一種快速鑒定月季對白粉病抗性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速鑒定月季對白粉病抗性的方法，以新鮮、健康、完整的月季嫩葉作為侵染材料，套袋隔離處理兩周，收集白粉菌并調(diào)配成孢子懸浮液，然后對侵染材料進行接種、染色、制片，最后病情觀察及病情指數(shù)統(tǒng)計，即得到該月季嫩葉對白粉病的抗性。通過本發(fā)明能準確、快速鑒別出不同基因型月季對白粉病的抗性情況，有效縮短了鑒定周期，且操作簡單，可用于月季雜交育種后代種子的苗期快速抗性鑒定。
【專利說明】一種快速鑒定月季對白粉病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物抗病性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及月季白粉病離體抗性資源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]月季{Rosa hybrida )是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬iRosa )植物，目前已成為世界上最流行的庭園植物，也是重要的盆花及第一大切花。由白粉病菌pannosa,Pp)引起的白粉病害(Powdery mildew)則是全國乃至全球切花月季生產(chǎn)的第一大病害。 [0003]目前，生產(chǎn)中主要通過反復(fù)施用化學藥劑來預(yù)防和控制其發(fā)生，這樣不僅增加了生產(chǎn)成本，同時還造成了環(huán)境的污染和破壞。因此，不論從節(jié)能環(huán)保的方向考慮，還是從縮短育種周期等方向考慮，從現(xiàn)有的月季種質(zhì)資源中發(fā)掘白粉病抗性性狀及其相關(guān)基因并應(yīng)用到現(xiàn)代月季的新品種選育中，從而培育具有白粉病抗性的月季新品種是今后月季遺傳育種的主要方向之一。而白粉病抗性新品種選育的基礎(chǔ)就是抗性資源的準確鑒定。目前，報道的月季白粉病抗性鑒定技術(shù)以葉片侵染觀察法為主，該鑒定方法的不足之處有:鑒定周期過長、結(jié)果準確性不高、操作繁瑣等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)中“葉片侵染觀察法”對月季白粉病抗性鑒定存在鑒定周期過長、肉眼觀察不準確、結(jié)果易受環(huán)境條件影響等不足，本發(fā)明提供一種準確、簡單、快捷篩選月季抗白粉病資源的方法，為下一步的雜交育種親本抗性鑒定、雜交后代抗性快速鑒定等提供技術(shù)支撐。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):一種快速鑒定月季對白粉病抗性的方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟:
(O以新鮮、健康、完整的月季嫩葉作為侵染材料，用紙袋將嫩葉套袋隔離兩周；
(2)將新采集的月季白粉病菌孢子放入滅菌蒸餾水中，調(diào)配成孢子含量數(shù)為
IX IO4^l X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)取步驟(1)的月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，在每片嫩葉反面以滴液的方式，接種步驟(2)的分生孢子懸浮液20uL后，置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，封口后在溫度為20~25°C、光照強度為2000~30001x、光照時間為15~16h/d的條件下培養(yǎng)48"72h ；
(4)將步驟(3)培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在三氯乙酸質(zhì)量含量為0.10-θ.15%的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色36~48h，期間更換2~3次新的上述乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色ClOmin，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水=1: I體積比的溶液進行制片；
(5)將步驟(4)的制片置于光學顯微鏡下，觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計嫩葉上的白粉菌感染情況，即得到該月季嫩葉對白粉病的抗性。[0006]所述步驟(4)的考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-0.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1:1。
[0007]所述步驟(5 )的病情指數(shù)是:
O級為免疫，即無菌絲、無菌落；
I級為高抗，即菌絲長小于IOOum,無菌落；
2級為中抗，即菌落直徑小于400um ；
3級為中感，即菌落直徑小于800um ；
4級為易感，即菌落直徑大于1mm。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點和顯著效果:
(O目前已報道的月季白粉病抗性鑒定方法，是以肉眼觀測為鑒定依據(jù)，其鑒定結(jié)果重復(fù)性不好且準確率低，而本發(fā)明的“離體葉片顯微觀察法”是在月季葉片受白粉病菌侵染后，在人工控制的穩(wěn)定條件下培養(yǎng)一定時間，以白粉菌顯微形態(tài)觀測為鑒定標準進行的。該鑒定方法可為月季白粉病抗病育種工作準確篩選出抗性的月季資源。
[0009](2)目前，月季白粉病抗性鑒定從菌種的收集、侵染、發(fā)病、統(tǒng)計到鑒定結(jié)果至少需要14~21天，是一項周期性較長的工作。本發(fā)明采用分生孢子懸浮滴液、離體葉片營養(yǎng)補充，于一定的條件下培養(yǎng)48h后就能準確、快速鑒別出月季資源不同基因型的白粉病抗性情況，明顯縮短了鑒定周期。
[0010](3)目前，月季白·粉病抗性鑒定有室內(nèi)和室外鑒定法，室外鑒定法需要對鑒定材料進行扦插繁殖，還需統(tǒng)計一定量的樣本重復(fù)數(shù)才能提高實驗結(jié)果的重復(fù)性。本發(fā)明采用葉片離體鑒定法，操作簡單、鑒定快速、實驗結(jié)果準確。可用于月季雜交育種后代種子的苗期快速抗性鑒定，為月季抗性育種后期抗性資源的篩選提供簡單、快速、準確的鑒定方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為日本無刺野薔薇葉片經(jīng)白粉菌侵染48h后白粉菌與寄主互作顯微結(jié)構(gòu)圖；圖2為大花香水月季葉片經(jīng)白粉菌侵染48h后白粉菌與寄主互作顯微結(jié)構(gòu)圖；
圖3為金櫻子月季葉片經(jīng)白粉菌侵染48h后白粉菌與寄主互作顯微結(jié)構(gòu)圖；
圖4為‘杏花村’月季葉片經(jīng)白粉菌侵染48h后白粉菌與寄主互作顯微結(jié)構(gòu)圖；
圖5為‘地平線’月季葉片經(jīng)白粉菌侵染48h后白粉菌與寄主互作顯微結(jié)構(gòu)圖；
圖6為‘云粉’月季葉片經(jīng)白粉菌侵染48h后白粉菌與寄主互作顯微結(jié)構(gòu)圖；
圖中，HA:吸器；C:一級菌絲；SH:二級菌絲。
【具體實施方式】
[0012]以下結(jié)合實例對本發(fā)明做進一步的描述。
[0013]實施例1
(1)以新鮮、健康、完整的日本無刺野薔薇(疋multiflora ‘ Inermis’)嫩葉作為侵染材料，提前兩周用紙袋將嫩葉套袋，做隔離處理，以防止田間自然病原侵染；
(2)用毛筆將新鮮采集的月季白粉病菌孢子刷落至滅菌蒸餾水中，鏡檢統(tǒng)計數(shù)量并調(diào)配成孢子含量為I X 10^1 X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)將步驟(1)所得月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，每片嫩葉取步驟(2)制備的分生孢子懸浮液20uL，由于月季葉片正面革制化程度的增大加大了病菌侵入的難度，因此以滴液的方式對嫩葉反面進行接種，再將嫩葉置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在嫩葉下放一片濾紙防止葉片漂動，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后在溫度為23°C、光強為26001x、光照時間為16h/d的條件下進行的培養(yǎng)48h ；
(4)將步驟(3)所得培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在含0.10-0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色36~48h，期間更換2次乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色6~10min，其中考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-θ.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: 1，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水的體積比=1: I的溶液進行制片；
(5)在光學顯微鏡下觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計步驟(4)所得制片后嫩葉的白粉菌感染情況(如圖1所示):菌絲長小于lOOum，無菌落，即得到日本無刺野薔薇對白粉病的抗性是I級高抗性。
[0014]實施例2
(1)以新鮮、健康、完整的大花香水月季(沿odora ta var.嫩葉作為侵染材料，提前兩周用紙袋將嫩葉套袋，做隔離處理，以防止田間自然病原侵染；
(2)用毛筆將新鮮采集的月季白粉病菌孢子刷落至滅菌蒸餾水中，鏡檢統(tǒng)計數(shù)量并調(diào)配成孢子含量為I X 10^1 X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)將步驟(1 )所得月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，每片嫩葉取步驟(2)制備的分生孢子懸浮液20uL，以滴液的方式對嫩葉反面進行接種，再將嫩葉置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在嫩葉下放一片濾紙防止葉片漂動，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后在溫度為20°C、光強為20001x、光照時間為15h/d的條件下進行的培養(yǎng)48h ；
(4)將步驟(3)所得培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在含0.10-0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色40h，期間更換3次乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色ClOmin，其中考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-θ.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.5、.7%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: 1，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水的體積比=1: I的溶液進行制片；
(5)在光學顯微鏡下觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計步驟(4)所得制片后嫩葉的白粉菌感染情況(如圖2所示):菌落直徑大于1mm，即得到大花香水月季對白粉病的抗性為4級易感。
[0015]實施例3
(O以新鮮、健康、完整的金櫻子O?.月季嫩葉作為侵染材料，提前兩周用
紙袋將嫩葉套袋，做隔離處理，以防止田間自然病原侵染；
(2)用毛筆將新鮮采集的月季白粉病菌孢子刷落至滅菌蒸餾水中，鏡檢統(tǒng)計數(shù)量并調(diào)配成孢子含量為I X 10^1 X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)將步驟(1)所得月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，每片嫩葉取步驟(2)制備的分生孢子懸浮液20uL，以滴液的方式對嫩葉反面進行接種，再將嫩葉置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在嫩葉下放一片濾紙防止葉片漂動，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后在溫度為25°C、光強為30001x、光照時間為15h/d的條件下進行的培養(yǎng)48h ；
(4)將步驟(3)所得培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在含0.10-0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色36h，期間更換3次乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色6~10min，其中考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-0.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: 1，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水的體積比=1: I的溶液進行制片；
(5)在光學顯微鏡下觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計步驟(4)所得制片后嫩葉的白粉菌感染情況(如圖3所示):無菌絲、無菌落，即得到金櫻子月季對白粉病的抗性為O級免疫。
[0016]實施例4
(1)以新鮮、健康、完整的‘杏花村’(Μ.‘Xinghuacun’)月季嫩葉作為侵染材料，提前兩周用紙袋將嫩葉套袋，做隔離處理，以防止田間自然病原侵染；
(2)用毛筆將新鮮采集的月季白粉病菌孢子刷落至滅菌蒸餾水中，鏡檢統(tǒng)計數(shù)量并調(diào)配成孢子含量為I X 10^1 X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)將步驟(1)所得月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，每片嫩葉取步驟(2)制備的分生孢子懸浮液20uL，以滴液的方式對嫩葉反面進行接種，再將嫩葉置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在嫩葉下放一片濾紙防止葉片漂動，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后在溫度為22°C、光強為24001x、光照時間為16h/d的條件下進行的培養(yǎng)48h ；
(4)將步驟(3)所得培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在含0.10-0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色48h，期間更換2次乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色6~lOmin，其中考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-θ.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: 1，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水的體積比=1: 1的溶液進行制片；
(5)在光學顯微鏡下觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計步驟(4)所得制片后嫩葉的白粉菌感染情況(如圖4所示):菌落直徑小于400um，即得到‘杏花村’月季對白粉病的抗性為2級中抗。
[0017]實施例5
(1)以新鮮、健康、完整的‘地平線’LR.‘Dipingxian’)月季嫩葉作為侵染材料，提前兩周用紙袋將嫩葉套袋，做隔離處理，以防止田間自然病原侵染；
(2)用毛筆將新鮮采集的月季白粉病菌孢子刷落至滅菌蒸餾水中，鏡檢統(tǒng)計數(shù)量并調(diào)配成孢子含量為1 X 10^1 X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)將步驟(1)所得月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，每片嫩葉取步驟(2)制備的分生孢子懸浮液20uL，以滴液的方式對嫩葉反面進行接種，再將嫩葉置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在嫩葉下放一片濾紙防止葉片漂動，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后在溫度為24°C、光強為28001x、光照時間為15h/d的條件下進行的培養(yǎng)48h ；
(4)將步驟(3)所得培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在含0.10-0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色44h，期間更換2次乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色6~lOmin，其中考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-θ.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: 1，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水的體積比=1: I的溶液進行制片；
(5)在光學顯微鏡下觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計步驟(4)所得制片后嫩葉的白粉菌感染情況(如圖5所示):菌落直徑小于800um，即得到‘地平線’月季對白粉病的抗性為3級中感。
[0018]實施例6
(1)以新鮮、健康、完整的‘云粉’ LR.‘Yunfen’)月季嫩葉作為侵染材料，提前兩周用紙袋將嫩葉套袋，做隔離處理，以防止田間自然病原侵染；
(2)用毛筆將新鮮采集的月季白粉病菌孢子刷落至滅菌蒸餾水中，鏡檢統(tǒng)計數(shù)量并調(diào)配成孢子含量為I X 10^1 X 105/ml的分生孢子懸浮液；
(3)將步驟(1)所得月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，每片嫩葉取步驟(2)制備的分生孢子懸浮液20uL，以滴液的方式對嫩葉反面進行接種，再將嫩葉置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在嫩葉下放一片濾紙防止葉片漂動，用封口膜將培養(yǎng)皿封口后在溫度為25°C、光強為22001x、光照時間為16h/d的條件下進行的培養(yǎng)48h ；
(4)將步驟(3)所得培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在含0.10-0.15%三氯乙酸的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色40h，期間更換2次乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色ClOmin，其中考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-θ.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: 1，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水的體積比=1: I的溶液進行制片；
(5)在光學顯微鏡下觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計步驟(4)所得制片后嫩葉的白粉菌感染情況(如圖6所示):菌落直 徑大于1_，即得到‘云粉’月季對白粉病的抗性為4級易感。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒定月季對白粉病抗性的方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟: (1)以新鮮、健康、完整的月季嫩葉作為侵染材料，用紙袋將嫩葉套袋隔離兩周； (2)將新采集的月季白粉病菌孢子放入滅菌蒸餾水中，調(diào)配成孢子含量數(shù)為1X 104^l X 105/ml的分生孢子懸浮液； (3)取步驟(1)的月季嫩葉洗凈并吸干表面水份，在每片嫩葉反面以滴液的方式，接種步驟(2)的分生孢子懸浮液20uL后，置于以滅菌蒸餾水為培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，封口后在溫度為20~25°C、光照強度為2000~30001x、光照時間為15~16h/d的條件下培養(yǎng)48"72h ； (4)將步驟(3)培養(yǎng)后的嫩葉浸泡在三氯乙酸質(zhì)量含量為0.10-0.15%的乙醇脫色液中，于37°C下恒溫脫色36~48h，期間更換2~3次新的上述乙醇脫色液，直至嫩葉完全透明，再用考馬斯亮藍染色液進行染色-lOmin，然后用蒸餾水漂洗，最后滴加甘油:水=1: 1體積比的溶液進行制片； (5)將步驟(4)的制片置于光學顯微鏡下，觀察并以病情指數(shù)統(tǒng)計嫩葉上的白粉菌感染情況，即得到該月季嫩葉對白粉病的抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定月季對白粉病抗性的方法，其特征在于:所述步驟(O的套袋隔離法，將嫩葉提前兩周用紙袋套袋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定月季對白粉病抗性的方法，其特征在于:所述步驟(4)的考馬斯亮藍染色液是質(zhì)量濃度為0.10-0.15%的三氯乙酸水溶液:質(zhì)量濃度為。0.50-0.70%的考馬斯亮藍R-250甲醇溶液的體積比=1: I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定月季對白粉病抗性的方法，其特征在于:所述步驟(5)的病情指數(shù)是: O級為免疫，即無菌絲、無菌落； 1級為高抗，即菌絲長小于100um,無菌落； 2級為中抗，即菌落直徑小于400um ； 3級為中感，即菌落直徑小于800um ； 4級為易感，即菌落直徑大于1mm。
【文檔編號】A01G7/00GK103621332SQ201310615202
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】邱顯欽, 紀程, 晏慧君, 陳敏, 張婷, 周寧寧, 李淑斌, 蹇洪英, 王其剛, 張顥, 唐開學 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所