花鱸精液的處理方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種花鱸精液的處理方法，該方法包括以下步驟：（1）將花鱸精液與抗凍液按體積比1：3比例稀釋混勻；（2）預(yù)冷處理，將稀釋后的混合液在4℃預(yù)冷3分鐘；（3）預(yù)冷后以分段方式降溫處理；（4）分裝保存。本發(fā)明提供的花鱸精液的處理方法，解決了雄性花鱸親魚產(chǎn)精時(shí)間短、產(chǎn)精量少的困難，解決了花鱸雌雄個(gè)體性成熟不同步的問題，解決了花鱸精子無法長(zhǎng)距離、長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸?shù)睦щy；保存的花鱸精子，可以隨時(shí)隨地為異源雌核誘導(dǎo)育種提供材料，有利于花鱸的可持續(xù)養(yǎng)殖，有利于花鱸遺傳多樣性的保護(hù)，有利于花鱸品系的選育；在花鱸的繁殖、遺傳育種以及種質(zhì)資源保存中具有重要的意義。
【專利說明】花鱸精液的處理方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及魚類遺傳【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種花鱸精液的處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花鱸屬鱸形目，鯧科，花鱸屬。俗稱:鱸魚、海鱸，又稱日本真鱸。其個(gè)體大，肉質(zhì)佳美，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快、食性廣，蛋白質(zhì)、韓、磷、鐵、維生素、煙酸、微量維生素BI等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，是我國名貴的海水肉食性養(yǎng)殖魚類，廣泛分布于渤海、黃海、東海，日本及朝鮮半島海域，為太平洋西北沿海特有物種。自20世紀(jì)90年代以來，經(jīng)過近20多年的發(fā)展，我國花鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到9萬多噸，位列海水養(yǎng)殖魚類之首。但是花鱸養(yǎng)殖業(yè)也面臨著空前的挑戰(zhàn),主要問題有:種質(zhì)退化、病害增多、養(yǎng)殖成本上升等?；|種質(zhì)質(zhì)量最好的野生花鱸種群數(shù)量銳減，親魚繁殖性能不斷退化，花鱸遺傳育種與繁殖等基礎(chǔ)研究薄弱，關(guān)鍵技術(shù)未得到應(yīng)有的重視，嚴(yán)重影響了花鱸養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。
[0003]現(xiàn)階段花 鱸的自然繁育由于雌雄個(gè)體產(chǎn)生配子時(shí)間短，雌雄親魚性成熟不同步，可能導(dǎo)致無法受精；人工繁育所需要的精液采用人工腹部擠壓法取得，花鱸精液在離開精巢后，由于沒有采取任何處理措施，使得花鱸精液的活力下降快，不能長(zhǎng)時(shí)間保存，無法進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸，受時(shí)間和空間地域的限制，精子質(zhì)量會(huì)隨著累代積累下降，優(yōu)良基因會(huì)因雜交而喪失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種花鱸精液的處理方法。
[0005]一種花鱸精液的處理方法，包括以下步驟:
[0006]( I)將花鱸精液與抗凍液按體積比1:3比例稀釋混勻；
[0007]( 2 )預(yù)冷處理，將稀釋后的混合液在4°C預(yù)冷3分鐘；
[0008](3)預(yù)冷后以分段方式降溫處理；
[0009](4)分裝保存；
[0010]其中，步驟I中所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑和添加劑組成；其中，稀釋液為NaCl溶液:8.775g/L;抗凍保護(hù)劑的濃度為20%;添加劑為牛血清白蛋白:10g/L，葡萄糖:10g/L, 土霉素:lg/L ；
[0011]步驟3中，所述分段方式降溫處理包括:首先將預(yù)冷處理后的混合液在液氮罐液面以上IOcm停留5分鐘，然后在液氮罐液面以上4cm停留5分鐘，最后在液氮罐液面以上Icm停留3分鐘后直接陷入液氮中長(zhǎng)期保存。
[0012]進(jìn)一步地，如上所述的花鱸精液的處理方法，在步驟4之后，還包括解凍步驟5，即將經(jīng)液氮處理分裝保存的花鱸凍精直接放入37°C水浴解凍50-60秒，期間不斷搖動(dòng)花鱸凍精，然后置于室溫至完全融化，而后于自然海水中激活。
[0013]進(jìn)一步地，如上所述的花鱸精液的處理方法，所述激活包括將解凍后的凍精置入經(jīng)煮沸消毒并加有5%牛血清白蛋白的自然海水中進(jìn)行激活。
[0014]進(jìn)一步地,如上所述所述的花自盧精液的處理方法,在步驟I之前，還包括花S盧精液的獲取，包括以下步驟:
[0015](I)選取3-4齡，體重3_4kg的雄性花鱸親魚進(jìn)行麻醉；
[0016](2)按1000U/kg的量肌肉注射HCG ；
[0017](3)三天后采用腹部擠壓法獲得精液，取活力95%以上的花鱸精液。
[0018]進(jìn)一步地，如上所述所述的花鱸精液的處理方法，所述抗凍保護(hù)劑為二甲亞砜。
[0019]進(jìn)一步地，如上所述所述的花鱸精液的處理方法，步驟I中將花鱸精液與抗凍液按體積比1:3比例稀釋混勻后，封裝于凍存管中，所述凍存管為2ml的凍存管。 [0020]進(jìn)一步地，如上所述所述的花鱸精液的處理方法，所述分段方式降溫處理包括采用程序降溫儀程序降溫。
[0021]本發(fā)明提供的花鱸精液的處理方法，通過在花鱸繁殖期將其精液冷凍保存起來，隨時(shí)隨地解凍復(fù)溫獲得活力較高的精液，解決了雄性花鱸親魚產(chǎn)精時(shí)間短、產(chǎn)精量少的困難，解決了花鱸雌雄個(gè)體性成熟不同步的問題，解決了花鱸精子無法長(zhǎng)距離、長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸?shù)睦щy；保存的花鱸精子，可以隨時(shí)隨地為異源雌核誘導(dǎo)育種提供材料，有利于花鱸的可持續(xù)養(yǎng)殖，有利于花鱸遺傳多樣性的保護(hù)，有利于花鱸品系的選育；在花鱸的繁殖、遺傳育種以及種質(zhì)資源保存中具有重要的 意義。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023]實(shí)施例:
[0024]本發(fā)明提供的花鱸精液的處理方法，包括以下步驟:
[0025](I)采集處于繁殖期的3-4齡，體重3_4kg、性腺發(fā)育良好的花鱸雄魚，將雄魚從養(yǎng)殖池中撈出后麻醉，按1000U/kg肌肉注射HCG，三天后用蒸餾水沖洗生殖孔、擦凈，輕輕擠壓腹部獲得新鮮精液，而后將活力高于95%的精液與抗凍液按體積比1:3比例稀釋混勻后加入到2ml的凍存管中；所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑和添加劑組成；其中，稀釋液為NaCl溶液:8.775g/L ;抗凍保護(hù)劑(二甲基亞砜)為20% (抗凍保護(hù)劑的濃度，V/V) DMSO (二甲基亞諷)；添加劑為，牛血清白蛋白:10g/L,匍萄糖:10g/L, 土霉素:lg/L。
[0026](2)將凍存管置于4°C冰箱中預(yù)冷3分鐘，而后放入小型金屬罐中以分段降溫方式處理，即首先在液氮罐液面以上IOcm停留5分鐘，然后在液氮罐液面以上4cm停留5分鐘，最后在液氮罐液面以上Icm停留3分鐘后直接投入到液氮(_196°C)，分裝保存；
[0027](3)將經(jīng)液氮處理分裝保存的花鱸凍精進(jìn)行解凍，將其直接放入37°C水浴解凍50-60秒，期間不斷搖動(dòng)凍存管，然后置于室溫至完全融化；
[0028](4)，將解凍后的凍精進(jìn)行激活，所述激活方式為:先在載玻片上滴一滴經(jīng)煮沸消毒并加有5%BSA自然海水，然后用移液槍加入1-2 μ L凍精，吸打3-5次使其充分混勻。
[0029]本實(shí)施例將激活后的凍精在載玻片上隨即取3個(gè)視野，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)計(jì)算統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)率，經(jīng)檢測(cè)解凍后精子運(yùn)動(dòng)率為90.87±2.25%，與鮮精差異不顯著(P< 0.05)。
[0030]本發(fā)明的有益效果:
[0031]1.本發(fā)明采用20% (V/V) 二甲亞砜為抗凍保護(hù)劑，保持較好滲透性的同時(shí)又降低了毒性；
[0032]2.本發(fā)明抗凍液中加入了牛血清白蛋白，對(duì)精子的質(zhì)膜起到很好的保護(hù)作用；
[0033]3.本發(fā)明抗凍液中加入了適量的葡萄糖，其非滲透性保護(hù)作用提高了花鱸精子的抗凍能力；
[0034]4.本發(fā)明降溫前鮮精與抗凍液混勻，4°C冰箱中預(yù)冷3分鐘后直接放入液氮罐中直接進(jìn)行分段降溫，節(jié)省了時(shí)間，操作簡(jiǎn)便易行；
[0035]5.本發(fā)明分段降溫時(shí)，采用以液氮面以上IOcm預(yù)冷，使冷凍精子安全度過“危險(xiǎn)溫度區(qū)”，然后液氮面以上4cm的降溫速率快速進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，最后液氮面以上停留較短時(shí)間后直接浸入液氮中，整個(gè)降溫過程時(shí)間短，實(shí)用性強(qiáng)；
[0036]6.本發(fā)明冷凍 精子從液氮中取出后，采用二步解凍法，37°C和20°C兩步解凍，可使精子快速度過重結(jié)晶區(qū)，同時(shí)又避免了局部溫度過高導(dǎo)致的損傷；
[0037]7.本發(fā)明降溫設(shè)備僅需一個(gè)液氮罐，設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，凍精解凍后復(fù)蘇率高，激活后運(yùn)動(dòng)率高于90%，與鮮精活性基本相同。
[0038]8.本發(fā)明在抗凍液中加入了 lg/L的土霉素，對(duì)抗凍液中的有害微生物起到明顯的抑制作用；
[0039]9.本發(fā)明降溫前花鱸精液與抗凍液混勻，4°C平衡3分鐘，既能保證抗凍保護(hù)劑充分滲入到花鱸精子內(nèi)部，又不會(huì)因抗凍保護(hù)劑本身的毒性作用對(duì)胚胎造成過大的損害；
[0040]10.本發(fā)明采用添加5%BSA的消毒海水激活花鱸精液，有效的防止解凍后花鱸精子鞭毛相互黏連。
[0041]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種花鱸精液的處理方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將花鱸精液與抗凍液按體積比1:3比例稀釋混勻； (2)預(yù)冷處理，將稀釋后的混合液在4°C預(yù)冷3分鐘； (3)預(yù)冷后以分段方式降溫處理； (4)分裝保存； 其中，步驟I中所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑和添加劑組成；其中，稀釋液為NaCl溶液:8.775g/L ;抗凍保護(hù)劑的濃度為20% ;添加劑為牛血清白蛋白:10g/L，葡萄糖:10g/L，土霉素:lg/L ； 步驟3中，所述分段方式降溫處理包括:首先將預(yù)冷處理后的混合液在液氮罐液面以上IOcm停留5分鐘，然后在液氮罐液面以上4cm停留5分鐘，最后在液氮罐液面以上Icm停留3分鐘后直接陷入液氮中長(zhǎng)期保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花鱸精液的處理方法，其特征在于:在步驟4之后，還包括解凍步驟5，即將經(jīng)液氮處理分裝保存的花鱸凍精直接放入37°C水浴解凍50-60秒，期間不斷搖動(dòng)花鱸凍精，然后置于室溫至完全融化，而后于自然海水中激活。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花鱸精液的處理方法，其特征在于:所述激活包括將解凍后的凍精置入經(jīng)煮沸消毒并加有5%牛血清白蛋白的自然海水中進(jìn)行激活。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的花鱸精液的處理方法，其特征在于:在步驟I之前，還包括花鱸精液的獲取，包括以下步驟: (1)選取3-4齡，體重3-4kg的雄性花鱸親魚進(jìn)行麻醉； (2)按1000U/kg的量肌肉注射HCG； (3)三天后采用腹部擠壓法獲得精液，取活力95%以上的花鱸精液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的花鱸精液的處理方法，其特征在于:所述抗凍保護(hù)劑為二甲亞砜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的花鱸精液的處理方法，其特征在于:步驟I中將花鱸精液與抗凍液按體積比1:3比例稀釋混勻后，封裝于凍存管中，所述凍存管為2ml的凍存管。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的花鱸精液的處理方法，其特征在于:所述分段方式降溫處理包括采用程序降溫儀程序降溫。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103891711SQ201410115175
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】溫海深, 張美昭, 柴森浩, 韓龍江 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)