發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑制品及其預防便秘保健用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑制品及其預防便秘保健用途，發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號CCTCCM2013512。該發(fā)酵乳桿菌能在人的腸道內正常生長。小鼠體內試驗還表明，發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee能夠減緩便秘引起的小鼠體重減輕趨勢，加快排黑便時間，提高小腸推進率，不同程度的增加血清的MTL、Gas、ET、AchE、SP和VIP因子水平，降低SS因子，增加攝食量和飲水量，降低排便量、排便顆粒數(shù)和糞便含水量下降的趨勢，與便秘藥物起到相似的作用，表現(xiàn)出一定的便秘預防效果。最佳使用劑量1.0×109CFU每公斤體重。CCTCC NO：M201351220131025
【專利說明】發(fā)酵乳桿菌Lactobaci I Ius fermentum Lee工作發(fā)酵劑制 品及其預防便秘保健用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種分離自四川省若爾蓋縣 牧民家自然發(fā)酵牦牛酸乳中的可調節(jié)腸道運動、預防便秘的發(fā)酵乳桿菌和以該菌株為發(fā)酵 劑或添加的發(fā)酵乳、健康食品以及動物保健制品中的應用。

【背景技術】
[0002] 乳桿菌與人類生活關系密切，是廣泛應用于食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵及醫(yī)療保健 領域中的有益微生物之一?，F(xiàn)已認識的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬中的許多種都具有特定的優(yōu) 良性質和遺傳性狀，表現(xiàn)出極強的益生菌特性。乳桿菌不僅能夠提高食品營養(yǎng)價值，改善食 品風味，延長保存時間，還可以改善食品的功能性質。它能夠通過分解食物中的蛋白質、糖 類、合成維生素，提高食物的消化率和生物價，促進消化吸收。還能夠減少人體膽固醇含量、 增強免疫功能、抗變異原性、抗腫瘤、抗高血壓等。近年來，乳桿菌以其特殊的生理活性和營 養(yǎng)功能而成為益生菌的主要來源，正日益引起人們的重視。
[0003] 便秘是非常普遍的一種疾病，在人群中的患病率高達27%，它可以影響各年齡段 的人。習慣性便秘因用力增加腹壓，屏氣使勁排便，是誘發(fā)中老年男性高血脂、心腦血管疾 病、動脈硬化、腫瘤等疾病及其并發(fā)癥的罪魁禍首，從而導致老人心腦血管病變死亡率急劇 增加，出現(xiàn)痔瘡、肛裂等問題，令人痛苦不堪。另外長期便秘，大量便渣會滯留在腸道內發(fā) 酵、腐爛，大量毒素和有害菌被腸道反復吸收，通過血液循環(huán)到達人體各部位，成為女性健 康和美麗的罪魁禍首。便秘還會使小孩胃腸道菌群失衡，導致精力不集中、思維遲鈍、營養(yǎng) 不良、心情急躁、消瘦、免疫力下降、易感冒、生長遲緩，如不及時調理，可能造成不可逆的 病變。因便秘發(fā)病率高、病因復雜，患者常有許多苦惱，便秘嚴重時會影響生活質量。因此， 尋找一種能夠代替藥物來預防便秘的生物制品有很大的現(xiàn)實意義，微生態(tài)療法恰是以一個 嶄新的手段解決了傳統(tǒng)療法存在的多種問題。
[0004] 國內外對乳酸菌的生理功能有大量的研究報道，但對乳酸菌預防便秘的功能性研 究報道很少。關于乳酸菌預防便秘的研究對食品科學、預防醫(yī)學和微生態(tài)學等許多學科都 有很大價值。發(fā)酵乳制品是人們攝入乳酸菌的一條重要渠道，篩選優(yōu)良的具有預防便秘和 安全的乳酸菌菌株，對于開發(fā)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳品的附加值將具 有重要意義。因此，具有預防便秘的乳酸菌具很大的研究和應用價值。
[0005] 在目前已經公開的文獻與專利或專利申請中，例如CN101144064A公開了一種具 有抗致突變活性、產胞外多糖的短乳桿菌及其用途，用于發(fā)酵食品中以改善食品品質，增 加其營養(yǎng)學功能。CN1796540A公開了具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌及其用 途，用于制備食品組合物或藥物組合物，殺死或抑制幽門螺旋桿菌或大腸桿菌，治療由其引 起的各種疾病。CN102174450A公開了一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌及其用途，用 于制備藥物組合物、發(fā)酵劑、動物飼料添加劑和保健品中來預防或減輕幽門螺桿菌的感染。 CN101144065A公開了一種耐過氧化氫、清除自由基的抗氧化干酪乳桿菌及其用途，用于發(fā) 酵食品及乳品膠囊制品中以開發(fā)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳品的附加值。 但是，這些專利或專利申請沒有完全涉及具有調節(jié)腸道運動、預防便秘等性能的微生物。因 此，目前還需要有一種具有調節(jié)腸道運動、預防便秘的微生物及其含有它們的食品。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種所述發(fā)酵乳桿菌在發(fā)酵食品中的用途。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的。
[0009] 一種發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品，發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum strain Lee，CCTCC N0:M2013512(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國武漢，武漢大學2013. 10. 25)，采 用如下的步驟制得：
[0010] 1)將上述發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee原始菌種接種于MRS液體培 養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按2-4%體 積接種于MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-18h，在4°C條件下4000r/min離心15min，去除上清液，得 到細胞沉淀，將沉淀用一定量的無菌脫脂乳制成懸浮液，得到工作發(fā)酵劑備用；2)由1)所 得目標工作發(fā)酵劑直接添加到食品中，或者與可共生的制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑一起使用 制備發(fā)酵乳。
[0011] 與本發(fā)明申請（II )相關的不同工作發(fā)酵劑產生途徑（I )的發(fā)明專利申請已同 日提出。
[0012] 本發(fā)明人從自然發(fā)酵牦牛酸乳中篩選出一株發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Le，保藏編號 CCTCCM2013512。
[0013] 該發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee的形態(tài)學特征：
[0014] 菌體特征：呈革蘭氏染色陽性，細胞桿狀，菌體約0. 5-1. 0 ii m寬，1. 5-4 ii m長，成 單、成對或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形。
[0015] 菌落特征：在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0.5-2. Omm之間，圓形，邊緣整 齊，乳白色，透明，表面濕潤光滑，不產生色素，參見附圖1和2。
[0016] 本發(fā)明發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee的體內耐受特征：
[0017] 發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee菌株耐酸性較強，在pH3. 0的人工胃 液下3h后存活率達到了 40. 48 ±1. 84% ;在0. 3 %濃度膽鹽下存活率達到60% ;發(fā)酵乳桿 菌 Lactobacillus fermentum Lee 細胞的疏水性也達到了 15. 17±6. 20%。
[0018] 本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，屬公 認安全（Generally Recognized As Safe, GRAS)菌種，可用于發(fā)酵食品中。
[0019] 所述的發(fā)酵食品是乳酸菌奶飲料、乳粉、膠囊制品或發(fā)酵乳可為人類食品、動物飼 料或保健品。
[0020] 所述食用對象包括人類和養(yǎng)殖動物，方法添加在日常食品中使食用對象獲得調節(jié) 腸道運動預防便秘的保健作用。
[0021] 一種發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品調節(jié)腸道運動預防便秘保健用途，作為發(fā)酵劑添 加到食品中添加或者與可共生的制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑一起使用制備發(fā)酵乳，以獲得調 節(jié)腸道運動預防便秘保健作用，最佳使用劑量I. OX IO9CFU每公斤體重。
[0022] 下面分別描述所述發(fā)酵食品的制備方法。
[0023] 所述的乳酸菌奶飲料是按照下述步驟制備得到的：
[0024] 首先，所述發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee原始菌種在溫度_75°C下以 30% (重量）甘油懸液形式保存，或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆谩?br> [0025] 原料乳在95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫熱殺菌2s，然后冷卻到4°C， 再加入前面所述的發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑，使其濃度達到 106cfu/mL以上，在4°C冷藏保存即得到含發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee活菌 的乳酸菌奶飲料。
[0026] 發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee菌株的耐酸性較強，在pH3. 0的 人工胃液下3h后存活率達到了 40. 48± 1. 84 %，在0. 3 %濃度膽鹽下存活率達到60 %， Lactobacillus fermentum Lee細胞的疏水性也達到了 15. 17±6. 20%。這表明發(fā)酵乳桿 菌Lactobacillus fermentum Lee能在人的腸道內正常生長。小鼠體內試驗還表明，發(fā)酵 乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee能夠減緩便秘引起的小鼠體重減輕趨勢，加快排黑 便時間，提高小腸推進率，不同程度的增加血清的MTL、Gas、ET、AchE、SP和VIP因子水平， 降低SS因子，增加攝食量和飲水量，降低排便量、排便顆粒數(shù)和糞便含水量下降的趨勢，與 便秘藥物起到相似的作用，表現(xiàn)出一定的便秘預防效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖 1 發(fā)酵乳桿菌 Lactobacillus fermentum Lee 菌落形態(tài)。
[0028] 圖 2 發(fā)酵乳桿菌 Lactobacillus fermentum Lee 的菌體形態(tài)（IOOOx)。
[0029] 圖3小鼠體重隨實驗時間的變化。
[0030] 圖4不同組小鼠首次排黑便所需時間。
[0031] 圖5不同組小鼠的小腸總長度。
[0032] 圖6不同組小鼠的小腸推進率。
[0033] 圖7不同組小鼠血清中各因子水平。其中，圖a. MTL因子；圖b. Gas因子；圖c. ET 因子；圖d. SS因子；圖e. AchE因子；圖f. SP因子；圖g. VIP因子。

【具體實施方式】 [0034]
[0035] 在以下敘述中，所述的加熱殺菌是例如使用上海沃迪自動化裝備股份有限公司銷 售的TW10D1000型管式殺菌機進行的。高溫熱殺菌是例如使用北京勇創(chuàng)嘉業(yè)機械設備有限 公司銷售的YC-104型板式超高溫殺菌機進行的。
[0036] 含發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee的乳粉是按照下述步驟制備得到 的：
[0037] 按照上述乳酸菌奶飲料的制備方法制備，只是原料乳在95°C下加熱殺菌20min 或在140°C下高溫熱殺菌2s，然后冷卻到37°C，再以原料乳體積的4%接菌量接種前面所述 的發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑，再在37°C下發(fā)酵16h，得到發(fā) 酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee發(fā)酵乳；然后所述的發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee發(fā)酵乳按照1:3 (V:V)加到上述滅菌原料乳中，進行均質，真空濃縮、噴霧干 燥得到含發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee的乳粉。
[0038] 所述的均質是例如使用常州市均質機械有限公司銷售的GJB500-40小型均質機 進行的。
[0039] 所述的濃縮是例如使用上海偉宙輕工機械有限公司銷售的真空濃縮鍋進行的。
[0040] 所述的噴霧干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司銷售的實驗型噴霧干燥機進 行的。
[0041] 另外，所述的膠囊制品是按照下述步驟制備得到的：
[0042] 將原料乳在140°C高溫熱殺菌2s，然后冷卻至37°C，以原料乳體積的4%接菌量接 種本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑，在37°C下發(fā)酵16h， 得到發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee發(fā)酵乳。將發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee發(fā)酵乳以1:3(V:V)加入滅菌后的原料乳中均質，經真空濃縮、噴霧干燥處 理后得到乳粉，將得到的乳粉裝到膠囊中制成膠囊制品。
[0043] 此外，所述的發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的：
[0044] 按照上述乳酸菌奶飲料的制備方法制備，只是原料乳在95°C下加熱殺菌20min或 在140°C下高溫熱殺菌2s，然后冷卻到37°C，再按照3-5% (體積）加入前面所述的發(fā)酵乳 桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑，再加入3-5% (體積）可共生的制備發(fā) 酵乳商品發(fā)酵劑，混勻后在37°C下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計0. 6-0. 7%，然后冷卻至 4°C，再進行冷藏保存得到所述的發(fā)酵乳。
[0045] 所述的商品發(fā)酵劑優(yōu)選的是保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。
[0046] 在本發(fā)明的意義上，所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復原奶的原料 乳。
[0047] 實施例1 :發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee的分離、純化及初步鑒定
[0048] 該實施例按照下述步驟進行：
[0049] (I)Lactobacillus fermentum Lee 的分離、純化
[0050] 以無菌操作吸取樣品500 ii L加入至5mL滅菌生理鹽水混合作成1 :10的均勻稀釋 液，并繼續(xù)作一定比例的稀釋。選擇合適梯度的稀釋液，用無菌槍頭各吸取IOOu L分別涂 布到MRS固體平板培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48-72h，觀察記錄菌落形態(tài)（圖1)。用接種環(huán)（或 滅菌牙簽）從平板表面及內部挑取不同菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置30°C，300r搖床 培養(yǎng)24-48h ;重復以上步驟連續(xù)活化2代后進行涂片革蘭氏染色鏡檢（圖2)，確定為G+菌 的繼續(xù)活化，直至得到純菌落（鏡檢無雜菌），并進行過氧化氫酶實驗。將G+和過氧化氫酶 陰性的無芽孢桿菌、球菌及鏈球菌均暫定為乳酸菌，并保存，具體操作參照《微生物學實驗 技術》。
[0051] 實驗結果顯示，從若爾蓋縣的十個樣品中共分離出乳酸菌56株，乳酸菌活菌數(shù)平 均在108cfu/mL數(shù)量級。
[0052] (2)Lactobacillus fermentum Lee 的初步鑒定
[0053] 革蘭氏染色：取典型菌落涂片，進行革蘭氏染色，在微生物顯微鏡油鏡下觀察菌體 形態(tài)及其排列方式。挑取視野清晰、形態(tài)典型的菌株，進行拍照。過氧化氫酶實驗：挑取固 體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液2mL，觀察結果（于半 分鐘內發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性）。
[0054] 結果表明，從樣品中分離純化出的菌株均能在含5%。CaCO3的MRS平板培養(yǎng)基上生 長，并在菌落周圍形成溶鈣圈，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶試驗陰性。
[0055] 實施例2 :發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee的體外篩選 [0056] (1)益生菌耐受pH3. 0人工胃液的篩選
[0057] 人工胃液的配制：NaClO. 2%、胃蛋白酶0.35%、用IM的HCl調整pH值為3.0后， 在無菌操作臺中用真空泵抽濾除菌后備用。
[0058] 益生菌對人工胃液耐受性的測定：取5mL已經活化好的菌株培養(yǎng)液，在無菌操作 臺中倒入已滅菌IOmL離心管中，經3000r/min離心IOmin收集菌體，加入5mL滅菌生理鹽水 混勻制成菌懸液，取ImL菌懸液與9mL pH3. 0的人工胃液混合，搖勻，置于恒溫振蕩器中培 養(yǎng)（37°C，300r)，并分別在Oh和3h取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注37°C培養(yǎng)48h。用平板計 數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率:存活率（％)= 3h的活菌數(shù)/Oh的活菌數(shù)X 100%
[0059] (2)益生菌耐受不同濃度膽鹽的測定
[0060] 選擇在pH3. 0人工胃液中存活率在10%以上的菌種做不同膽鹽濃度下的生長測 試。將活化好的菌種5mL按2%的接種量（IOOii L)用移液槍分別接種于含0.0%牛膽鹽 (即空白）、〇? 3%牛膽鹽、0.5%牛膽鹽、1.0%牛膽鹽（W/V)的MRS-THIO培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng) 基中加0. 2%的巰基乙酸鈉）。在恒溫振蕩器中37°C培養(yǎng)24h后，以空白培養(yǎng)基為對照（未 接種的MRS-THIO培養(yǎng)基），分別測定上述不同濃度培養(yǎng)基的OD值，計算菌株對膽鹽的耐受 力。膽鹽耐受力=含膽鹽的培養(yǎng)基的OD值/空白培養(yǎng)基的OD值X 100%
[0061] (3)菌液濃度調整
[0062] 選擇在pH3. 0人工胃液中存活率在10%以上、耐膽鹽較強的的菌種，經鏡檢觀察 菌體生長形態(tài)良好后進行試驗，將活化好的細菌培養(yǎng)物5mL，在無菌操作臺中倒入已滅菌 10mT,離心管中，以3000r/min離心IOmin收集菌體。以5mLPBS (50mM，pH6. 5)緩沖液洗漆 菌體，3000r/min離心lOmin，重復洗滌兩次。以PBS緩沖液為空白對照，用緩沖液調整受試 菌株菌體濃度，使其在560nm波長下AO值約為1. 00。取4mL調整好濁度的菌液于已滅菌 IOmL離心管中，加入0. 8mL二甲苯，對照組不加二甲苯，振蕩30s，停頓10s，后再振蕩30s， 于試管架上靜置5?IOmin分層，取下層水相，以PBS緩沖液為空白對照，在560nm下測量 A值并進行記錄。疏水率H%= [(AO-A)/AO] X 100其中AO和A分別是與二甲苯混勻前、后 菌液在560nm下測量得到的A值。
[0063] 乳酸菌是正常腸道菌的一部分，作為益生菌的首要條件之一，是能在胃和小腸前 段存活，被篩選的菌株應具有足夠的耐酸性和酸性環(huán)境下生長發(fā)育的特性。
[0064] Lactobacillus fermentum Lee 的篩選結果如表 1 所不。

【權利要求】
1. 一種發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee工作發(fā)酵劑制品，中國典型培養(yǎng)物 保藏中心保藏編號CCTCCM2013512,采用如下的步驟制得目標物： 1)將上述發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum Lee原始菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基 中，在37°C條件下培養(yǎng)12-16h進行活化，連續(xù)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按2-4%體積接 種于MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-18h，在4°C條件下4000r/min離心15min，去除上清液，得到細 胞沉淀，將沉淀用一定量的無菌脫脂乳制成懸浮液，得到工作發(fā)酵劑備用；2)由1)所得目 標工作發(fā)酵劑直接添加到食品中，或者與可共生的制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑一起使用制備 發(fā)酵乳。
2. 根據(jù)權利要求1或2所述之發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品，其特征在于，所述商業(yè)發(fā)酵 劑為保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。
3. -種發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品調節(jié)腸道運動預防便秘保健用途，作為發(fā)酵劑添加 到食品中添加或者與可共生的制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑一起使用制備發(fā)酵乳，以獲得調節(jié) 腸道運動預防便秘保健作用，最佳使用劑量1. OX 109CFU每公斤體重。
4. 根據(jù)權利要求3所述之發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品調節(jié)腸道運動預防便秘保健用 途，所述食品包括人類食品、動物飼料或保健品。
5. 如權利要求3所述之發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑制品調節(jié)腸道運動預防便秘保健用途， 其特征在于，所述食用對象包括人類和養(yǎng)殖動物，方法添加在日常食品中使食用對象獲得 調節(jié)腸道運動預防便秘的保健作用。
【文檔編號】A23K1/16GK104381440SQ201410340109
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年7月17日 優(yōu)先權日:2014年7月17日
【發(fā)明者】李鍵, 索化夷, 騫宇, 趙欣, 蘭道亮, 陳煉紅, 謝婕 申請人:西南民族大學