggtgcaacaaaacgttccaagt120

gggacagatactggagatcctcaaagtaagcccctcggtgactgggctgctggcaccatg180

gacccagagagcagtatctttattgaggatgccattaagtatttcaaggaaaaagtgagc240

acacagaatctgctactcctgctgactgataatgaggcctggaacggattcgtggctgct300

gctgaactgcccaggaatgaggcagatgagctccgtaaagctctggacaaccttgcaaga360

caaatgatcatgaaagacaaaaactggcacgataaaggccagcagtacagaaactggttt420

ctgaaagagtttcctcggttgaaaagtaagcttgaggataacataagaaggctccgtgcc480

cttgcagatggggttcagaaggtccacaaaggcaccaccatcgccaatgtggtgtctggc540

tctctcagcatttcctctggcatcctgaccctcgtcggcatgggtctggcacccttcaca600

gagggaggcagccttgtactcttggaacctgggatggagttgggaatcacagcagctttg660

accgggattaccagtagtaccatagactacggaaagaagtggtggacacaagcccaagcc720

cacgacctggtcatcaaaagccttgacaaattgaaggaggtgaaggagtttttgggtgag780

aacatatccaactttctttccttagctggcaatacttaccaactcacacgaggcattggg840

aaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaatcttcagtcagtaccgcatgcctca900

gcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagctgaaagcggtgaacaggtggagaga960

gttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagctcacggatgtggcccct1020

gtaagcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacgaatcaaagcacttacat1080

gagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtggctcaggagctggaggag1140

aagctaaacattctcaacaataagattctgcaggcggaccaagaactg1188

<210>23

<211>7148

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多核苷酸"

<400>23

gtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60

gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180

ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240

atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300

cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360

tattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctcccca420

tctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcag480

cgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggc540

ggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagt600

ttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcggg660

cgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcc720

cgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctc780

ctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtg840

aaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgt900

gcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagc960

gctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccg1020

ggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtg1080

tgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgc1140

acccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggc1200

gtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcgggg1260

cggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccg1320

gcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagaggg1380

cgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgca1440

ccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcgggg1500

agggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtc1560

cgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtg1620

tgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagc1680

tcctgggcaacgtgctggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaagacttcggtaccg1740

cgggcccgggatccaccatggagggagctgctttgctgagagtctctgtcctctgcatct1800

ggatgagtgcacttttccttggtgtgggagtgagggcagaggaagctggagcgagggtgc1860

aacaaaacgttccaagtgggacagatactggagatcctcaaagtaagcccctcggtgact1920

gggctgctggcaccatggacccagagagcagtatctttattgaggatgccattaagtatt1980

tcaaggaaaaagtgagcacacagaatctgctactcctgctgactgataatgaggcctgga2040

acggattcgtggctgctgctgaactgcccaggaatgaggcagatgagctccgtaaagctc2100

tggacaaccttgcaagacaaatgatcatgaaagacaaaaactggcacgataaaggccagc2160

agtacagaaactggtttctgaaagagtttcctcggttgaaaagtaagcttgaggataaca2220

taagaaggctccgtgcccttgcagatggggttcagaaggtccacaaaggcaccaccatcg2280

ccaatgtggtgtctggctctctcagcatttcctctggcatcctgaccctcgtcggcatgg2340

gtctggcacccttcacagagggaggcagccttgtactcttggaacctgggatggagttgg2400

gaatcacagcagctttgaccgggattaccagtagtaccatagactacggaaagaagtggt2460

ggacacaagcccaagcccacgacctggtcatcaaaagccttgacaaattgaaggaggtga2520

aggagtttttgggtgagaacatatccaactttctttccttagctggcaatacttaccaac2580

tcacacgaggcattgggaaggacatccgtgccctcagacgagccagagccaatcttcagt2640

cagtaccgcatgcctcagcctcacgcccccgggtcactgagccaatctcagctgaaagcg2700

gtgaacaggtggagagagttaatgaacccagcatcctggaaatgagcagaggagtcaagc2760

tcacggatgtggcccctgtaagcttctttcttgtgctggatgtagtctacctcgtgtacg2820

aatcaaagcacttacatgagggggcaaagtcagagacagctgaggagctgaagaaggtgg2880

ctcaggagctggaggagaagctaaacattctcaacaataagattctgcaggcggaccaag2940

aactgtgagggaattcgtgagcggccgcatgatcagctggatgcatcgatcacgcgtacc3000

ggtgctcgaggtaccgatgaatagctaaggtcgaggccgcaggtaagtatcaaggttaca3060

agacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgt3120

ttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtc3180

gacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgtt3240

gctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcc3300

cgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggag3360

ttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaaccccc3420

actggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctc3480

cctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcgg3540

ctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctg3600

ctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggcc3660

ctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgt3720

cttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggactt3780

cgagctcggtacgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcc3840

cctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaa3900

atgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtgg3960

ggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcccagcttttgttccctttagtg4020

agggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgtta4080

tccgctaattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggcca4140

atgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggaca4200

tcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaa4260

tagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatt4320

taaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctg4380

ccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtcc4440

attccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttg4500

tgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttt4560

tcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatccctcg4620

acctgcagcccaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttat4680

ccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcc4740

taatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcggga4800

aacctgtcgtgccagcggaaccgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaa4860

ctccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgac4920

taattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagt4980

agtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctaacttgtttattgcagc5040

ttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttc5100

actgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggaaccg5160

ctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcc5220

gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagct5280

cactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatg5340

tgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttc5400

cataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcga5460

aacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctct5520

cctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtg5580

gcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaag5640

ctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactat5700

cgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaac5760

aggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaac5820

tacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttc5880

ggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttt5940

tttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatc6000

ttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatg6060

agattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatca6120

atctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggca6180

cctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtag6240

ataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagac6300

ccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgc6360

agaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagct6420

agagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatc6480

gtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaagg6540

cgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatc6600

gttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataat6660

tctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaag6720

tcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggat6780

aataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcgggg6840

cgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgca6900

cccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacagga6960

aggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactc7020

ttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacata7080

tttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtg7140

ccacctgg7148

<210>24

<211>357

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來源

<223>/注釋="人工序列的描述：合成的

多肽"

<400>24

methishishishishishisglygluasnleutyrpheglnglyser

151015

aspprogluserserilepheilegluaspalailelystyrphelys

202530

glulysvalserthrglnasnleuleuleuleuleuthraspasnglu

354045

alatrpasnglyphevalalaalaalagluleuproargasngluala

505560

aspgluleuarglysalaleuaspasnleualaargglnmetilemet

65707580

lysasplysasntrphisasplysglyglnglntyrargasntrpphe

859095

leulysglupheproargleulyssergluleugluaspasnilearg

100105110

argleuargalaleualaaspglyvalglnlysvalhislysglythr

115120125

thrilealaasnvalvalserglyserleuserileserserglyile

130135140

leuthrleuvalglymetglyleualaprophethrgluglyglyser

145150155160

leuvalleuleugluproglymetgluleuglyilethralaalaleu

165170175

thrglyilethrserserthrmetasptyrglylyslystrptrpthr

180185190

glnalaglnalahisaspleuvalilelysserleuasplysleulys

195200205

gluvalargglupheleuglygluasnileserasnpheleuserleu

210215220

alaglyasnthrtyrglnleuthrargglyileglylysaspilearg

225230235240

alaleuargargalaargalaasnleuglnservalprohisalaser

245250255

alaserargproargvalthrgluproileseralagluserglyglu

260265270

glnvalgluargvalasngluproserileleuglumetserarggly

275280285

vallysleuthraspvalalaprovalserphepheleuvalleuasp

290295300

valvaltyrleuvaltyrgluserlyshisleuhisgluglyalalys

305310315320

sergluthralaglugluleulyslysvalalaglngluleugluglu

325330335

lysleuasnileleuasnasnasntyrlysileleuglnalaaspgln

340345350

gluleuglyasnser

355