一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及其篩選和鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物殺蟲(chóng)劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一株桉蝙蛾高毒力球孢白僵菌菌株及 其篩選和鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白僵菌（Beauveria bassiana)是當(dāng)前世界上研究和應(yīng)用最廣泛的一種蟲(chóng)生真菌 之一，它具有致病力強(qiáng)、寄主范圍廣、不污染環(huán)境、使用方便、不傷害天敵、能持續(xù)控制害蟲(chóng) 等特點(diǎn)。白僵菌目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)的防治，可用于防治蠐螬、家蠅、介殼蟲(chóng)、白 粉虱、蚜蟲(chóng)、薊馬、馬鈴薯葉甲、蜚蠊、蝗蟲(chóng)、蚱蜢、蟋蟀、棉鈴象、棉跳盲蝽、玉米螟、天牛、甘 蔗金龜子等害蟲(chóng)。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)應(yīng)用白僵菌對(duì)40余種農(nóng)林害蟲(chóng)的防治已經(jīng)取得成功，如今 在生產(chǎn)中使用的主要有：松毛蟲(chóng)、玉米螟、蠐螬、蝗蟲(chóng)、馬鈴薯甲蟲(chóng)、松褐天牛、白蟻、茶小綠 葉蟬、桃小食心蟲(chóng)等。依據(jù)形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)及核酸指標(biāo)將白僵菌屬分為7個(gè)種，分 別是球孢白僵菌、布氏白僵菌、白色白僵菌、多形白僵菌、蠕孢白僵菌、粘孢白僵菌和蘇格蘭 白僵菌，其中最為常見(jiàn)和應(yīng)用最廣泛的是球孢白僵菌。
[0003] 桉蝙蛾是近年來(lái)危害南方主要人工林樹(shù)種桉樹(shù)的主要蛀干害蟲(chóng)，該蟲(chóng)主要危害桉 樹(shù)主干，側(cè)枝也有危害，輕則影響木材的生長(zhǎng)，重則主干斷裂導(dǎo)致死亡。目前為止，關(guān)于該蟲(chóng) 的防治主要集中在化學(xué)農(nóng)藥的防治，化學(xué)農(nóng)藥的使用雖然見(jiàn)效快，但破壞了土壤結(jié)構(gòu)，造成 土壤污染不利于作物生長(zhǎng)，長(zhǎng)期使用使病蟲(chóng)有抗逆性從而影響了防治效果，而且給環(huán)境造 成不良的影響。生物防治具有對(duì)環(huán)境友好且有持續(xù)控制害蟲(chóng)的作用，白僵菌作為生物防治 的主要手段之一已被廣泛應(yīng)用用于數(shù)多種害蟲(chóng)的防治。據(jù)研究報(bào)道，白僵菌對(duì)桉蝙蛾的寄 生率很高，有望成為控制該蟲(chóng)的生物防治手段。因此，研究桉蝙蛾高毒力白僵菌的篩選及鑒 定等基礎(chǔ)研究工作，對(duì)利用生物防治手段持續(xù)該蟲(chóng)意義重大，為蛀干害蟲(chóng)的防治提供了新 的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是通過(guò)從感染白僵菌的桉蝙蛾幼蟲(chóng)上分離純化獲得球孢白僵菌，經(jīng)過(guò)和其 他5株來(lái)源于桉蝙蛾的白僵菌在同等條件對(duì)桉蝙蛾的毒力測(cè)定，篩選出1株高毒力的B-36 球孢白僵菌菌株，具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株新的球孢白僵菌（(Beauveriabassiana (Balsamo) Vuillemin)，代號(hào)為 B-36。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供B-36球孢白僵菌的培養(yǎng)、篩選及鑒定方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明公開(kāi)的球孢白僵菌菌株，代號(hào)B-36,于2015年7月7日保藏在中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO. 11057,保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0009] 本發(fā)明公開(kāi)的B-36球孢白僵菌菌株的形態(tài)學(xué)特征和核糖體DNA-ITS測(cè)序如下：
[0010] 形態(tài)特征：菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌絲寬度為1-3 μ m，透明無(wú)色，分支，有橫隔膜，分生孢子梗 為瓶狀，由分支的菌絲長(zhǎng)出分生孢子梗，分生孢子梗成直角分支，排列成"Z"字形或螺旋狀， 梗上長(zhǎng)出圓柱形或瓶裝的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，分生孢子產(chǎn)于產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的頂端，分生孢子球形或橢圓 形，分生孢子大小長(zhǎng)為2. 20-2. 93 μ m，寬為1. 62-2. 03 μ m。
[0011] DNA-ITS測(cè)試結(jié)果：B-36球孢白僵菌菌株特異性核糖體DNA-ITS序列堿基數(shù) 535bp，具體的氨基酸順序?yàn)椋?br>[0012] tgattcgagg tcacgttcag aagttgggtg ttttacggcg tggccgcgtc ggggttccgg 60 tgcgagctgt atttactacg CagaggtcgG cgcggacggg: ccgGcactcc atttcagggc 110 Cggeggtgtg etgccggtec ccaacgcega cctccccaag gggaggtega gggttgaaat 180 gacgctcgaa caggcatgcc cgccagaatg ctggcgggcg caatgtgcgt tcaaagattc 240 gatgattcac tggattctgc aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg 300 atgccagagc caagagatcc gttgttgaaa gttttgattc atttgttttg ccttgcggcg .360 tattGagaag atgctggaat： acaagagttt gaggtcceeg gegggccgct ggtceagtcc 420 gcftecgggc tggggegagt ccgccgaagc aaGgataggt aggttcacag aagggttggg 4：B0 gagttgaaaa c：tGggtaatg atccctccgc tggttcacca acggagacct tgttc 5.:3:5 〇
[0013] 高毒力B-36球孢白僵菌菌株的篩選方法
[0014] 從感染白僵菌的桉蝙蛾幼蟲(chóng)分離獲得，采用常規(guī)的組織分離法分離和單孢分離法 獲得6株白僵菌菌株，具體如表1所示，分離后采用SDAY培養(yǎng)基在溫度為25 °C，濕度為95 % 培養(yǎng)8-12天，用鉤針鉤取一定量的孢子粉放入裝有0. 1 %吐溫的20mL無(wú)菌水中充分混勻， 逐步稀釋至1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍，得到不同稀釋倍數(shù)的菌液，由于濃度 太高無(wú)法挑取單菌落，取上述后三個(gè)濃度的菌液50-100 μ L分別涂布于SDAY培養(yǎng)基平板， 在溫度為25-26 °C，濕度為80-90 %，pH值為6. 0-7. 0的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天的過(guò)程中， 待長(zhǎng)出單個(gè)白色的菌落后，挑取單菌落轉(zhuǎn)至另一個(gè)SDAY培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中未 發(fā)現(xiàn)有青霉等雜菌污染時(shí)，即可轉(zhuǎn)移至SDAY試管培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后有大量分生孢子長(zhǎng)出， 即可得到白僵菌分生孢子粉，即可將試管貼好標(biāo)簽后轉(zhuǎn)入4°C冰箱冷藏保存，保存半年左右 后轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后繼續(xù)保存。
[0015] 將6株白僵菌菌株培養(yǎng)得到的分生孢子粉，用含有0. 1%吐溫-80的無(wú)菌水將將孢 子洗下，調(diào)整孢子懸浮液的濃度為L(zhǎng)OXlO7個(gè)/mL，將桉蝙蛾幼蟲(chóng)侵入孢子懸浮液中5s后 拿出吸干蟲(chóng)體表面的水分，放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的玻璃瓶中，蓋好瓶蓋放入25°C，90 %濕度條 件下培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭幼蟲(chóng)，以侵入無(wú)菌水的處理為對(duì)照。逐日觀察桉 蝙蛾的死亡情況，統(tǒng)計(jì)死亡率，并計(jì)算致死中時(shí)LT5。值。
[0016] 以各菌株的死亡率對(duì)應(yīng)的幾率值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)天數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，做線 性回歸方程，根據(jù)死亡率計(jì)算LT5。值，LT5。值越小毒力越大，從中篩選出高毒力的B-36球孢 白僵菌。
[0017] 上述SDAY培養(yǎng)基的制備方法：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g、瓊脂粉15-20g 和水1L，PH值自然。制備過(guò)程：取上述稱好的葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母粉IOg加入IL 水中，攪拌至溶解，在將瓊脂粉加入上述溶液邊攪拌邊加熱，待瓊脂粉溶解后分裝至250ml 三角瓶?jī)?nèi)，〇· IMPa壓力下，121°C滅菌20-25min。
[0018] B-36球孢白僵菌的鑒定方法
[0019] 將B-36球孢白僵菌于SDAY液體培養(yǎng)2周后，紗布過(guò)濾，收集菌絲至底部墊濾紙的 滅菌的培養(yǎng)皿上，自然風(fēng)干后放冰箱冷藏備用。將上述干菌絲放入滅菌研缽中，加入液氮充 分研磨，采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，步驟如 下：
[0020] a.將研磨菌絲裝入I. 5ml離心管，加入700 μ L65°C預(yù)熱的Buffer GP1,迅速顛倒 混勻后，將離心管置于65°C水浴20min，期間顛倒離心管數(shù)次。
[0021] b.接入700 μ L氯仿，充分混勻，12 OOOrpm離心5min。
[0022] c.將上清液轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入700 μ L GP2,充分混勻。
[0023] d.將步驟3所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置3min，若以 此不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入，10 OOOrpm離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱重新放回收集 管中。
[0024] e.向吸附柱中加入500 yL Buffer GW1，10 OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0025] f.向吸附柱中加入500 yL Buffer GW2,10 OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0026] g. 12 OOOrpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱置于室溫4min，以徹底晾 干。
[0027] h.將吸附柱置于一個(gè)新的