斜帶石斑魚抗菌肽leap-2基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用。石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者是SEQIDNO.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。本發(fā)明還首次獲得了石斑魚抗菌肽LEAP-2的基因序列以及經(jīng)密碼改造后的LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2的核苷酸序列，不僅豐富了石斑魚的基因庫，而且可應用于制備重組蛋白、抗菌制劑、魚類免疫制劑或飼料添加劑，為石斑魚的生理免疫研究提供了新的理論與實踐基礎。
【專利說明】斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種抗菌肽LEAP-2前體蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應用；還涉及一種LEAP-2成熟肽蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應用。
【背景技術】
[0002]抗菌肽是生物體內產(chǎn)生的一種具有生物活性的天然小分子多肽，在多種生物體中廣泛存在，是生物體免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分。自從Steiner于1981年首次在昆蟲體內發(fā)現(xiàn)抗菌肽的存在以后，到目前為止人們已經(jīng)在多個物種中發(fā)現(xiàn)了上千種抗菌肽。同時，人們也發(fā)現(xiàn)了抗菌肽可以作用于G+和G一細菌、真菌、寄生蟲甚至病毒，并且不會對正常細胞產(chǎn)生危害以及產(chǎn)生耐藥性。
[0003]LEAP-2 全稱為肝臟表達的抗菌妝-2 (liver-expressed antimicrobialpeptides-2),屬于抗菌肽的一種。它是2003年Krause等在人類血液中首次發(fā)現(xiàn)的。LEAP-2最初在肝臟中以前體的形式合成，之后被轉運到血液中。在此過程中，LEAP-2被修飾和加工形成成熟肽，主要涉及信號肽的切除和二硫鍵的形成。LEAP-2前體蛋白一般包括100個氨基酸左右，成熟肽一般包括約40個氨基酸。LEAP-2的蛋白結構與其它抗菌肽蛋白結構存在很大不同，其最主要的特點是多肽序列中包含四個半胱氨酸，并且這四個半胱氨酸可以以1-3、2-4的形式形成兩個二硫鍵。再通過氫鍵的作用，LEAP-2成熟肽最終可以形成β折疊等高級結構。另外，研究發(fā)現(xiàn)LEAP-2具有與一般抗菌肽相同的廣譜抑菌能力。
[0004]石斑魚類隸屬S盧形目iPerciformes),鯧科{Serranidae),石斑魚亞科(Bpinephelinae),石斑魚屬(Bpinephelus),為暖水性礁棲魚類,廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域。石`斑魚是馳名世界的名貴海產(chǎn)魚類之一，其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，為餐桌中的上等佳肴，被港澳地區(qū)推為我國的四大名魚之一，深受各地消費者的喜愛，經(jīng)濟價值巨大。但是，當前氣候災害和環(huán)境污染導致的高致病率和高死亡率，一直是石斑魚人工養(yǎng)殖過程中難以解決的問題。市場上還沒有一種能夠有效增強石斑魚免疫力或不產(chǎn)生耐藥性的飼料添加劑。
[0005]酵母是最簡單的真核生物，以其作為宿主表達外源蛋白有很大的優(yōu)勢:生長繁殖快，易培養(yǎng)，操作簡單；能對表達的外源蛋白進行翻譯后加工修飾，如糖基化、乙?；龋话踩愿?，無致病性。巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為代謝的唯一碳源和能源。畢赤酵母表達系統(tǒng)有很多優(yōu)點在科研及生產(chǎn)中廣泛應用:使用強的可誘導啟動子-AOXl基因啟動子；外源基因以單拷貝或多拷貝定點整合入基因組中，遺傳穩(wěn)定性好；重組蛋白以高水平分泌到幾乎無蛋白的培養(yǎng)基中，利用表達蛋白的純化；容易進行高密度發(fā)酵，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的一個目的在于提供一種石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白的基因。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的野生型基因以及經(jīng)密碼子偏好性改造后的基因mLEAP-2。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供含有石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白基因或LEAP-2成熟妝蛋白基因的克隆載體或表達載體。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供一種石斑魚抗菌肽LEAP-2重組前體蛋白及其制備方法。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供石斑魚LEAP-2前體蛋白和/或LEAP-2成熟肽蛋白的應用。
[0013]本發(fā)明所采取的技術方案是:
石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或者是SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
[0014]編碼石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白的基因，其含有SEQ ID N0.1第262-561 bp所示的核苷酸序列。
[0015]石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是SEQID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
[0016]編碼石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的基因，其為SEQ ID N0.1第421-561 bp所示的核苷酸序列，或者是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0017]攜帶有石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白基因或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白基因的載體。
[0018]含有石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白基因或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白基因的重組菌株。
[0019]生產(chǎn)石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白或石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的方法，包括將攜帶有抗菌肽LEAP-2前體蛋白基因或抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白基因的表達載體導入宿主細胞中，表達得到LEAP-2前體蛋白或LEAP-2成熟肽蛋白。
[0020]石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白在制備抗菌制劑中的應用。
[0021]石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白或/和抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白在制備提高水產(chǎn)動物免疫力制劑中的應用。
[0022]本發(fā)明的有益效果如下:
1.本發(fā)明首次獲得了石斑魚的抗菌肽LEAP-2基因序列以及LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2核苷酸序列，不僅豐富了石斑魚的基因庫，而且可應用于制備重組蛋白、魚類免疫制劑或飼料添加劑， 為石斑魚的生理免疫研究提供了新的理論與實踐基礎；
2.將石斑魚抗菌肽LEAP-2基因核苷酸序列和mLEAP-2基因序列在畢赤酵母重組株表達，可以大量生產(chǎn)石斑魚LEAP-2重組蛋白和mLEAP-2抗菌肽段，大大降低了生產(chǎn)成本，具有很高的經(jīng)濟價值；
3.本發(fā)明所提供的石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白和mLEAP-2抗菌肽，經(jīng)抑菌實驗證明具有較強的抑菌能力，可以用于制備抗菌制劑替代傳統(tǒng)抗生素或者應用于制備魚類尤其是石斑魚免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應用前景。
[0023]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因中間片段合成產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖； 圖2是斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因5’端片段合成產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖； 圖3是斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因3’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析圖； 圖4是LEAP-2基因全長鑒定的PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖；
圖5是經(jīng)密碼子偏好性改造后的斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2第二輪PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖；
圖6是克隆載體pMD18-T-mLEAP-2雙酶切、孫aJ)驗證圖；
圖7是表達載體pPICZ a A-mLEAP-2雙酶切(McoR1、XbaD驗證圖；
圖8是斜帶石斑魚帶限制性酶切位點(McoR1、XbaI)的LEAP-2基因合成產(chǎn)物的電泳鑒定圖；
圖9是克隆載體pMD18-T-LEAP-2雙酶切iEcoRI ,XbaI)驗證圖；
圖10是表達載體pPICZ a A-LEAP-2雙酶切(McoR1、XbaD驗證圖；
圖11是重組株pPICZ a A-LEAP-2-X-33表達產(chǎn)物LEAP-2重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖；
圖12是重組株pPICZaA-LEAP-2-X-33表達產(chǎn)物LEAP-2重組蛋白的western-blot鑒定圖；
圖13是pPICZ a A-LEAP-2畢赤酵母表達載體構建示意圖；
圖14是斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2信號肽預測結果；
圖15是石斑魚抗菌肽LEAP-2的氨基酸序列和其它魚類LEAP-2氨基酸序列的對比圖； 圖16是mLEAP-2抗原表位預測分析；
圖17是石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白對溶藻弧菌抑菌實驗結果；
圖18是石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白對維氏氣單胞菌抑菌實驗結果；
圖19是石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白對大腸桿菌抑菌實驗結果；
圖20是重組株pPICZ a A-mLEAP-2-X-33表達產(chǎn)物mLEAP-2重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖；
圖21是斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2對溶藻弧菌抑菌實驗結果。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
實施例
[0025]一、通過設計簡并引物擴增獲得斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因中間片段 首先在NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上查找斑馬魚、大黃魚、羅非魚、
牙鲆、虹鱒魚抗菌肽LEAP-2基因序列(序列號分別為:NM_001128777.1、JN991058.1、XM_003457723.UEU586111.UAY362186.1)，然后用 ClustalX 2.0 進行序列比對。根據(jù)比對結果設計簡并引物，其中上游引物LEAP-2-S為【5’- TTCACCCAAAGGAAAGCAGC] (SEQ IDN0.6)，下游引物 LEAP-2-A 為【5’- GTCCCGTGGAGCATTCGTAG】(SEQ ID N0.7)。最后使用廣州東盛生物科技有限公司 PCR Mix 以 M-MLV reverse transcriptase kit (Invitrogen,USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板擴增得到斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因中間片段，其中間片段長度為220bp (SEQ ID N0.5)。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖1，其中:M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產(chǎn)物。
[0026]二、斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因5’端片段的合成
操作按照 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech, CA,USA) Protocol來進行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已測序的石斑魚抗菌肽LEAP-2中間片段的序列設計了一條下游基因特異性引物進行5’ RACE擴增。該基因特異性引物LEAP2G-A的序列為【5’ - CATCCGAGCGACCCTCTTCAGTGTG】(SEQ ID N0.9)。
[0027]擴增過程以使用BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD BioscienceClontech, CA，USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA第一條鏈為模板，經(jīng)TaKaRa TaqHot Start Version (TaKaRa Biotechnology, Japan)方法擴增石斑魚抗菌妝 LEAP-2 中間片段序列第144位至5’端的核苷酸序列。其中反應條件為:(1)94°C變性30秒，72°C延伸3分鐘，共5循環(huán)；(2)94°C變性30秒，70°C退火30秒，72°C延伸3分鐘，共5循環(huán)；(3)94°C變性30秒，68 °C退火30秒，72 °C延伸2分鐘，共25循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖2，其中:M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產(chǎn)物。
[0028]將423bp的擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上得到重組質粒pMD18-T_LEAP2_5’。將重組質粒PMD18-T-LE AP2-5’用pMD18_T的一對通用引物進行序列測定，其序列如SEQ IDN0.8所示。測序結果與Genebank的序列進行比較，結果表明克隆得到的423bp產(chǎn)物是斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因5’端序列。
[0029]三、斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因3’端片段的合成
操作按 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech, CA,USA) Protocol來進行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已測序的石斑魚抗菌肽LEAP-2中間片段的序列設計了兩條上游引物LEAP2G-S1和LEAP2G-S2以進行巢式PCR擴增。第一條上游引物 LEAP2G-S1 為【5’ - CTGGC TCAGCAGGTGTGTGCGGGTC】(SEQ ID N0.11)，第二條上游引物LEAP2G-S2 為【5，- CACACTGAAGAGGGTCGCTCGGATG】(SEQ ID N0.12)。
[0030]第一次PCR 以 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD BioscienceClontech, CA，USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA第一條鏈為模板，引物為LEAP2G-SI,經(jīng)touchdown PCR方法擴增抗菌肽LEAP-2中間片段的序列第67位至3’poly A端的核苷酸序列。其中反應條件為:94°C預變性3分鐘；(1)94°C變性30秒，70°C (每增加一個循環(huán)退火溫度減少1°C)退火30秒，72°C延伸2分鐘，共15循環(huán)；(2)94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共15循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物稀釋5倍以后的產(chǎn)物為模板，經(jīng)touchdown PCR方法擴增抗菌肽LEAP-2中間片段的序列第120位至3’ poly A端的核苷酸序列。其中反應條件為:94°C預變性3分鐘；(I)94°C變性30秒，700C (每增加一個循環(huán)退火溫度減少1°C )退火30秒，72°C延伸2分鐘，共15循環(huán)；(2) 94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共15循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。第一次PCR在瓊脂糖凝膠上未能檢測出條帶，第二次PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖3，其中:M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產(chǎn)物。
[0031]將471bp的擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上得到重組質粒pMD18_T-LEAP2_3’。將重組質粒PMD18-T-LEAP2-3’用pMD18_T的一對通用引物進行序列測定，其序列如SEQ IDN0.10所示。測序結果與Genebank的序列進行比較,結果表明克隆的471bp產(chǎn)物是斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因的3’端序列。
[0032]四、斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因全長序列的拼接
將已經(jīng)測序的石斑魚抗菌肽LEAP-2基因中間片段、5’ RACE片段和3’ RACE片段進行拼接，得到全長為869bp的斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因cDNA全序列(SEQ ID N0.1)。其ORF全長，即斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2 cDNA全序列(SEQ ID N0.1)的第262— 561bp，總長為300bp，并推測出其氨基酸序列(SEQ ID N0.2)。
[0033]根據(jù)拼接得到的LEAP-2基因ORF全長設計引物LEAP2FL-S[5’ -TGGTAGAGTCCTCCAGTAAGTGT] ( SEQ ID N0.I 3)，LEAP 2FL-A【5，-GCATAATCCCAGTAATGACAACC】(SEQ ID N0.14)。反應以 M-MLV reverse transcriptasekit (Invitrogen, USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板,經(jīng)touchdown PCR方法擴增石斑魚的抗菌肽LEAP-2 ORF全長序列，擴增的產(chǎn)物長度為440bp。PCR反應條件為:(I) 94°C預變性3分鐘；(2) 94°C變性30秒，55°C (每增加一個循環(huán)退火溫度下降1°C )退火30秒，72°C延伸2分鐘，共15個循環(huán)；(3)94°C變性30秒，43°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共15個循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖4，其中:M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送去華大基因公司測序，測序結果和拼接結果一致。
[0034]五、生物信息學方法分析斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽序列` 經(jīng)文獻調研和NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站搜索,得到了大黃魚、羅非魚和牙鲆LEAP-2成熟肽的氨基酸序列。然后使用SignalP 4.0 ServerChttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預測斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2信號肽序列(圖14)。再使用clustalx和GeneDoc兩個序列分析軟件，將大黃魚、羅非魚和牙鲆LEAP-2成熟肽的氨基酸和斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2氨基酸序列進行序列比對，預測得到斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽的氨基酸序列(圖15) JBSEQ ID N0.4所示。另外，通過DNAstar軟件分析斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因的抗原表位(圖16)，進一步確定包含最多結合位點的斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2的成熟肽基因序列(LEAP-2 ORF的第160bp_300bp，共141bp)。最后，使用RNAstructure 5.3軟件分析了該功能片段的RNA 二級機構,發(fā)現(xiàn)沒有復雜的二級結構。
[0035]六、斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2的密碼子偏好性改造
通過分析比較斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽cDNA原序列和畢赤酵母表達偏好密碼子表，發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽cDNA原序列中存在畢赤酵母低效表達的稀有密碼子。故我們在不改變LEAP-2成熟肽氨基酸序列的基礎上設計了 4條改造引物PU P2、P3、P4并使用引物搭橋法修改了 29個密碼子，共35個核苷酸，得到修改后的LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2序列141bp (SEQ ID N0.3)，加上保護堿基、及^7? I和油a J酶切識別位點、終止密碼子及6Xhis標簽共176bp (如圖5)。其中引物Pl含有保護堿基和I限制性酶切識別位點，引物P4含有保護堿基、Xba I酶切識別位點、終止密碼子及6Xhis標簽。四條引物序列分別為:P1【5’ -GCTGAATTCATGACCCCATTGTGGAGAAT CATGAACTCCAAGCCATTCGGTGCTTACTG】(SEQ ID N0.15)、P2【5’ -GCTC TACACAAACCGGTGGAACACTCGTAGTTGTTTTGACAGTAAGCACCGAAG GCTTG】(SEQ ID N0.16), P3【5’ -TTCCACCGGTTTGTGTAGAGCTG GTCACTGTTCCACCTCCCAAAGATCCTTGTCCGAGCC] (SEQ IDN0.17), P4【5’ -GCTCTAGACTAATGATGATGATGATGATGGTAGTTGACTGGCTCGG ACAAGGATCTTTGG】(SEQ ID N0.18)。第一輪反應將引物P2與P3混合，加入廣州東盛生物科技有限公司的PCRMix,得到約99bp的PCR產(chǎn)物，與預期產(chǎn)物大小相符。反應按照如下條件進行:94°C預變性3分鐘；(I) 94°C變性30秒，64°C (每增加一個循環(huán)退火溫度減少TC )退火30秒，72°C延伸I分鐘，共15循環(huán)；(2)94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共15循環(huán);最后72°C延伸5分鐘。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋5倍后作為模板，以Pl和P4為引物進行第二輪擴增，結果得到約176bp的條帶，與預期大小相符。反應條件為:94°C預變性3分鐘；(I)94°C變性30秒，64°C (每增加一個循環(huán)退火溫度減少1°C )退火30秒，72°C延伸I分鐘，共15循環(huán)；(2)94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共15循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。瓊脂糖電泳結果見圖5，其中:M為分子量標準；NC為陰性對照；I為PCR擴增產(chǎn)物。
[0036]七、含斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2序列的克隆載體
將步驟六所獲得目的基因片段分離純化，然后與PMD18-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系4°C連接過夜(約16h)，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)Amp+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆，通過質粒提取試劑盒提取質粒，質粒經(jīng)過雙酶切驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2克隆到載體中，命名為pMD18-T-mLEAP_2，克隆載體轉化大腸桿菌DH5a所得到的重組菌株命名為pMD18-T- mLEAP-2_DH5 a。使用及、XbaI對克隆載體pMD18-T- mLEAP-2進行雙酶切，酶切圖譜見圖6，其中M: marker, NC為PMD18-T- mLEAP-2,1:pMD18_T- mLEAP-2 的、XbaI 雙酶切產(chǎn)物。
[0037]八、含斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽基因mLEAP-2序列的表達載體pPICZ a A-mLEAP-2的構建
克隆載體PMD18-T- mLEAP-2用限制性內切酶EcoRI和XbaI雙酶切后，酶切產(chǎn)物用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收?；厥债a(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，分離純化得到176bp的斜帶石斑魚成熟肽基因mLEAP-2序列；
載體質粒PPICZ a A經(jīng)限制性內切酶EcoRI和油a/雙酶切后分離純化3.6kb的大片段，與約176bp的斜帶石斑魚LEAP-2成熟肽mLEAP-2基因片段按1:3混合，用T4連接酶16°C連接16小時后用標準氯化鈣轉化法轉入大腸桿菌DH5a中，用低鹽LB平板篩選具Zeocin抗性的轉化子，以標準方法提取質粒，篩選大小約3.Skb的重組質粒，用限制性內切酶雙酶切重組質粒，得到約176bp和3.6kb的兩個片段，大小分別與斜帶石斑魚LEAP-2成熟肽mLEAP-2的基因片段和表達載體pPICZ a A大小相同，證明斜帶石斑魚LEAP-2成熟肽mLEAP-2的基因片段已克隆入畢赤酵母表達載體pPICZ a A中，重組質粒命名為pPICZ a A- mLEAP-2 ο質粒構建流程圖見圖13。使用、油a J對表達載體pPICZ a A-mLEAP-2進行雙酶切，酶切分析圖見圖7，其中M: marker, I:pPICZ a A- mLEAP-2雙酶切產(chǎn)物，NC為pPICZ a A雙酶切產(chǎn)物。
[0038]九、能高效表達斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2的畢赤酵母重組株pPICZ a A- mLEAP-2-X-33的構建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect? Pichia Expression Kit 說明書制備畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，重組質粒pPICZ a A- mLEAP-2用SacI線形化后凝膠回收，用標準方法電擊轉化畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C恒溫培養(yǎng)。約3d后長出單克隆，挑取單克隆經(jīng)誘導培養(yǎng)與鑒定篩選出能高效表達斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2的畢赤酵母重組株pPICZ a AiLEAP-2 _X_33。
[0039]十、利用畢赤酵母基因工程菌pPICZ a A- mLEAP-2 _X_33生產(chǎn)重組斜帶石斑魚抗菌肽 mLEAP-2
分別挑取各種工程菌的單克隆，接種于BMGY中，28°C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，換BMMY培養(yǎng)基稀釋0D600至1.0，每24h向培養(yǎng)基中補加0.5%甲醇，培養(yǎng)24h_96h后2000rpm，4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5X電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標準方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣方法處理后電泳。陰性對照為空載質粒pPICZ a A轉化X-33后長出的單克隆培養(yǎng)后的上清蛋白。結果見圖20，其中:Μ:蛋白分子量標準；NC為陰性對照；1為重組酵母菌株pPICZ a A- mLEAP-2-X_33分別誘導96h后的表達產(chǎn)物。結果顯示與陰性對照相比，重組菌株pPICZ a A- mLEAP-2-X-33表達產(chǎn)物在IOKDa附近出現(xiàn)一條新的蛋白條帶。
[0040]十一、斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2抗原活性鑒定實驗
將重組斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2采用免疫印跡(Western blot)方法進行免疫活性鑒定。一抗為鼠源6xhis標簽單克隆抗體(Novagen), 二抗為羊抗鼠IgG-HRP (鼎國公司)。結果顯示6xhis標簽 單克隆抗體能識別畢赤酵母表達的重組斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2，與Tricine-SDS-PAGE結果一致，證明得到的蛋白即為斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2。
[0041 ] 十二、斜帶石斑魚帶限制性酶切位點的抗菌肽LEAP-2基因ORF序列的合成
根據(jù)拼接得到的斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2的cDNA序列(SEQ ID N0.1),設計合成兩段引物:上游引物是在該片段第I位至第25位堿基前加上保護堿基和feoTPJ的限制性內切酶識別位點【5’- GCTGAATTCATGCAGGAGACAGGCTACTTCACCC] (SEQ ID N0.19)，共 34bp ;下游引物是在該片段互補鏈的第4位至第19位堿基前加上油a/的酶切識別位點、保護堿基、6Xhis 標簽和終止密碼子【5’- GCTCTAGCTAATGATGATGATGATGATGGTAGTTCACAGGCTCT】(SEQID N0.2O),共 45bp。以 M-MLV reverse transcriptase kit (Invitrogen,USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴增得到斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因的ORF序列，PCR反應條件為:94°C預變性3分鐘；(1)94°C變性30秒，63°C (每增加一個循環(huán)退火溫度減少1°C )退火30秒，72 °C延伸I分鐘，共15循環(huán)；(2 ) 94 V變性30秒，49 V退火30秒，72°C延伸I分鐘，共15循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖8，其中:M: marker, I為PCR擴增產(chǎn)物，NC為陰性對照。從圖8可見PCR擴增產(chǎn)物大小約為335bp。
[0042]十三、含斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因序列的克隆載體
將步驟九所獲得目的基因片段分離純化，然后與PMD18-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系4°C連接過夜(約16h)，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)Amp+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆，通過質粒提取試劑盒提取質粒，質粒經(jīng)過雙酶切驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚LEAP-2前體蛋白基因ORF序列克隆到載體中，命名為pMD18-T-LEAP_2，克隆載體轉化大腸桿菌DH5 α所得到的重組菌株命名為pMD18-T-LEAP-2-DH5 α。使用EcoR1、ZhJ對克隆載體pMD18-T-LEAP-2進行雙酶切，酶切圖譜見圖9，其中M: marker, NC為PMD18-T-LEAP-2,1:pMD18-T-LEAP_2 的、XbaI 雙酶切產(chǎn)物。
[0043]十四、含斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因序列的表達載體pPICZa A-LEAP-2的構建 克隆載體PMD18-T-LEAP-2用限制性內切酶EcoRI和XbaI雙酶切后，酶切產(chǎn)物用
E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收,進行瓊脂糖凝膠電泳,分離純化得到335bp的斜帶石斑魚LEAP-2前體蛋白ORF基因序列；
載體質粒pPICZ a A經(jīng)限制性內切酶及和油a/雙酶切后分離純化3.6kb的大片段，與約335bp的斜帶石斑魚LEAP-2前體蛋白ORF基因片段按1:3混合，用T4連接酶16°C連接16小時后用標準氯化鈣轉化法轉入大腸桿菌DH5 α中，用低鹽LB平板篩選具Zeocin抗性的轉化子，以標準方法提取質粒，篩選大小約4.0 kb的重組質粒，用限制性內切酶和ZhJ雙酶切重組質粒，得到335bp和3.6kb的兩個片段，大小分別與斜帶石斑魚LEAP-2前體蛋白ORF基因片段和表達載體pPICZ a A大小相同，證明斜帶石斑魚LEAP-2前體蛋白ORF基因片段已克隆入畢赤酵母表達載體pPICZ a A中，重組質粒命名為pPICZ a A- LEAP-2。質粒構建流程圖見圖13。使用、油aJ對表達載體pPICZ a A- LEAP-2進行雙酶切，酶切分析圖見圖10，其中M: marker, I:pPICZ a A- LEAP-2雙酶切產(chǎn)物，NC:pPICZ α A雙酶切產(chǎn)物。
[0044]十五、能高效表達斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白的畢赤酵母重組株pPICZ a A- LEAP-2 -X-33 構建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect? Pichia Expression Kit 說明書制備畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，重組質粒pPICZ a A- LEAP-2用SacI線形化后凝膠回收，用標準方法電擊轉化畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C恒溫培養(yǎng)。約3d后長出單克隆，挑取單克隆經(jīng)誘`導培養(yǎng)與鑒定篩選出能高效表達斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白的畢赤酵母重組株pPICZ a A-LEAP-2 -X-33。
[0045]十六、利用畢赤酵母基因工程菌pPICZ a A_ LEAP_2 _X_33生產(chǎn)重組斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白
分別挑取各種工程菌的單克隆，接種于BMGY中，28°C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，換BMMY培養(yǎng)基稀釋0D600至1.0，每24h向培養(yǎng)基中補加0.5%甲醇，培養(yǎng)24h_96h后2000rpm，4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5X電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標準方法跑TriCine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣方法處理后電泳。陰性對照為空載質粒PPICZaA轉化X-33后長出的單克隆培養(yǎng)后的上清蛋白。結果見圖11，其中:M:蛋白分子量標準；NC為陰性對照；1、2、3、4:重組酵母菌株pPICZ a A-LEAP-2-X-33分別誘導24h、48h、72h、96h后的表達產(chǎn)物。結果顯示與陰性對照相比，重組菌株pPICZ a A- LEAP-2 -X-33表達產(chǎn)物在12KDa附近出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，并且誘導48h后菌株的表達量最聞。
[0046]十七、斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白抗原活性鑒定實驗
將重組斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白采用免疫印跡(Western blot)方法進行免疫活性鑒定。一抗為鼠源6xhis標簽單克隆抗體(Novagen), 二抗為羊抗鼠IgG-HRP (鼎國公司)。結果見圖12，其中:M:蛋白分子量標準；NC為陰性對照；1、2、3、4:重組酵母菌株pPICZ a A- LEAP-2 _X_33表達產(chǎn)物Western blot鑒定圖譜。結果顯示6xhis標簽單克隆抗體能識別畢赤酵母表達的重組斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白，與Tricine-SDS-PAGE結果一致，證明得到的蛋白即為斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2重組前體蛋白。
[0047]十八、斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2重組前體蛋白抗菌活性檢測實驗
實驗主要采用Kirby-Bauer法(即K-B紙片瓊脂擴散法)檢測斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2重組前體蛋白抗菌活性。供檢測的細菌共3種，即溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus'y^2'^，由中國科學院南海海洋研究所惠贈；維氏氣單胞菌(Vickers aeromonas bacillus) B565,由廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室保藏；大腸桿菌DH5a，購買于廣東省微生物菌種保藏中心；三種均為革蘭氏陰性細菌。首先分別配制LB固體培養(yǎng)基(tryptone 10g, NaCl10g, yeast extract 5g, Agar 15g,加 H2O 至 1000ml,調節(jié) ρΗ=7.2)、TCBS 固體培養(yǎng)基(酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g,硫代硫酸鈉10.0g,枸櫞酸鈉10.0g,牛膽粉5.0g,牛膽酸鈉3.0g,蔗糖20.0g,氯化鈉10.0g,檸檬酸鐵1.0g,麝香草酚蘭0.04g,瓊脂15.0g,加水至1L，pH=8.6土 0.1)和人工海水固體培養(yǎng)基(酵母粉lg，牛肉膏3g，胰蛋白胨5g，瓊脂糖15g，加15%。海水至1L)備用。然后取10 μ I大腸桿菌原菌液加入到20ml LB培養(yǎng)基(tryptone IOg7NaCl10g, yeast extract 5g,加H2O至1000ml,調節(jié)pH=7.2)、取10 μ I溶藻弧菌和維氏氣單胞菌原菌液加入到20ml人工海水培養(yǎng)基(酵母粉lg，牛肉膏3g，胰蛋白胨5g，加15%。海水至1L)中活化，使其0D600值分別達到0.5-1.0。將轉入pPICZ a A的酵母菌液(即空載)和已誘導表達的pPICZ a A- LEAP-2 _X_33重組畢赤酵母菌液于4°C，1000Orpm離心5min，得上清備用。取100 μ I上清和100 μ I Ampicillin (0.005 μ g/ μ L)溶液分別加到直徑均為5mm、已滅菌的濾紙片上,室溫放置30min至濾紙片重新干燥。取50 μ I活化的大腸桿菌、溶藻弧菌和維氏氣單胞菌菌液分別加到LB、TCBS和人工海水固體培養(yǎng)基上，均勻涂布。將加有上清和Ampicillin的濾紙片放置到涂有菌液的培養(yǎng)基上，每板共放置5個濾紙片。最后將大腸桿菌平板放置于37°C的培養(yǎng)箱中,將溶藻弧菌、維氏氣單胞菌放置在28°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈的大小。圖17顯示的是石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白對溶藻弧菌抑菌實驗結果:1為加有Ampicillin的濾`紙片，2為加有轉入pPICZ a A的酵母菌液上清的濾紙片，3為加有已誘導表達的pPICZ a A- LEAP-2 -X-33重組畢赤酵母菌液上清的濾紙片。圖18顯示的是石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白對維氏氣單胞桿菌抑菌實驗結果:1為加有Ampicillin的濾紙片，2為加有轉入pPICZ a A的酵母菌液上清的濾紙片，3為加有已誘導表達的pPICZ a A- LEAP-2 _X_33重組畢赤酵母菌液上清的濾紙片。圖19顯示的是石斑魚抗菌肽LEAP-2重組蛋白對大腸桿菌抑菌實驗結果:1為加有Ampicillin的濾紙片，2為加有轉入pPICZ a A的酵母菌液上清的濾紙片，3為加有已誘導表達的pPICZ a A- LEAP-2-X-33重組畢赤酵母菌液上清的濾紙片。實驗共設置5個上清蛋白濃度梯度，分別為(2c)°、(2c)(2c)_2、(2c)_3、(2c)_4，每個濃度梯度3個重復。實驗結果表明，LEAP-2重組蛋白對溶藻弧菌、維氏氣單胞菌和大腸桿菌的MIC分別為(2c)_4、(2c)_3、(2c)'這一數(shù)據(jù)說明LEAP-2重組前體蛋白對溶藻弧菌和維氏氣單胞菌的抑制效果較為明顯，而對大腸桿菌抑制效果不太明顯。
[0048]十九、斜帶石斑魚抗菌肽mLEAP-2抗菌活性檢測實驗
根據(jù)上面的方法檢測LEAP-2成熟肽對溶藻弧菌的抑菌效果，實驗結果見圖21。I為加有ddH20的濾紙片，2為加有轉入pPICZ a A的酵母菌液上清的濾紙片，3為加有已誘導表達的pPICZ α A- mLEAP-2 -X-33重組畢赤酵母菌液上清的濾紙片，4為加有Ampicillin的濾紙片。實驗結果表明，抗菌肽mLEAP-2對溶藻弧菌具有明顯的抑制效果。
[0049]以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內所進行的`任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發(fā)明的一部分。
【權利要求】
1.石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示，或者是SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
2.編碼權利要求1所述石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白的基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因，其含有SEQID N0.1第262-561 bp所示的核苷酸序列。
4.石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.4所示，或者是SEQID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
5.編碼權利要求4所述石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的基因。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因，其為SEQID N0.1第421-561 bp所示的核苷酸序列，或者是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
7.攜帶有權利要求2、3、5或6所述基因的載體。
8.含有權利要求2、3、5或6所述基因的重組菌株。
9.生產(chǎn)石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白或石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的方法，包括將攜帶有權利要求2、3、5或6所述基因的表達載體導入宿主細胞中，表達得到LEAP-2前體蛋白或LEAP-2成熟肽蛋白。
10.權利要求1或4所述的蛋白在制備抗菌制劑或提高水產(chǎn)動物免疫力制劑中的應用。
【文檔編號】A23K1/17GK103755795SQ201410027857
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2013年3月18日
【發(fā)明者】王維娜, 謝福星, 劉媛 申請人:華南師范大學