一種利用球孢白僵菌治理假眼小綠葉蟬的方法
【專利摘要】一種利用球孢白僵菌治理假眼小綠葉蟬的方法，采用噴霧法測定5株球孢白僵菌菌株對假眼小綠葉蟬的致病力，以濃度(1±0.5)×107孢子/mL的白僵菌孢子懸液接種12d后，5株菌株的校正死亡率和僵蟲率范圍分別在(52.21±0.94)％-(86.92±1.96)％和(50.67±1.25)％-(84.67±0.82)％，LT50為6.35-9.61d。其中，BLK菌株對其致病力最強，其校正死亡率和僵蟲率分別為(86.92±1.96)％和(84.67±0.82)％，LT50為6.35d，6d的LC50為9.539×106孢子/mL。通過時間-劑量-死亡率模型參數(shù)估算，BLK菌株對該蟲致死效應較強的時間段為2.5-5d。白僵菌BLK菌劑能夠有效防治假眼小綠葉蟬蟲害，本發(fā)明采用生物防治，防治方法安全、環(huán)保，對茶樹無副作用，方法操作簡單，易于推廣，成本較低。
【專利說明】-種利用球孢白僵菌治理假眼小綠葉蟬的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治及微生物領(lǐng)域，特別涉及一種利用球孢白僵菌治理假眼小綠 葉蟬的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 假眼小綠葉蝶（EmpoascavitisGothe)屬同翅目（Homoptera)葉蝶科 (Icadellidae)小綠葉蝶屬（Empoascaspp.)，是中國茶樹主要害蟲之一。其若蟲、成蟲均危 害刺吸茶樹嫩梢芽葉汁液，輕者茶樹嫩梢、芽、葉形成褐色斑點，重者導致焦枯。同時，該刺 吸性害蟲也是茶樹病害的病原菌傳播的主要媒介。該蟲分布廣，世代重疊復雜，目前主要以 化學防治為主，化學試劑的長期使用使其產(chǎn)生程度不一的抗藥性。昆蟲病原真菌主要通過 體壁侵染，對刺吸式口器的昆蟲有較好的效果。球孢白僵菌是一種運用較為廣泛的病原真 菌，其對鱗翅目、鞘翅目、同翅目以及螨類均有較好的防治效果。本發(fā)明以球孢白僵菌不同 菌株對假眼小綠葉蟬成蟲進行處理及毒力的測定，旨在篩選出對其致病力強的菌株，為該 害蟲的生物防治提供重要的菌株資源和新的有效防治途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用球孢白僵菌治 理假眼小綠葉蟬的方法，白僵菌BLK菌劑能夠有效防治假眼小綠葉蟬蟲害，本發(fā)明采用生 物防治，防治方法安全、環(huán)保，對茶樹無副作用，方法操作簡單，易于推廣，成本較低。
[0004] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0005] -種利用球孢白僵菌治理假眼小綠葉蟬的方法，包括如下步驟：
[0006] 步驟一、球孢白僵菌及假眼小綠葉蟬準備
[0007] 將球孢白僵菌在斜面培養(yǎng)基上充分產(chǎn)孢后，用IOmL的0. 05% Tween80無菌水 洗下，置于振蕩器上振蕩20min(180r/min)，血球計數(shù)板計數(shù)；將各菌株配制成濃度為 (1 ±0. 5) X IO7孢子/mL的孢子懸液備用；
[0008] 采用掃網(wǎng)法從茶園采集假眼小綠葉蟬，并用自制吸蟲器吸入透氣的廣口玻璃瓶內(nèi) (D = 7. 2cm ;H = 9. 6cm)，以帶嫩葉和幼芽的新鮮茶樹枝條（5-6cm)室內(nèi)飼養(yǎng)；
[0009] 步驟二、接菌選擇飼養(yǎng)了 2d的健康成蟲作為供試蟲；采用自制的微型噴菌器，以 (1 ±0. 5) X IO7孢子/mL孢子懸液噴霧法接菌；每個廣口瓶裝40-50頭成蟲后，置于噴霧器 正下方，垂直噴菌3下；并在廣口瓶底部放入血球計數(shù)板，以同樣的方法模擬噴菌，統(tǒng)計單 位面積的接菌量；
[0010] 步驟三、接菌后的試蟲飼養(yǎng)在已滅菌的培養(yǎng)皿中放入酒精瓶蓋，瓶蓋中以浸泡無 菌水的脫脂棉填滿，用橡皮筋將5-6cm的鮮嫩茶樹枝條扎成束后，直插于脫脂棉上，將接菌 后的廣口瓶倒扣于培養(yǎng)皿中，貼好標簽，于（25±1)°C，相對濕度（95±1) %的人工氣候箱 中飼養(yǎng)，2d更換1次鮮嫩枝葉，并在脫脂棉中滴入適量無菌水保濕，每菌株為一處理，每個 處理設(shè)5個重復，每重復接菌40-50頭成蟲；每12h觀察、記錄1次各處理假眼小綠葉蟬的死 亡情況，并及時將死蟲轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用浸泡過無菌室的脫脂棉保濕，置于（25±1)°C 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察死蟲表面菌絲生長和產(chǎn)孢情況；統(tǒng)計各處理假眼小綠葉蟬死亡 數(shù)和僵蟲數(shù)，蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子為有效致死，僵蟲判斷標準參照童應華等 和何學友等的方法；以噴等量的〇. 05%的TWeen80無菌水處理作為對照；
[0011] 步驟四、高致病力菌株致死中濃度（LC5tl)的測定
[0012] 選擇致病力較強，且僵蟲率較高的菌株，分別以（1 ±0.5) X 108、（1 ±0.5) X 107、 (1 ±0. 5) X 106、（1 ±0. 5) X 105、（1 ±0. 5) X IO4孢子/mL的5個濃度梯度孢子懸液噴霧法 接種，每個濃度梯度5個重復，每個重復測定40-50頭健康成蟲，以0. 05% Tween80無菌 水作為對照。飼養(yǎng)、觀察和記錄的方法同步驟三。
[0013] 進一步的，所述步驟一中，供試球孢白僵菌包括BLK菌株、BB菌株、B3菌株、B187 菌株、BNH-04菌株。
[0014] 進一步的，所述步驟二中，單位面積接菌量為（37. 0±0. 5)孢子/mm2。
[0015] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 白僵菌BLK菌劑能夠有效防治假眼小綠葉蟬蟲害，本發(fā)明采用生物防治，防治方 法安全、環(huán)保，對茶樹無副作用，方法操作簡單，易于推廣，成本較低。本發(fā)明中以濃度為 (1 ±0. 5) X IO7孢子· mr1的孢子懸液接菌，12d后，BLK菌株處理的成蟲累計死亡率、校正 死亡率、僵蟲率分別為（88. 67± 1.60) %、（86. 92± 1.96) %、（84. 67 ±0.82)%，均極顯著 高于其它4株菌株。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1不同白僵菌菌株處理后假眼小綠葉蟬的累計死亡率圖。

【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明方案做進一步詳細描述，
[0019] 試驗例：
[0020] 1材料與方法
[0021] 1.1供試昆蟲
[0022] 2014年3月下旬至4月中旬，于福建省福州市福建農(nóng)林大學茶園采用掃網(wǎng)法采 集假眼小綠葉蟬。將采回的假眼小綠葉蟬用自制吸蟲器吸入透氣的廣口玻璃瓶內(nèi)（D = 7. 2cm ;H = 9. 6cm)，以帶嫩葉和幼芽的新鮮茶樹枝條（5-6cm)室內(nèi)飼養(yǎng)。
[0023] 1. 2供試菌株
[0024] 供試球孢白僵菌菌株（BLK、BB、B3、B187、BNH-04)均系福建農(nóng)林大學林學院森林 保護教研室保存菌株。
[0025] 1. 3孢子懸液的制備
[0026] 待各菌在斜面培養(yǎng)基上充分產(chǎn)孢后，用IOmL的0. 05% Tween80無菌水洗下，置于 振蕩器上振蕩20min (180r/min)，血球計數(shù)板計數(shù)。將各菌株配制成濃度為（1 ±0. 5) X IO7 孢子/mL的孢子懸液備用。
[0027] 1. 4高致病力菌株的篩選
[0028] 1. 4. 1接菌選擇飼養(yǎng)了 2d的健康成蟲作為供試蟲。采用自制的微型噴菌器，以 (I ±0. 5) X IO7孢子/mL孢子懸液噴霧法接菌。每個廣口瓶裝40-50頭成蟲后，置于噴霧器 正下方，垂直噴菌3下。并在廣口瓶底部放入血球計數(shù)板，以同樣的方法模擬噴菌，統(tǒng)計單 位面積的接菌量。根據(jù)統(tǒng)計，單位面積接菌量為（37. 0±0. 5)孢子/mm2。
[0029] 1. 4. 2試蟲飼養(yǎng)在已滅菌的培養(yǎng)皿中放入酒精瓶蓋，瓶蓋中以浸泡無菌水的脫脂 棉填滿，用橡皮筋將鮮嫩茶樹枝條（5_6cm)扎成束后，直插于脫脂棉上，將接菌后的廣口瓶 倒扣于培養(yǎng)皿中，貼好標簽，于（25±1) °C，相對濕度（95±1) %的人工氣候箱中飼養(yǎng)，2d更 換1次鮮嫩枝葉，并在脫脂棉中滴入適量無菌水保濕。每菌株為一處理，每個處理設(shè)5個重 復，每重復接菌40-50頭成蟲。每12h觀察、記錄1次各處理假眼小綠葉蟬的死亡情況，并 及時將死蟲轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用浸泡過無菌室的脫脂棉保濕，置于（25 ± I) °C的恒溫培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，觀察死蟲表面菌絲生長和產(chǎn)孢情況。統(tǒng)計各處理假眼小綠葉蟬死亡數(shù)和僵蟲數(shù)， 蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子為有效致死，僵蟲判斷標準參照童應華等和何學友等的 方法。以噴等量的0. 05%的TWeen80無菌水處理作為對照。
[0030] 1. 5高致病力菌株致死中濃度（LC5tl)的測定
[0031] 選擇致病力較強，且僵蟲率較高的菌株，分別以（1 ±0.5) X 108、（1 ±0.5) X 107、 (1 ±0. 5) X 106、（1 ±0. 5) X 105、（1 ±0. 5) X IO4孢子/mL的5個濃度梯度孢子懸液噴霧法 接種，每個濃度梯度5個重復，每個重復測定40-50頭健康成蟲，以0. 05% Tween80無菌 水作為對照。飼養(yǎng)、觀察和記錄的方法同1.4. 2。
[0032] 1. 6數(shù)據(jù)處理分析
[0033] 試驗數(shù)據(jù)應用Excel (2007)處理后，采用DPS (7. 55)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[11]進行方差 分析和Duncan氏新復極差法多重比較。采用死亡率一時間幾率值分析法，即以時間對數(shù)值 為X，死亡率轉(zhuǎn)換的幾率值為Y，計算出致病力回歸方程和致死中時（LT 5tl)。計算公式（1)、 ⑵、⑶。

【權(quán)利要求】
1. 一種利用球孢白僵菌治理假眼小綠葉蟬的方法，包括如下步驟： 步驟一、球孢白僵菌及假眼小綠葉蟬準備 將球孢白僵菌在斜面培養(yǎng)基上充分產(chǎn)孢后，用10mL的0. 05%Tween80無菌水洗下，置 于振蕩器上180r/min振蕩20min，血球計數(shù)板計數(shù)；將各菌株配制成濃度為（1±0. 5) X 107 孢子/mL的孢子懸液備用； 用掃網(wǎng)法從茶園采集假眼小綠葉蟬，并用自制吸蟲器吸入透氣的D = 7.2cm ;H = 9. 6cm廣口玻璃瓶內(nèi)，以帶嫩葉和幼芽的5-6cm新鮮茶樹枝條室內(nèi)飼養(yǎng)； 步驟二、接菌選擇飼養(yǎng)了 2d的健康成蟲作為供試蟲；采用自制的微型噴菌器，以 (1 ±0. 5) X 107孢子/mL孢子懸液噴霧法接菌；每個廣口瓶裝40-50頭成蟲后，置于噴菌器 正下方，垂直噴菌3下；并在廣口瓶底部放入血球計數(shù)板，以同樣的方法模擬噴菌，統(tǒng)計單 位面積的接菌量； 步驟三、接菌后的試蟲飼養(yǎng)在已滅菌的培養(yǎng)皿中放入酒精瓶蓋，瓶蓋中以浸泡無菌水 的脫脂棉填滿，用橡皮筋將5-6cm的鮮嫩茶樹枝條扎成束后，直插于脫脂棉上，將接菌后的 廣口瓶倒扣于培養(yǎng)皿中，貼好標簽，于（25±1)°C，相對濕度（95±1)%的人工氣候箱中飼 養(yǎng)，2d更換1次鮮嫩枝葉，并在脫脂棉中滴入適量無菌水保濕，每菌株為一處理，每個處理 設(shè)5個重復，每重復接菌40-50頭成蟲；每12h觀察、記錄1次各處理假眼小綠葉蟬的死亡 情況，并及時將死蟲轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用浸泡過無菌室的脫脂棉保濕，置于（25 ± 1) °C的 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察死蟲表面菌絲生長和產(chǎn)孢情況；統(tǒng)計各處理假眼小綠葉蟬死亡數(shù) 和僵蟲數(shù)，蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子為有效致死，僵蟲判斷標準參照童應華等和 何學友等的方法；以噴等量的〇. 05%的TWeen80無菌水處理作為對照； 步驟四、高致病力菌株致死中濃度（LC5(I)的測定 選擇致病力較強，且僵蟲率較高的菌株，分別以（l±〇. 5)X108、（1±0. 5)X107、 (1 ±0. 5) X 106、（1 ±0. 5) X 105、（1 ±0. 5) X 104孢子/mL的5個濃度梯度孢子懸液噴霧法 接種，每個濃度梯度5個重復，每個重復測定40-50頭健康成蟲，以0. 05% Tween80無菌 水作為對照；飼養(yǎng)、觀察和記錄的方法同步驟三。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟一中，供試球孢白僵菌包括BLK 菌株、BB菌株、B3菌株、B187菌株、BNH-04菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，單位面積接菌量為 36. 5-37. 5 孢子 /mm2。
【文檔編號】A01P7/04GK104255807SQ201410466737
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】童應華, 李萬里, 包亞星 申請人:福建農(nóng)林大學