快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，該方法是待小孢子胚狀體產(chǎn)生時(shí)，將其轉(zhuǎn)到2000lx、25℃、60r/min搖床上振蕩培養(yǎng)，3～7d后將轉(zhuǎn)綠的子葉型胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖2.5%，瓊脂粉1%的B5固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)獲得再生芽；15～20d后，轉(zhuǎn)入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%瓊脂粉的MS固體培養(yǎng)基中，20～30d后大多數(shù)植株長(zhǎng)成健壯且生根的幼苗，可馴化移栽，培養(yǎng)條件都為90uE/m2/s、12hr/d、25℃。再生植株平均成苗率達(dá)83.5%。本發(fā)明有效解決小孢子胚易褐化、玻璃化的問(wèn)題；有效縮短利用游離小孢子培養(yǎng)獲得DH株系的時(shí)間；不需添加任何激素，更安全。
【專利說(shuō)明】快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]蕓薹屬蔬菜屬于異花授粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，在育種上獲得一個(gè)純系需要5~7年的時(shí)間，而游離小孢子培養(yǎng)可以在I~2年獲得雙單倍體植株，大大節(jié)省純化時(shí)間和工作量。同時(shí)由于再生群體中單倍體的存在也有利于隱性性狀的表達(dá)，豐富了育種資源。此外，游離小孢子屬于單細(xì)胞，應(yīng)用于誘變育種、突變體篩選和基因轉(zhuǎn)化等有其特殊的優(yōu)勢(shì)，自發(fā)或人工加倍獲得的DH群體更是進(jìn)行分子標(biāo)記和繪制基因圖譜的理想材料。
[0003]游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)，是由Lichter (1982)在甘藍(lán)型油菜上首創(chuàng)的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，隨后加拿大、德國(guó)等國(guó)家相繼開(kāi)展了此項(xiàng)研究工作，提高了小孢子的胚誘導(dǎo)頻率，于20世紀(jì)80年代末初步建立了甘藍(lán)型油菜的小孢子培養(yǎng)體系。此后小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕓薹屬不同蔬菜中得到了迅速發(fā)展，創(chuàng)造了從花蕾機(jī)械分離小孢子的方法，確立了可提高誘導(dǎo)率的花蕾標(biāo)準(zhǔn)并將熱激處理用于培養(yǎng)，并在芥菜、結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、青花菜、大白菜等作物上獲得成功。我國(guó)在游離小孢子培養(yǎng)方面的研究起步較晚，主要是借鑒國(guó)外的經(jīng)驗(yàn)，但發(fā)展迅速。20世紀(jì)90年代，曹鳴慶等(1993)、陳玉萍等(1998)和嚴(yán)準(zhǔn)等(1999)分別首次在不結(jié)球白菜、紫菜薹和球莖甘藍(lán)等作物的游離小孢子培養(yǎng)上獲得成功。2003年，朱允華等(2003)首次報(bào)道菜心游離小孢子培養(yǎng)成功。此外蕓薹屬蔬菜中青花菜、芥藍(lán)、花椰菜也先后獲得了小孢子再生植株。
[0004]但前 人的研究主要聚焦在高效誘導(dǎo)胚狀體的產(chǎn)生方面，對(duì)小孢子胚再生植株頻率的研究甚少，而且缺乏深入的研究。但對(duì)于育種工作者來(lái)說(shuō)，小孢子植株遠(yuǎn)比小孢子胚更具有實(shí)際意義。因此，如何獲得高頻率的小孢子再生植株非常關(guān)鍵，也是目前獲得小孢子再生植株群體(DH)的主要限制因素。劉凡等(1997)的研究發(fā)現(xiàn)，小孢子胚能否順利發(fā)育成植株，受內(nèi)外兩種因素的限制。小孢子胚在分化、繼代培養(yǎng)過(guò)程中存在著褐化、玻璃化等現(xiàn)象，直接影響小孢子植株的再生率，因此本發(fā)明旨在建立穩(wěn)定高頻的不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中獲得游離小孢子再生植株存在的成苗效率低的問(wèn)題，提供一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I)花蕾的選擇、預(yù)處理和滅菌:在初花期和盛花期，選取發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的花蕾；將花蕾保濕并置于冰箱中冷藏靜置24h后滅菌；[0009](2)小孢子分離與純化:向滅菌后的花蕾中加入B5-13液體培養(yǎng)基，采用擠壓法使小孢子游離出來(lái)，然后過(guò)濾，收集濾液，離心，棄上清液，得到純化后的小孢子；所述的花蕾與B5-13液體培養(yǎng)基的比例為每28-32個(gè)花蕾中加入I~2ml的B5-13液體培養(yǎng)基。
[0010](3)培養(yǎng)液的分裝、熱激誘導(dǎo):將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養(yǎng)基重新懸浮，然后分裝，小孢子密度I蕾/ml，封口后、熱激誘導(dǎo)；
[0011](4)胚狀體形成:將熱激后的小孢子懸浮液于25°C黑暗靜置培養(yǎng)，2~3周后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的胚狀體；
[0012](5)振蕩培養(yǎng):將上述胚狀體轉(zhuǎn)到20001x、25°C、60r/min搖床上振蕩培養(yǎng)；
[0013](6)誘導(dǎo)再生植株:振蕩培養(yǎng)3~7d后將轉(zhuǎn)綠的子葉型胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)獲得再生芽，15~20d后，將其轉(zhuǎn)入含10%椰汁，3%蔗糖，
0.78%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~30d。 [0014]上述單核靠邊期對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度不結(jié)球白菜為2.0~3.0mm,青花菜為3.0mm~
4.0mm ；
[0015]所述的B5-13液體培養(yǎng)基為小孢子提取液，是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取B5培養(yǎng)基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入130g鹿糖,攪拌至完全溶解，定容至1000ml,然后調(diào)pH至
6.0~6.2 ;于121。。，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
[0016]所述的1/2NLN液體培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取NLN培養(yǎng)基的大量元素25ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再依次加入肌醇0.lg、谷氨酰胺0.8g、絲氨酸0.lg、谷胱甘肽0.03g、鹿糖130g,攪拌至完全溶解后，定容至1000ml,然后調(diào)pH至6.0~6.2 ;采用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌。
[0017]所述的B5固體培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取B5培養(yǎng)基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入25g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入IOg瓊脂粉,攪拌至完全溶解，調(diào)pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
[0018]所述的MS固體培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取MS培養(yǎng)基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液,椰汁100ml混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入30g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入7.8g瓊脂粉，攪拌至完全溶解，調(diào)pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
[0019]步驟(6)中再生植株的培養(yǎng)條件都為90uE/m2/s、12hr/d、25°C。
[0020]所述的滅菌步驟是將預(yù)處理后的花蕾依次用體積濃度為75%的酒精和7% (v/v)的NaClO溶液消毒，無(wú)菌水沖洗。
[0021]所述的熱激誘導(dǎo)是將小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗靜置24h。
[0022]所述的花蕾的選擇是通過(guò)醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發(fā)育時(shí)期及與花蕾長(zhǎng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確找到發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的花蕾。
[0023]培養(yǎng)基中的大量元素可為NH4NO3、KNO3、MgSO4.7H20、(NH4)2S04、NaH2PO4.H2O、Ca(NO3)2 MH2CKKH2PO4XaCl2 中的一種或多種。微量元素可為 MnSO4.H2O、H3B03、ZnSO4.7Η20、K1、Na2MoO4.2H20、CuSO4.5H20、CoCl2.6Η20 中的一種或多種。Fe 鹽可為=Na2-EDTA,FeSO4.7Η20中的一種或多種。有機(jī)元素可為肌醇、煙酸、VB6, VB1、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、谷胱甘肽、葉酸、生物素中的一種或多種。
[0024]上述快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，具體包括如下步驟:
[0025](I)花蕾的選擇:在初花期和盛花期，通過(guò)醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發(fā)育時(shí)期及與花蕾長(zhǎng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確找到發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的花蕾；
[0026](2)花蕾預(yù)處理:將選取的適宜花蕾保濕并置于4°C冰箱中處理24h ；
[0027](3)滅菌:選取的花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用7% (v/v)的NaClO溶液消毒15min，最后用無(wú)菌水沖洗3次，每次3~5min ；
[0028](4)小孢子分離與純化:將消毒后的花蕾置于研缽中,加入I~2ml B5_13液體培養(yǎng)基，采用擠壓法使小孢子游離出來(lái)，然后用300目濾網(wǎng)過(guò)濾，將濾液收集于IOml離心管，1000rpm離心3min,棄上清液,重復(fù)3次；
[0029](5)培養(yǎng)液的分裝:將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養(yǎng)基重新懸浮，然后分裝于60X 15mm培養(yǎng)皿中，每皿3ml，小孢子密度約I蕾/ml，用Parafilm膜封Π ；
[0030](6)熱激誘導(dǎo):將上述小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗處理24h ；
[0031](7)胚狀體形成:將熱激后的小孢子懸浮液于25°C黑暗靜置培養(yǎng)，2~3周后即可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的胚狀體；
[0032](8)振蕩培養(yǎng):將上述胚狀體轉(zhuǎn)到20001x、25°C、60r/min搖床上振蕩培養(yǎng)；
[0033](9)誘導(dǎo)再生植株:振蕩培養(yǎng)3~7d后將轉(zhuǎn)綠的子葉型胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)獲得再生芽，15~20d后，將其轉(zhuǎn)入含10%椰汁，3%蔗糖，
0.78%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中，20~30d即可長(zhǎng)成健壯且生根的幼苗，可馴化移栽；
[0034]游離小孢子培養(yǎng)的各種母液配方如下:`[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)花蕾的選擇、預(yù)處理和滅菌:在初花期和盛花期，選取發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的花雷；將花雷保濕并直于冰箱中冷減靜直24h后滅囷； (2)小孢子分離與純化:向滅菌后的花蕾中加入B5-13液體培養(yǎng)基，采用擠壓法使小孢子游離出來(lái)，然后過(guò)濾，收集濾液，離心，棄上清液，得到純化后的小孢子；所述的花蕾與B5-13液體培養(yǎng)基的比例為每28-32個(gè)花蕾中加入I~2ml的B5-13液體培養(yǎng)基。 (3)培養(yǎng)液的分裝、熱激誘導(dǎo):將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養(yǎng)基重新懸浮，然后分裝，小孢子密度I蕾/ml，封口后、熱激誘導(dǎo)； (4)胚狀體形成:將熱激后的小孢子懸浮液于25°C黑暗靜置培養(yǎng)，2~3周后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的胚狀體； (5)振蕩培養(yǎng):將上述胚狀體轉(zhuǎn)到20001x、25°C、60r/min搖床上振蕩培養(yǎng)； (6)誘導(dǎo)再生植株:振蕩培養(yǎng)3~7d后將轉(zhuǎn)綠的子葉型胚轉(zhuǎn)移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)獲得再生芽，15~20d后，將其轉(zhuǎn)入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~30d。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:單核靠邊期對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度不結(jié)球白菜為2.0~3.0mm,青花菜為3.0mm~4.0mnin
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:所述的B5-13液體培養(yǎng)基為小孢子提取液，是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取B5培養(yǎng)基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入130g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,然后調(diào)pH至6.0~6.2 ;于121。。，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:所述的1/2NLN液體培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取NLN培養(yǎng)基的大量元素25ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再依次加入肌醇0.lg、谷氨酰胺0.8g、絲氨酸0.lg、谷胱甘肽0.03g、鹿糖130g,攪拌至完全溶解后，定容至1000ml,然后調(diào)pH至6.0~6.2 ;采用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:所述的B5固體培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取B5培養(yǎng)基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入25g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入IOg瓊脂粉,攪拌至完全溶解，調(diào)pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:所述的MS固體培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到的:分別吸取MS培養(yǎng)基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機(jī)元素IOml四種母液,椰汁100ml混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入30g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入7.8g瓊脂粉，攪拌至完全溶解，調(diào)pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于:步驟(6)中再生植株的培養(yǎng)條件都為90uE/m2/s、12hr/d、25°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于所述的滅菌步驟是將預(yù)處理后的花蕾依次用體積濃度為75%的酒精和7% (v/v)的NaClO溶液消毒，無(wú)菌水沖洗。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于所述的熱激誘導(dǎo)是將小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗靜置24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于所述的花蕾的選擇是通過(guò)醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發(fā)育時(shí)期及與花蕾長(zhǎng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確找到發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期的花蕾。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103718965SQ201310726458
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】李英, 劉環(huán)環(huán), 侯喜林, 劉同坤 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)