一株酚酸類化感物質(zhì)降解菌及其菌劑的制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株酚酸類化感物質(zhì)降解菌及其菌劑的制備和應(yīng)用；本發(fā)明涉及的BJS-1-3菌株，來源于泰安多年生楊樹根際土壤，經(jīng)人工富集、篩選及純化得到；該菌株對苯甲酸具有較強的降解能力；能夠分別利用阿魏酸、對羥基苯甲酸、香草醛、肉桂酸、根皮苷等酚酸類化感物質(zhì)作為唯一碳源生長繁殖；能夠在楊樹、蘋果、黃瓜根際穩(wěn)定定殖。利用該菌株制備的菌劑可有效防治因酚酸類化感物質(zhì)積累造成的楊樹、蘋果、黃瓜等植物的連作障礙；菌劑的制備工藝簡單、發(fā)酵周期短、成本低，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一株酚酸類化感物質(zhì)降解菌及其菌劑的制備和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株酚酸類化感物質(zhì)降解菌及其菌劑的制備和應(yīng)用，屬于農(nóng)用微生物

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 某些植物可通過地上部淋溶、根系分泌和植株殘茬腐解等途徑，釋放一些物質(zhì)對 同茬或下茬同種或同科植物生長產(chǎn)生抑制作用，這種現(xiàn)象稱為自毒作用。產(chǎn)生自毒作用的 物質(zhì)有有機酸、直鏈醇、簡單酚類、酚酸、單寧、醛類、萜類、氨基酸和生物堿等。研究證明，苯 甲酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、根皮苷等酚酸類化合物是楊樹、黃瓜、蘋果等植物主要的自毒 物質(zhì)。連作條件下，自毒物質(zhì)的積累是造成連作障礙的主要原因之一。酚酸類化感物質(zhì)主 要通過以下方式維持自毒作用。
[0003] (1)影響細胞膜的功能，抑制植物對養(yǎng)分的吸收。酚酸類化感物質(zhì)對細胞膜的破壞 可能是化感物質(zhì)所產(chǎn)生的自毒效應(yīng)的起點。研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和肉桂酸處理12h后能增加 大豆根系離子的滲透量，誘導(dǎo)類脂的過氧化作用、抑制抗氧化酶系統(tǒng)的活性，從而破壞細胞 膜的完整性而影響大豆對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。
[0004] (2)影響各種酶的功能和活性。酚酸類化感物質(zhì)可影響許多酶的活性，研究發(fā)現(xiàn)， 對羥基苯甲酸和苯丙烯酸能夠強烈抑制黃瓜根系脫氫酶、根系結(jié)合ATP酶、硝酸還原酶、超 氧化物歧化酶的活性，且隨處理濃度的增大抑制作用增強。酚類化合物如肉桂酸及其衍生 物抑制ATP酶的水解作用，丹寧等可強烈抑制纖維素酶的活性，使纖維素、半纖維素的分解 減慢，也可以使過氧化氫酶的活性降低。
[0005] (3)影響植物的光合、呼吸作用和根尖的生長。酚酸類化感物質(zhì)對呼吸作用的影 響主要是抑制線粒體的電子傳遞和氧化磷酸化，而對光合作用的影響主要表現(xiàn)為使葉綠素 含量和光合速率降低。據(jù)報道，苯丙烯酸濃度在80 μ mol · I/1時，顯著降低了黃瓜幼苗的 葉面積、葉綠素 a含量、光合速率、蒸騰速率、根系活力，葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)也受到破 壞，濃度達到150 μ mol 時，顯著減少了全株干重和氣孔總數(shù)，細胞器出現(xiàn)解體現(xiàn)象。另 夕卜，研究表明，茄子的自毒物質(zhì)2,6_二叔基苯酚和鄰苯二甲酸二甲酯使葉綠素含量、光合 速率、氣孔導(dǎo)度下降，并且對葉片的光合機構(gòu)造成了傷害。
[0006] 微生物可以影響自毒物質(zhì)的數(shù)量和種類，對緩解自毒作用起到重要作用。一方面， 某些微生物能夠利用苯甲酸等酚酸類自毒物質(zhì)作為唯一碳源，減弱或消除自毒作用。另一 方面，某些有益微生物能夠抑制土壤中病原菌的數(shù)量或干擾病原菌對寄主植物的侵染，改 善植株根際的土壤生態(tài)環(huán)境，從而間接緩解自毒作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株酚酸類化感物質(zhì)降解菌及其菌劑的制備和 應(yīng)用，能夠降解酚酸類化感物質(zhì)的細菌，可用于防治楊樹、蘋果、黃瓜等植物的連作障礙。
[0008] 一株保藏編號為 CGMCC No. 6635 的蠟狀芽孢桿菌 BJS-1-3 (Bacillus cereus BJS-1-3)，已于2012年9月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 該菌株對苯甲酸具有較強的降解能力；能夠分別利用阿魏酸、對羥基苯甲酸、香草 醒、肉桂酸或根皮苷作為唯一碳源生長繁殖；能夠在楊樹、蘋果、黃瓜根際穩(wěn)定定殖。
[0010] 利用上述蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為蠟狀芽孢桿菌 BJS-1-3芽孢，所述的微生物菌劑為液體菌劑或固體粉劑。
[0011] 一種蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0012] (1)菌種活化：將低溫保存的蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3菌株接種于LB固體培養(yǎng)基平 板上，在32°C下培養(yǎng)24-36h ;挑取單菌落轉(zhuǎn)接于LB斜面培養(yǎng)基上，在32°C下培養(yǎng)16-24h， 用無菌水洗下培養(yǎng)基表面菌體作為接種液。
[0013] (2) -級種子液制備：按照0· 1% -0· 5% (體積百分比）的接種量向LB液體培養(yǎng) 基接入步驟（1)制備的接種液，轉(zhuǎn)速200r/m，溫度32°C，搖瓶培養(yǎng)12-16h，作為一級種子液。
[0014] (3)二級種子液制備：按照5% -10% (體積百分比）的接種量向LB液體培養(yǎng)基 中接入步驟2)制備的一級種子液，轉(zhuǎn)速180r/m，溫度32°C，搖瓶培養(yǎng)6-12h，作為二級種子 液。
[0015] (4)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟3)所得二級種子液按照1% -2% (體積百分比）的接種 量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為28-32°C，通氣量為1:0. 5-1:1. 5,攪拌速度為 200-300r/m，培養(yǎng)時間為20-24h，得到BJS-1-3菌株的液體菌劑。
[0016] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及其重量百分比為：葡萄糖1%，玉米粉5%，脫脂豆 粉4 %，玉米漿3 %，NaC16 %，MnS040. 2 %，余者為水；
[0017] 所述的通氣量為每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的比值。
[0018] 本發(fā)明還提供了利用蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3生產(chǎn)的微生物菌劑在防治楊樹、蘋 果、黃瓜等植物連作障礙中的應(yīng)用。
[0019] 上述蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3菌劑可應(yīng)用于防治因酚酸類化感物質(zhì)積累造成的楊 樹、蘋果、黃瓜等植物的連作障礙。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點
[0021] 1、蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3能夠在較高濃度酚酸類物質(zhì)的條件下正常生長，能夠在 楊樹、蘋果、黃瓜等植物根際穩(wěn)定定殖并發(fā)揮高效降解作用。
[0022] 2、該菌株具有底物多樣性，能夠利用阿魏酸、對羥基苯甲酸、香草醛、肉桂酸、根皮 苷等多種酚酸類化合物作為唯一碳源。
[0023] 3、利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)微生物菌劑，成本低廉，發(fā)酵周期短，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為根據(jù)16S rDNA序列利用Mega4. 0分析獲得的BJS-1-3菌株的系統(tǒng)進化樹。
[0025] 由圖1可以看出，BJS-1-3菌株與芽胞桿菌屬的遺傳進化距離最近，與已知菌株蠟 樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，JN411277)的16S rRNA的同源性達到99%，結(jié)合其菌體形 態(tài)和菌落特征觀察結(jié)果及生理生化指標的測定結(jié)果，將其鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus) 〇
[0026] 圖2為苯甲酸含量測定標準曲線。
[0027] 決定系數(shù)R2 = 0. 9997,符合測定要求；P < 0. 0001，表明模型極顯著；得到的線性 回歸方程為 y = 〇· 0696χ-0· 0414。

【具體實施方式】：
[0028] 實施例一
[0029] 1、酚酸類化感物質(zhì)降解菌BJS-1-3的分離
[0030] 苯甲酸降解菌的馴化：采集連作多年的楊樹根際土壤，取5g，加入到裝有45ml富 集培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C、150r/m搖瓶培養(yǎng)，3d為一個馴化周期，共4個周期，每個周期期 滿將培養(yǎng)液以10% (體積百分比）的接種量接到富集培養(yǎng)基中30°C、150r/m搖瓶培養(yǎng)繼續(xù) 培養(yǎng)。富集培養(yǎng)基中苯甲酸的濃度根據(jù)馴化周期依次增加，4個周期苯甲酸的初始濃度分別 為 500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2500mg/L。
[0031] 以苯甲酸為唯一碳源的降解菌的分離：在含2500mg/L苯甲酸的富集培養(yǎng)基中馴 化完成后，按所述苯甲酸降解菌的馴化方法，再接種到含苯甲酸的無機鹽培養(yǎng)基（MM)中培 養(yǎng)3個周期，3個周期苯甲酸的初始濃度分別為1000mg/L、1500mg/L、2500mg/L。選擇苯甲 酸初始濃度2500mg/L的處理中渾濁度較高者劃線得單菌落，獲得一株酚酸類化感物質(zhì)降 解菌 BJS-1-3。
[0032] 富集培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨10. 0g、NaCll.Og、KH2P041.0g和水1000ml，pH值 7· 0-7. 2。
[0033] 無機鹽培養(yǎng)基（ΜΜ)的組成為：ΝΗ4Ν031· 0g、MgS04 · 7Η200· 5g、（ΝΗ4) 2S040. 5g、 NaClO. 5g、K2HP04l. 5g 和水 1000ml，pH 值 7. 0。
[0034] 酚酸類化感物質(zhì)降解菌BJS-1-3的保存方法：短期保存采用LB固體培養(yǎng)基平板保 存，長期保存采用甘油管保存。
[0035] 2、BJS-1-3菌株的鑒定
[0036] (1)菌體形態(tài)特征
[0037] BJS-1-3菌株在LB培養(yǎng)基上生長12h后菌落呈乳白色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤。 顯微鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿狀。
[0038] (2)生理生化特征
[0039] BJS-1-3菌株的生理生化特征見表1。
[0040] 表1 BJS-1-3菌株的生理生化特征
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一株保藏編號為CGMCC No. 6635的蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus BJS-1-3,保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2. 使用如權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3制備的蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3微生 物菌劑，其特征在于其制備方法如下： (1) 菌種活化：將低溫保存的蠟狀芽孢桿菌BJS-1-3菌株接種于LB固體培養(yǎng)基平板 上，在32°C下培養(yǎng)24-36h ;挑取單菌落轉(zhuǎn)接于LB斜面培養(yǎng)基上，在32°C下培養(yǎng)16-24h，用 無菌水洗下培養(yǎng)基表面菌體作為接種液； (2) -級種子液制備：按照體積百分比0. 1% -0. 5%的接種量向LB液體培養(yǎng)基接入步 驟1)制備的接種液，轉(zhuǎn)速200r/m，溫度32°C，搖瓶培養(yǎng)12-16h，作為一級種子液； (3) 二級種子液制備：按照體積百分比5% -10%的接種量向LB液體培養(yǎng)基中接入步 驟2)制備的一級種子液，轉(zhuǎn)速180r/m，溫度32°C，搖瓶培養(yǎng)6-12h，作為二級種子液； (4) 發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟3)所得二級種子液按照體積百分比1% -2%的接種量接入發(fā)酵 培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為28-32°C，通氣量為1:0. 5-1:1. 5,攪拌速度為200-300r/m， 培養(yǎng)時間為20-24h，得到BJS-1-3菌株的液體菌劑； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及其重量百分比為：葡萄糖1%，玉米粉5%，脫脂豆粉 4%，玉米漿 3%，NaC16%，MnS040. 2%，余者為水； 所述的通氣量為每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的比值。
3. 如權(quán)利要求2所述的狀芽孢桿菌BJS-1-3微生物菌劑在防治楊樹、蘋果和黃瓜植物 連作障礙中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01B79/00GK104099272SQ201410325083
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】劉訓(xùn)理, 趙旭, 毛志泉, 隋君康, 姜紅霞, 灑榮波, 王曉輝, 肖成澤, 王偉燕 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)