玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因及其應(yīng)用。本發(fā)明從玉米中分離得到5個(gè)鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因，其cDNA序列分別選自SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7或SEQIDNo.9所示的核苷酸序列。亞細(xì)胞定位表明，這些基因所編碼的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體定位在細(xì)胞的質(zhì)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs基因均具有鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本發(fā)明ZmZIPs基因?qū)τ谡{(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存鋅鐵的能力，促進(jìn)胚和胚乳的發(fā)育、成熟，增加作物種子中鋅鐵含量等方面具有重要的應(yīng)用景。
【專利說明】玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZ I Ps基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從植物中分離的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，尤其涉及從玉米中分離的與 鋅鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存有關(guān)的調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體 ZmZIPs基因在調(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅或鐵能力，促進(jìn)胚和胚乳的發(fā)育或成熟以及增 加糧食作物種子鋅鐵含量中的應(yīng)用，屬于植物金屬離子調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的分離和應(yīng)用領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長發(fā)育過程中有著重要作用 (ffintz H,Fox T, Wu YY, et al. Expression profiles of Arabidopsis thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis.The Journal of biological chemistry2003, 278(48) :47644-47653.)。鋅是生物體 300 多種酶和重要 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)輔助因子（Haydon MJ, Cobbett CS. A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis. Plant physiology2007, 143 (4) : 1705-1719.)。鋅不僅參與機(jī)體的各種代謝，在生物 膜穩(wěn)定和基因表達(dá)調(diào)控等生理機(jī)能中也擔(dān)負(fù)著重要的角色（Mathews WR，Wang F，Eide DJ, et al. Drosophila fear of intimacy encodes a Zrt/IRT-like protein(ZIP)family zinc transporter functionally related to mammalian ZIP proteins. The Journal of biological chemistry2005, 280(1) :787-795.)。適量增加植物體內(nèi)鋅的含量可提高作物產(chǎn) 量，而鋅的缺乏會(huì)導(dǎo)致葉綠素、脂質(zhì)、蛋白、質(zhì)膜的氧化破壞，植物體內(nèi)鋅離子的過度積累又 會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害。
[0003] 鐵在細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，是重要的 電子傳遞體，因此，鐵元素在原核和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能。另外， 細(xì)胞內(nèi)過高的Fe 3YFe2+氧化還原勢(shì)會(huì)導(dǎo)致超氧化合物的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞造成傷害（Briat JFjLebrun M. Plant responses to metal toxicity. Comptes rendus de IiAcademie des sciences Serie III，Sciences de la viel999, 322(1) :43-54.)。因此，嚴(yán)格控制植物體內(nèi) 金屬離子的平衡是至關(guān)重要的。
[0004] 參與鋅鐵吸收的蛋白主要有三類，都是以蛋白家族形式存在的，包括：ZIP，即 鋒調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Zinc-regulated transporter，ZRT)和鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Iron-regulated transporter，IRT)。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示ZIP家族基因能夠轉(zhuǎn)運(yùn)包括Zn 2+、Fe2+、 Cu2+、Cd2+ 在內(nèi)的多種金屬離子（Colangelo EP，Guerinot ML. Put the metal to the petal:metal uptake and transport throughout plants.Current opinion in plant biology2006, 9 (3) : 322-330.)。ZIP -般由309-476個(gè)氨基酸殘基組成，有8個(gè)潛在的跨膜 結(jié)構(gòu)域和相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，第3和第4跨膜區(qū)之間有一長的可變區(qū)，可變區(qū)位于胞內(nèi)，其C、 N末端位于胞外，該區(qū)富含組氨酸殘基，可能與金屬的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)（Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters. Biochim Biophys Acta2000, 1465 (1-2) : 190-198.) 〇
[0005] 目前在擬南芥、水稻、蒺藜、苜蓿、大豆、野生型二粒小麥、葡萄等植物中鑒定出ZIP 基因并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)16個(gè)ZIP家族基因，AtIRTl是通過酵母互補(bǔ) 實(shí)驗(yàn)分離得到的第一個(gè)ZIP功能基因，其主要在根部表達(dá)，且該基因的過表達(dá)可導(dǎo)致鎳的 過度積累（Eide D，Broderius M，F(xiàn)ett J，et al. A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americal996, 93 (11) : 5624-5628 ; Henriques R，Jasik J，Klein M，et al.Knock-out of Arabidopsis metal transporter gene IRTlresults in iron deficiency accompanied by cell differentiation defects. Plant molecular biology2002,50 (4-5):587-597 ；Varotto Cj Maiwald Dj Pesaresi Pj et al.The metal ion transporter IRTlis necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant journal:for cell and molecular biology2002, 31 (5):589-599 ;Vert G，Grotz N，Dedaldechamp F，et al. IRTlj an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth.Plant Cell2002, 14(6):1223-1233 ；Nishida Sj Tsuzuki Cj Kato A, et al. AtIRTlj the primary iron uptake transporter in the root, mediates excess nickel accumulation in Arabidopsis thaliana. Plant&cell physiology2011,52 (8):1433-1 442.)。AtIRT2主要在根部表達(dá)，定位在囊泡，推測(cè)具有細(xì)胞內(nèi)過量金屬元素的解毒功 會(huì)巨(Vert GjBriat JFjCurie C.Arabidopsis IRT2gene encodes a root-periphery iron transporter. The Plant journal:for cell and molecular biology2001, 26(2):181-189 ； Vert Gj Barberon Mj Zelazny Ej et al. Arabidopsis IRT2cooperates with the high-affinity iron uptake system to maintain iron homeostasis in root epidermal cells. Planta20 09, 229 (6) : 1171-1179. 14, 15)。AtIRT3能互補(bǔ)鋅、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)雙突變體，過表達(dá)AtIRT3會(huì)使鋅 在地上部以及鐵在地下部積累（Lin YF，Liang HM，Yang SY，etal. Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytol ogist2009, 182(2) :392-404.)。表達(dá)分析顯示，六七21?1、六七21?54七21?9、六七21?12和六《訂3 受缺鋅誘導(dǎo)，由此推測(cè)，這些基因在缺鋅條件下可能增強(qiáng)鋅的吸收能力（Kramer U，Talke IN，Hanikenne Μ· Transition metal transport. FEBS Lett2007, 581 (12) : 2263-2272.)。
[0006] 玉米（Zea mays)是中國重要的糧食、飼料和經(jīng)濟(jì)作物，增加玉米籽粒中鋅、鐵等 微量元素的含量，對(duì)提高飲食或飼料利用效率、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人體健康尤為重要。目 前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其中ZH^Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)基因家方矣對(duì)鋒、鐵等二 價(jià)金屬離子的吸收、運(yùn)輸和儲(chǔ)存起著重要作用，在擬南芥、水稻、大麥、大豆上，已報(bào)道了一 些有關(guān)ZIP家族基因的研究，但對(duì)ZIP家族基因在植物體內(nèi)具體的作用機(jī)制尚未完全了解， 而關(guān)于玉米的ZIP家族基因的研究報(bào)道較少。了解Zn 2+、Fe2+在玉米中的吸收、運(yùn)輸方式， 分布規(guī)律和調(diào)節(jié)機(jī)制，將有助于改善玉米在鋅、鐵缺乏的環(huán)境中的生長發(fā)育，為進(jìn)一步揭示 玉米中ZIP家族基因的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為玉米鋅、鐵高效轉(zhuǎn)基因育種提供候選基因，也 為人類鋅鐵營養(yǎng)提供良好的基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因；
[0008] 本發(fā)明的目的之二是提供鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因所編碼的蛋白質(zhì)；
[0009] 本發(fā)明的目的之三是將所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因應(yīng)用于調(diào)控植物對(duì)鋅鐵等金 屬離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存，促進(jìn)胚根和胚芽發(fā)育以及胚成熟或者增加糧食作物籽粒中鋅 鐵含量。
[0010] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPl基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0012] (a)、SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；
[0013] (b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸序列；
[0014] (c)、與SEQ ID No. 1所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
[0015] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP2基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0016] (a)、SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；
[0017] (b)、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的核苷酸序列；
[0018] (c)、與SEQ ID No. 3所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
[0019] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP3基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0020] (a)、SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；
[0021] (b)、編碼SEQ ID No. 6所示氨基酸的核苷酸序列；
[0022] (c)、與SEQ ID No. 5所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
[0023] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP7基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0024] (a)、SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列；
[0025] (b)、編碼SEQ ID No. 8所示氨基酸的核苷酸序列；
[0026] (c)、與SEQ ID No. 7所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
[0027] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP8基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0028] (a)、SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列；
[0029] (b)、編碼SEQ ID No. 10所示氨基酸的核苷酸序列；
[0030] (c)、與SEQ ID No. 9所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
[0031] 所述"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通 常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更 高（例如超過本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不 同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探 針100%互補(bǔ)的祀序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)〇 更 具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)（Tm)約 5-KTC。Tm為在平衡狀態(tài)下50 %與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度（在指定 離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下）（因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50%的 探針被占據(jù)）。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件：其中在PH7. 0到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子 濃度，通常為約〇· 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對(duì)于短探針（包括（但不 限于）10到50個(gè)核苷酸）而言為至少約30°C，而對(duì)于長探針（包括（但不限于）大于50個(gè) 核苷酸）而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于 選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例 示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC，1% SDS，在65 °C下培養(yǎng)，在0.2 X SSC中洗滌和在65 °C下于0. 1 % SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行 5、15、30、60、120min 或更長時(shí)間。
[0032] 優(yōu)選的，本發(fā)明從玉米中所分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、 ZmZIP7 或 ZmZIP8 基因的 cDNA 序列分別為 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列。
[0033] 本發(fā)明目的之二是提供由上述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因（ZmZIPl、ZmZIP2、 ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8)所編碼的能夠吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅鐵的蛋白質(zhì)；
[0034] 本發(fā)明目的之二是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0035] ZmZIPs基因所編碼的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0036] (a)、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示的 氨基酸序列；
[0037] (b)、將 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示 的氨基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有鋅 鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的蛋白變體。
[0038] 所述的"多個(gè)"通常意味著2-8個(gè)，優(yōu)選為2-4個(gè)，這取決于鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體三維 結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取 代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其 中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸殘基序列的改變，相對(duì)天然分子而 言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
[0039] 本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本 領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的氨基酸序列變體或片段，其 中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘 基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。因此，本發(fā)明所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體及其編碼基 因包括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對(duì)于多核苷酸，變 體包含天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和替換。對(duì) 于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變 體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括 合成來源的多核苷酸，例如，采用定點(diǎn)誘變所得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多 核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如DNA重排等）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以下分子 生物技術(shù)手段來篩選或評(píng)價(jià)變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性：DNA結(jié)合活性，蛋白 之間的相互作用，瞬時(shí)研究中基因表達(dá)的激活情況或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效應(yīng)等。
[0040] 從亞細(xì)胞定位結(jié)果可知，本發(fā)明分離的5個(gè)ZmZIPs基因（ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、 ZmZIP7或ZmZIP8基因）所編碼的蛋白定位在質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)膜上。為進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi)膜 的具體定位，本發(fā)明選用ERmarker與5個(gè)ZmZIPs基因共定位進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體的 轉(zhuǎn)化，結(jié)果證明這5個(gè)ZmZIPs基因均定位在細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在亞細(xì)胞定位的基礎(chǔ)上， 通過real-time RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，正常營養(yǎng)條件下，5個(gè)ZmZIPs基因主要在地上部表 達(dá)，其中，缺鋅條件下，ZmZIP8在96h地上部表達(dá)上調(diào)，ZmZIP3在6h時(shí)地上部和地下部表達(dá) 量都有所升高；在高鋅條件ZmZIP7和ZmZIP8在地上部的表達(dá)量是逐漸降低的，ZmZIP3在 地下部的表達(dá)量明顯的降低。這些結(jié)果表明，ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8在幼苗時(shí)期對(duì)鋅的 濃度比較敏感。缺鐵條件下，ZmZIP7和ZmZIP8在地上與地下的表達(dá)量是逐漸增高的，說明 ZmZIP7和ZmZIP8對(duì)鐵的濃度比較敏感。缺銅、缺錳條件下，5個(gè)ZmZIPs基因的表達(dá)量都沒 有明顯的變化。
[0041] 酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs不論在低鋅還是在低鐵條件下都 表現(xiàn)出不同程度的轉(zhuǎn)運(yùn)鋅或鐵活性，說明本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs均具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功 能。
[0042] 目前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，一些蛋白也 被應(yīng)用到植物的轉(zhuǎn)基因研究中，比如在大麥中過表達(dá)AtZIPl基因能夠增加鋅和鐵在種 子中的含量（Ramesh SA，Choimes S，Schachtman DP. Over-expression of an Arabidopsis zinc transporter in hordeum vulgare increases short-term zinc uptake after zinc deprivation and seed zinc content. Plant molecular biology2004, 54(3):373-385.), 同樣，過表達(dá)OsIRTl基因，水稻中鋅和鐵的含量在地上部、地下部和種子中都有所 提高(Lee SjAn G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant，cell&environment2009, 32 (4) :408-416.) 〇 然而，在 水稻中過表達(dá)0sZIP4、0sZIP5、0sZIP8, 0sZIP9結(jié)果導(dǎo)致過量的鋅聚集于根部，降低 了植株地上部分的鋒含量（Lee S，Kim SA，Lee J，et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice. Molecules and cells2010, 29 (6) : 551-558 ;Lee S，Jeong HJ，Kim SA，et al. 0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice. Plant molecular biology2010, 73 (4-5) :507-517 ；Ishimaru YjMasuda Hj Suzuki Mj et al.Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58 (11) :2909-2915.)沒有達(dá)到在籽粒中增加鋅含量的目的，因此，這些基因的 過表達(dá)對(duì)水稻籽粒中鋅的富集是不利的。這些結(jié)果表明，異位過表達(dá)對(duì)于鋅鐵的積累與分 布可能會(huì)起到一定的作用。然而，有關(guān)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在籽粒中的研究還很少。
[0043] 因此，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅鐵的能力的方法，包括：將 本發(fā)明ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過表達(dá)ZmZIPs基因，能夠有效調(diào)控或改善目標(biāo)植物對(duì) 鋅鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存的能力。
[0044] 本發(fā)明提供了一種解除過量的鋅鐵對(duì)植物體毒害的方法，該方法包括：將本發(fā)明 ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過表達(dá)ZmZIPs基因。
[0045] 本發(fā)明還提供了一種調(diào)控或促進(jìn)植物種子胚發(fā)育的方法，該方法包括：將本發(fā)明 ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過表達(dá)ZmZIPs基因；其中，所述的表達(dá)調(diào)控元件中啟動(dòng)子優(yōu) 選為種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0046] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種調(diào)控或促進(jìn)種子胚成熟的方法，該方法包括：將本發(fā)明 ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過表達(dá)ZmZIPs基因；其中，所述的表達(dá)調(diào)控元件中的啟動(dòng)子 優(yōu)選為種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0047] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因的重組植物表達(dá)載體 以及含有該重組植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0048] 將本發(fā)明所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得 到可以在植物中表達(dá)該鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的重組植物表達(dá)載體。"可操作的連接"指兩 個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。例如，該 重組植物表達(dá)載體可以由Y端非編碼區(qū)，SEQ ID No. 1 (或者是SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 9中的任一序列）所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述 的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟動(dòng)子可 以是組成性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子；所述的3'非編碼區(qū)可以包 含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如 章魚堿合成酶或胭脂堿合成酶終止區(qū)。例如，為了使本發(fā)明的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在糧食 作物種子進(jìn)行特異性表達(dá)，可以將鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因連接在種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的下 方構(gòu)建得到重組植物表達(dá)載體，將該重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物后，鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體 基因可以在受體植物的種子里進(jìn)行特異性表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)胚根和胚芽發(fā)育、促進(jìn)胚成熟或 增加種子鋅鐵含量或調(diào)控胚發(fā)育的效果。
[0049] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將ZmZIPs的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)其在植物中 的表達(dá)。例如?？刹捎媚繕?biāo)植物的偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強(qiáng)該基因在目 標(biāo)植物中的表達(dá)水平，這些方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所習(xí)知。
[0050] 此外，該重組植物表達(dá)載體還可含有用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇 性標(biāo)記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述的選擇性標(biāo)記基因包括：編碼抗生素抗性 的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標(biāo)記基因還包括表型標(biāo)記，例如 β-半乳糖苷酶和熒光蛋白等。
[0051] 所述的"轉(zhuǎn)化"指將基因?qū)氲街参锛?xì)胞內(nèi)部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳 轉(zhuǎn)化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知，包括但不限 于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法等。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指被引入的多核苷酸構(gòu)建體整合 至植物細(xì)胞的基因組中并能通過其子代遺傳；"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"指多核苷酸被引入到植物中但只 能在植物中暫時(shí)性表達(dá)或存在。
[0052] 轉(zhuǎn)化方案以及將所述多核苷酸引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物（單子葉植 物或雙子葉植物）或植物細(xì)胞的類型而變化。將所述多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包 括：顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移以及高速彈道轟擊等。在特定的 實(shí)施方案中，可利用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將本發(fā)明的ZmZIPs基因提供給植物。在其它實(shí)施方案 中，本發(fā)明的ZmZIPs基因可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來引入到植物中，通常，這 樣的方法涉及將本發(fā)明的ZmZIPs基因構(gòu)建體引入病毒DNA或RNA分子中。
[0053] 利用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株（McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84)。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于：單子葉植物或 雙子葉植物；優(yōu)選的，所述的目標(biāo)植物包括糧食作物、蔬菜或果樹等，更優(yōu)選為糧食作物，例 如，可以是玉米、水稻、大麥小麥、高粱、大豆、馬鈴薯等糧食作物。
[0054] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
[0055] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者 類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0056] 術(shù)語"重組宿主細(xì)胞株"或"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管 使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞還可為單子葉或雙子葉植物細(xì)胞。
[0057] 術(shù)語"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷 或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似 物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方 式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核 酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否 則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡并密碼子取代） 和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選（或所 有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代。
[0058] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮P， 針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨 基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如 本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白（即抗原），其中氨基 酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059] 圖1酵母表達(dá)載體pFL61的不意圖。
[0060] 圖2標(biāo)準(zhǔn)Hoagland培養(yǎng)基條件下ZmZIPs的表達(dá)模式；S (shoot)，R (root)。
[0061] 圖3 ZmZIPs基因在各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。
[0062] 圖4 ZmZIPs基因在玉米胚和胚乳發(fā)育過程中的表達(dá)模式。
[0063] 圖5 pRTL2NGFP-ZmZIPs重組載體酶切鑒定；M為IKb的Marker ; 1-5分別為 pRTL2NGFP-ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8 雙酶切的結(jié)果
[0064] 圖6 ZmZIPs洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位情況； ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8 為 pRTL2NGFP-ZmZIPl、2、3、7、8 的亞細(xì)胞定位情 況。
[0065] 圖7 ZmZIPs擬南芥葉肉原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位 情況；GFP 為 pRTL2NGFP 空載體定位情況；ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8 分別為 pRTL2NGFP-ZmZIPI、2、3、7、8 的亞細(xì)胞定位情況。
[0066] 圖 8 pFL61-ZmZIPs 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 正向連 接重組載體酶切鑒定；M為IKb的Marker ;l-8依次為pFL61-ZmZIPl、pFL61-ZmZIP2、 pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8、pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 雙酶切結(jié)果。
[0067] 圖9 ZmZIPs酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0068] 圖 10 ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7 和 ZmZIP8 的植物表達(dá)載體示意圖。
[0069] 圖11 ZmZIPs基因在擬南芥中過表達(dá)提高擬南芥中鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP2 為轉(zhuǎn)ZmZIP2基因在擬南芥中過表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP3為轉(zhuǎn) ZmZIP3基因在擬南芥中過表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP7為轉(zhuǎn)ZmZIP7 基因在擬南芥中過表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP8為轉(zhuǎn)ZmZIP8基因在 擬南芥中過表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；WT為野生型哥倫比亞種子中鐵和 鋅含量測(cè)定的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0070] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0071] 實(shí)驗(yàn)材料
[0072] I. 1植物材料
[0073] 玉米自交系X178由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家玉米改良中心河北分中心實(shí)驗(yàn)室 提供，水稻自交系日本晴由北京師范大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。
[0074] L 2菌株與載體
[0075] 大腸桿菌（E. coli)菌株 Machl-Tl 和農(nóng)桿菌（A. tumefacterium)菌株 EHA105、 GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-Teasy載體購自Promega公司。酵母表達(dá)載體pFL61(不 意圖見圖 1)、酵母菌株 zrtlzrt2ZHY3 (MAT a ade6canlhis31eu2trplura3zrtl: :LEU2zrt2: :HIS3), fet3fet4DEY1453 (MATa/MATa ade2/+ canl/canl his3/his3 Ieu2/leu2 trpl/trpl ura3/ura3fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-l::LEU2/fet4-l::LEU2), DY1455 (MATa ade6 canl his3 leu2 trpl ura3)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張紅生教授友情惠贈(zèng)。
[0076] 實(shí)施例1玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因的克隆
[0077] 1、植物材料的處理
[0078] 先把蛭石用Hoagland營養(yǎng)液浸透，將玉米自交系X178種子點(diǎn)播于育苗盤中，上面 覆蓋上一層干蛭石，在溫室（16h光照/8h黑暗，26°C )中培養(yǎng)，12天幼苗長至2葉一心時(shí)移 入標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營養(yǎng)液中生長6天至3葉一心（每3天換一次營養(yǎng)液），3葉一心的玉米 幼苗在標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液和不加鋅、鐵、銅、錳、高鋅、鐵的條件下處理〇、6、12、24、48、96h后，分別 收取幼苗地上部和根，液氮速凍后于_80°C保存用于總RNA提取。
[0079] 2、玉米總RNA的提取
[0080] 采用Trizol法提取玉米總RNA。
[0081] 3、cDNA 的合成
[0082] (1)去除 DNA，按下述配制反應(yīng)體系：總 RNA (1 μ g/ μ L) I. 0 μ L，DNAse I (10U/ yL)1.0yL，10XDNAseIbufTerl.0yL，DEPCH20 7.0 yL"g4fl0.0yL;37t：30min，WA I μ L25mM EDTA，65°C 5min 終止反應(yīng)。
[0083] (2)、加入 I μ L oligo(dT18)，65°C 5min ;
[0084] (3)、以上共12 μ L，再加入以下組分得到反轉(zhuǎn)錄體系：5X反應(yīng)緩沖液4.0 μ L，Ri RT (20U/ μ L) I. 0 μ L，Re RT (200U/ μ L) I. 0 μ L，IOmM dNTP mix 2· 0 μ L，總計(jì)：20. 0 μ L ;42°C 60min，70°C 5min，終止反應(yīng)。
[0085] 4、目的基因的克隆
[0086] (1)、根據(jù)目的基因的ORF框設(shè)計(jì)引物：
[0087] ZmZIPlF5'-GCGGCCGCATGCGCCGCCAAAGCCT-3,NotI
[0088] ZmZIPlR5'-GCGGCCGCTTATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'NotI
[0089] ZmZIP2F5'-TACGTAATGGCCCGCGCCAC-3'SnaBI
[0090] ZmZIP2R 5' -TACGTATCAGGTGTCCCATATCATGACG-3' SnaBI
[0091] ZmZIP3F 5'-CCCGGGATGGGAGCTGTGAAGCATACATTG-3'SmaI
[0092] ZmZIP3R 5'-GGTACCCTATGCCCATATAGCAAGCATGGAC-3'KpnI
[0093] ZmZIP7F 5' -TCTAGAATGGTTCTCGCCGGCCTC-3 , XbaI
[0094] ZmZIP7R 5'-GAGCTCTCAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'SacI
[0095] ZmZIP8F 5' -CCCGGGATGGCCATGAGGCCACG-3, SmaI
[0096] ZmZIP8R 5' -GAGCTCCTAGGCCCACTTGGCCAGC-3, SacI
[0097] 以上述步驟3的cDNA為模板，選用ExTaq酶，2 X GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程 序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個(gè)循環(huán)；72°C延 伸 IOmin ;
[0098] (2)、將克隆得到的片段克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化Machl-Tl菌株；
[0099] (3)、經(jīng)酶切鑒定獲得陽性的重組質(zhì)粒，測(cè)序得到正確克隆，所克隆的第1個(gè)基因 命名為ZmZIPl，該基因的cDNA序列為SEQ IDNo. 1所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ IDNo. 2 所示；所克隆的第2個(gè)基因命名為ZmZIP2,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 3所示，所推導(dǎo) 的氨基酸序列為SEQ ID No. 4所示；所克隆的第3個(gè)基因命名為ZmZIP3,該基因的cDNA序 列為SEQ ID No. 5所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No. 6所示；所克隆的第4個(gè)基因命名 為ZmZIP7,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 7所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No. 8所 示；所克隆的第5個(gè)基因命名為ZmZIP8,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 9所示，所推導(dǎo)的 氨基酸序列為SEQ ID No. 10所示。
[0100] 實(shí)施例2 ZmZIPs在幼苗、胚和胚乳中的表達(dá)模式
[0101] 將實(shí)施例1步驟3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體 系如下：
[0102] cDNA2.0yL，ExTaqO. lyL，2XGCI 緩沖液 10.0yL，10mM dNTP mix0.8yL，上游 引物 RTZmZIPlF/RTZmZIP2F/RTZmZIP3F/RTZmZIP7F/RTZmZIP8F(10 μ M/μ L)I. 0 μ L，下 游引物 RTZmZIPlR/RTZmZIP2R/RTZmZIP3R/RTZmZIP7R/RTZmZIP8R(10yM/yL)1.0yL， ddH205. 1 μ L，總計(jì) 20. 0μ L ;
[0103] RTZmZIPlF 5' -CCTCTCTGCGTTGGTTGCTCT-3'
[0104] RTZmZIPlR 5' -TTGATGGTTGTTTTCTGGTCGT-3'
[0105] RTZmZIP2F 5' -CCACAAATGGCACGAGGTCT-3'
[0106] RTZmZIP2R 5' -CGAAGACGGAGTGGAAGCAAA-3，
[0107] RTZmZIP3F 5' -GCCTCTTGTTGGTGCCCTTA-3'
[0108] RTZmZIP3R 5' -TCAACAATGAACGCTGTAGTGCT-3'
[0109] RTZmZIP7F 5' -ACTAGGTGGGTGCATTGCTCAG-3'
[0110] RTZmZIP7R 5' -TGCCAGCAGATACCGAGTCAA-3'
[0111] RTZmZIP8F 5' -CGTGTCATCGCTCAGGTTCTTG-3'
[0112] RTZmZIP8R 5' -CCCTCGAACATTTGGTGGAAG-3'
[0113] PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min ;30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性45秒，60°C退火 lmin，72°C延伸Imin ;最后再延伸72°C lOmin，降溫至16°C，取出PCR產(chǎn)物放入4°C保存。
[0114] 目的基因表達(dá)量的檢測(cè)：實(shí)施例1步驟3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋20倍作 為Real-time PCR反應(yīng)的模板，Actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系如下：cDNA 5. 0 μ L，SYBR Green IlO.OyL，RoxO. 4 μ L，上游引物 ZmActinlF (10 μ M/μ L) 0.4 μ L，下游引物 ZmActinlR(10yM/y L)0. 4μ L，ddH203. 8 μ L，總計(jì) 10. Ομ L ;
[0115] ZmActinlF 5' -ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'
[0116] ZmActinlR 5' -CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'
[0117] 所用程序：95°C 2min，95°C 15sec，60°C 34sec，40 個(gè)循環(huán)，通過 Δ Δ Ct 法計(jì)算表 達(dá)量。
[0118] 通過real-time RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，正常營養(yǎng)條件下，5個(gè)ZmZIPs基因主要在 地上部表達(dá)，其中，缺鋅條件下，ZmZIP8在96h地上部表達(dá)上調(diào)，ZmZIP3在6h時(shí)地上部和 地下部表達(dá)量都有所升高；在高鋅條件ZmZIP7和ZmZIP8在地上部的表達(dá)量是逐漸降低的， ZmZIP3在地下部的表達(dá)量明顯的降低。這些結(jié)果表明，ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8在幼苗時(shí) 期對(duì)鋅的濃度比較敏感。缺鐵條件下，ZmZIP7和ZmZIP8在地上與地下的表達(dá)量是逐漸增高 的，說明ZmZIP7和ZmZIP8對(duì)鐵的濃度比較敏感。缺銅、缺錳條件下，5個(gè)ZmZIPs基因的表 達(dá)量都沒有明顯的變化。5個(gè)ZmZIPs基因可能參與胚和胚乳的發(fā)育（圖2、圖3和圖4)。
[0119] 實(shí)施例3 ZmZIPs的生物信息學(xué)分析
[0120] ZmZIPs由367-483個(gè)氨基酸組成，含有6-9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在第3與第4跨膜區(qū)之 間有一富含組氨酸的可變區(qū)，可能和金屬離子的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。進(jìn)化樹分析顯示，ZmZIPl與 AtIARUOsIARl進(jìn)化關(guān)系較近。另外，ZmZIP3和ZmZIP4與0sZIP3和0sZIP4形成一個(gè)基因 簇，ZmZIP2與0sZIP2鄰近，和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體OsZIPl，AtZIP2和AtZIPll在一個(gè)分支上，ZmZIP5 與ZmZIP7在一個(gè)分支上，ZmZIP8與0sZIP8, ZmZIP6與0sZIP6進(jìn)化關(guān)系較近，這些結(jié)果顯 示，本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs可能是鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[0121] 實(shí)施例4 ZmZIPs的亞細(xì)胞定位
[0122] 1、融合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0123] 根據(jù)ZmZIPs基因的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0124] ZmZIPlGF 5' -GAATTCATGCGCCGCCAAAGCCT-3' EcoRI
[0125] ZmZIPlGR 5' -TCTAGATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3' XbaI
[0126] ZmZIP2GF 5' -GAATTCATGGCCCGCGCCACCAA-3, EcoRI
[0127] ZmZIP2GR 5' -TCTAGAGGTGTCCCATATCATGACGACGG-3' XbaI
[0128] ZmZIP3GF 5' -GAATTCATGGGAGCTGTGAAGCATAC-3' EcoRI
[0129] ZmZIP3GR 5' -TCTAGATGCCCATATAGCAAGCATGGACAT-3' XbaI
[0130] ZmZIP7GF 5' -GAATTCATGGTTCTCGCCGGCCTC-3' EcoRI
[0131] ZmZIP7GR 5' -TCTAGAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3' XbaI
[0132] ZmZIP8GF 5' -GAATTCATGGCCATGAGGCCACGC-3' EcoRI
[0133] ZmZIP8GR 5' -TCTAGAGGCCCACTTGGCCAGCAT-3, XbaI
[0134] 加入合適的酶切位點(diǎn)，并且基因3'端去除終止密碼子，以克隆基因時(shí)連接到 pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq酶與2 X GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。擴(kuò)增片段經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌菌株Machl-Tl，經(jīng)LB培養(yǎng)基（IPTG、X-gal、Amp)得到陽性克隆，提質(zhì)粒、酶切和測(cè)序驗(yàn) 證；以克隆基因時(shí)連接到pGEM-Τ載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq酶與2XGCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，測(cè)序 正確的質(zhì)粒酶切后，將目的片段構(gòu)建到PRTL2NGFP載體上，分別命名為pRTL2NGFP-ZmZIPl、 pRTL2NGFP-ZmZIP2、pRTL2NGFP-ZmZIP3、pRTL2NGFP-ZmZIP7、pRTL2NGFP-ZmZIP8,圖 5 為酶 切鑒定圖。
[0135] 2、用相應(yīng)的酶切pRTL2NGFP載體與不同的酶切后的基因片段，經(jīng)T4DNA連接酶連 接，轉(zhuǎn)化Machl-Tl菌株，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質(zhì)粒用于基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥 表皮。
[0136] 3、基因槍微彈的制備
[0137] 4、用基因槍進(jìn)行洋蔥表皮轉(zhuǎn)化
[0138] 從定位結(jié)果可知5個(gè)211121?8(211121?1、211121?2、211121?3、211121?7或211121?8)均定位 在質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)膜上（圖6)。為進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi)膜的具體定位，選用ER marker與ZmZIPs 共定位進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，結(jié)果證明5個(gè)ZmZIPs均定位在細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 上（圖7)。
[0139] 實(shí)施例五酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
[0140] 1、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
[0141] 根據(jù)目的基因序列加入合適的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：
[0142] ZmZIPlYF 5' -GCGGCCGCATGCGCCGCCAAAGCCT-3, NotI
[0143] ZmZIPlYR 5'-GCGGCCGCTTATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'NotI
[0144] ZmZIP2YF 5' -TACGTAATGGCCCGCGCCAC-3' SnaBI
[0145] ZmZIP2YR 5' -TACGTATCAGGTGTCCCATATCATGACG-3' SnaBI
[0146] ZmZIP3YF 5' -CCCGGGATGGGAGCTGTGAAGCATACATTG-3' SmaI
[0147] ZmZIP3YR 5' -GGTACCCTATGCCCATATAGCAAGCATGGAC-3' KpnI
[0148] ZmZIP7YF 5' -TACGTAATGGTTCTCGCCGGCCTC-3' SnaBI
[0149] ZmZIP7YR 5'-TACGTATCAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'SnaBI
[0150] ZmZIP8YF 5' -TGCCATGGCCATGAGGCCAC-3'
[0151] ZmZIP8YR 5' -CTAGGCCCACTTGGCCAGCATG-3'
[0152] 0sZIP5YF 5' -CCCGGGGAGCCATCGGCGATGGCGA-3, SmaI
[0153] 0sZIP5YR 5, -GAGCTCGTGATGGTCACTCACTCATCACGCC-3, SacI
[0154] 0sZIP8YF 5' -GCGGCCGCATGAGGACGAACACCACC-3, NotI
[0155] 0sZIP8YR 5' -GCGGCCGCCCTCTACATTAGTCCCTGAG-3' NotI
[0156] OsIRTlYF 5'-GCGGCCGCCCCGGGATGGCGACGCCGCGGA-3,NotI，SmaI
[0157] OsIRTlYR 5'-GCGGCCGCCCCGGGTCACGCCCACTTGGCCATG-3,NotI，SmaI
[0158] 以克隆基因時(shí)連接到pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq與2 X GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin， 72°〇延伸111^11，33個(gè)循環(huán)；721：延伸1〇1^11。擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆 到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Machl-Tl，經(jīng)LB培養(yǎng)基（IPTG、X-gal、Amp)得到陽 性克隆，提質(zhì)粒、酶切和測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的質(zhì)粒酶切后，將目的片段構(gòu)建到PFL61載體 上,命名為 pFL61-ZmZIPl、pFL61-ZmZIP2、pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8 和 pFL61-〇sIRTl，圖 8 為酶切鑒定圖。
[0159] 用NotI酶切pFL61載體與酶切后的ZmZIPs片段經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化 Machl-Tl菌株，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
[0160] 2、電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母
[0161] (1)、從 YPD 平板上挑取 zrtlzrt2ZHY3、fet3fet4DEY1453 和 DY1455 的單菌落于 20mL的YH)液體培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)約24h ;
[0162] (2)、吸取以上2%體積的菌液轉(zhuǎn)接到IOOmL的YH)培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)繁約4_5h，待 菌液OD 6c?為1. 2-1. 5時(shí)即可制備感受態(tài)；
[0163] (3)、將菌液收集到50mL的離心管中，4°C，5, OOOrpm，離心5min，倒掉上清；
[0164] (4)、加入等體積的去離子水，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0165] (5)、加入1/2體積的去離子水，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0166] (6)、加入IOmL的IM山梨醇溶液，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0167] (7)、加入450-600μ?的山梨醇溶液，用去頭的槍頭輕吸，重懸菌體；
[0168] (8)、按照每個(gè)I. 5mL的離心管里加入約100 μ L的感受態(tài)為準(zhǔn)，分裝；
[0169] (9)、在每管感受態(tài)中加入適量的DNA(10y L左右，c彡200ng/yL)，冰上放置 l-2min,之后吸到預(yù)冷的電擊杯中，不要有氣泡；
[0170] (10)、電擊轉(zhuǎn)化，立即加入約800 μ L，IM的預(yù)冷的山梨醇溶液，重懸菌體；
[0171] (11)、從電擊杯中吸出菌體，涂布SD/Ura-平板；
[0172] (12)、SD平板上28 °C培養(yǎng)約6天可長出肉眼可見的菌斑。
[0173] 3、酵母陽性克隆的鑒定
[0174] (1)、取1.5mL酵母培養(yǎng)物，9, OOOrpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集酵母細(xì) 胞；
[0175] (2)、加入600 μ L Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞，加入80U的 Lyticase,充分顛倒混勻，37°C溫育30min消化細(xì)胞壁，中間顛倒數(shù)次；
[0176] (3)、13, OOOrpm離心Imin,盡可能吸棄上清，加入250 μ L溶液YPl重懸菌體沉淀， 渦旋震蕩至徹底懸??；
[0177] (4)、加入250 μ L ΥΡ2溶液，輕柔地翻轉(zhuǎn)，使菌體充分裂解，室溫放置4min ;
[0178] (5)、加入350 μ L YP3溶液，輕柔地翻轉(zhuǎn)，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰上靜 置3_5min，13, OOOrpm離心5min，小心吸取上清液。
[0179] (6)、將上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12, OOOrpm 離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液；
[0180] (7)、加入500 μ L去蛋白液PD，12, OOOrpm離心30-60秒，棄廢液；
[0181] (8)、加入500 μ L漂洗液WB (已加無水乙醇），12, OOOrpm離心30-60秒,棄廢液；
[0182] (9)、加入 500 μ L 漂洗液 WB，12, OOOrpm 離心 30-60 秒，棄廢液；
[0183] (10)、將吸附柱AC放回空收集管中，13, OOOrpm離心2min，除去漂洗液；
[0184] (11)、取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μ L洗 脫緩沖液EB (65-70°C水?。覝胤胖?min，13, OOOrpm離心lmin。
[0185] (12)、以抽提的1 μ L DNA為模板，基因的兩端引物為PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增 驗(yàn)證目的基因，驗(yàn)證正確的菌液，加入25%的甘油于-80°C保存。
[0186] 4、酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0187] 將 pFL61、pFL6卜ZmZIPl、pFL6卜ZmZIP2、pFL6卜ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、 pFL61-ZmZIP8、pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到酵母突變 株 zrtlzrt2ZHY3 和 fet3fet4DEY1453 中，pFL61 為陰性對(duì)照，0sZIP5、0sZIP8(Lee S，Kim SAj Lee Jj et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice. Molecules and cells2010, 29 (6) : 551-558 ；Lee Sj Jeong HJj Kim SAj et al.0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice. Plant molecular biology2010, 73(4-5) :507-517 ；Ishimaru YjMasuda Hj Suzuki Mj et al. Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58(11) :2909-2915.)為鋒轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽性 對(duì)照，OsIRTl (Lee S，An G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant，cell&environment2009, 32 (4) :408-416.)為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽 性對(duì)照，PFL61轉(zhuǎn)化野生型菌株DY1455作為另一陽性對(duì)照，轉(zhuǎn)化后鑒定為陽性的酵母菌在 SD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，酵母菌液分別稀釋4個(gè)濃度（0D6。。= 1、0. 1、0.01、0.001)，然后取 5 μ L點(diǎn)在低鋅、彳氐鐵和正常SD的培養(yǎng)基中，低鋅培養(yǎng)基（SD培養(yǎng)基加入0. 4mM EDTA、0. 4mM EDTA 和 250 μ M ZnS04、0. 4mM EDTA 和 300 μ M ZnSO4)，彳氐鐵培養(yǎng)基（SD 培養(yǎng)基加入 50mM MES、 50mM MES 和 50 μ M FeCl3、50mM MES 和 100 μ M FeCl3)酵母互補(bǔ)參照 Lin，Y. F 的試驗(yàn)（Lin YF，Liang HM, Yang SY，et al. Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytologist2009, 182(2) :392-404.)方法進(jìn) 行，28 °C培養(yǎng)，6天觀察試驗(yàn)結(jié)果。
[0188] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低鋅條件下，加有250μΜ ZnSO4的培養(yǎng)基中能明顯觀察到 DY-pFL61(野生型）、Z-ZmZIPl、Z-ZmZIP2、Z-ZmZIP3、Z-ZmZIP7、Z-ZmZIP8、Z-〇sZIP5、 Z-〇sZIP8、Z-OsIRTl 比空載體 Z-pFL61 長勢(shì)好，并且，Z-ZmZIPl、Z-ZmZIP2、Z-ZmZIP3、 Z-ZmZIP7、Z-ZmZIP8與已經(jīng)報(bào)道的水稻OsZIP長勢(shì)相當(dāng)。在低鐵條件下，D-ZmZIPU D-ZmZIP2、D-ZmZIP3、D-ZmZIP7、D-ZmZIP8比空載體D-pFL61長勢(shì)好，但是沒有已經(jīng)報(bào)道的 D-OsIRTl 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性強(qiáng)（圖 9) ;ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7 或 ZmZIP8 不論在低鋅還 是在低鐵條件下都表現(xiàn)出不同程度的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，說明ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或 ZmZIP8具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功能。
[0189] 實(shí)驗(yàn)例I ZmZIPs基因在擬南介中過表達(dá)提商擬南介種子中鐵和鋒含量的實(shí)驗(yàn)
[0190] 將ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7以及ZmZIP8基因分別與組成型35S啟動(dòng)子控 制的植物表達(dá)載體PBI121相連接構(gòu)建得到ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8基 因重組植物表達(dá)載體（圖10);將構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到擬南芥中，鑒定獲得 陽性的轉(zhuǎn)ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8基因擬南芥；將陽性的轉(zhuǎn)ZmZIPs基因 擬南芥與野生型哥倫比亞在相同的載培條件下培養(yǎng)，收獲轉(zhuǎn)ZmZIPs基因擬南芥種子和野 生型種子，分別測(cè)定轉(zhuǎn)ZmZIPs基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子中鐵或鋅的含量；稱取 一定量的種子材料經(jīng)微波消解，定容，用ICP-MS方法進(jìn)行鋅鐵含量的測(cè)定；每批測(cè)定200mg 種子，測(cè)定三批，取三批數(shù)據(jù)的平均值。測(cè)定結(jié)果見圖11。從圖11的結(jié)果可見，在擬南芥中 過表達(dá)ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8基因均能夠不同程度的提高種子中鐵或 鋅含量。
【權(quán)利要求】
1. 從玉米（Zeamays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因，其特征在于，其cDNA序 列選自（a)、（b)或（c): (a) 、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 9 所示的核苷酸 序列； (b) 、編碼 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示氨 基酸的核苷酸序列； (c) 、與 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 9 所示核苷酸 的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào) 控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。
2. 權(quán)利要求1所述ZmZIPs基因編碼的蛋白質(zhì)。
3. 按照權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為（a)或（b) 所示： (a) 、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示的氨基 酸序列； (b) 、將 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示的氨 基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有鋅鐵調(diào) 控轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的蛋白變體。
4. 含有權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因的重組表達(dá)載體；優(yōu)選的，所述的 重組表達(dá)載體是重組植物表達(dá)載體。
5. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因在調(diào)控或改善植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅 或鐵能力中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因在促進(jìn)或調(diào)控種子胚乳發(fā)育中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因在促進(jìn)或調(diào)控植物種子胚成熟中的應(yīng) 用。
8. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因在增加糧食作物種子鋅或鐵含量中的 應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因在解除過量的鋅或鐵對(duì)植物體毒害中 的應(yīng)用。
10. 按照權(quán)利要求5-9任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：將權(quán)利要求1所述鋅 鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得到重組植物表達(dá)載體；將重 組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物或植物細(xì)胞，培育得到轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104212816SQ201410240908
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月31日
【發(fā)明者】李素貞, 陳景堂, 李宏博, 趙永鋒, 郭晉杰 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)