水稻植株形態(tài)建成調(diào)控基因pth1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆一個同時影響水稻株高、分蘗、抽穗期及穗發(fā)育，進(jìn)而影響水稻植株整個形態(tài)特征的基因PTH1(Panicle?size,Plant?height,Tiller?number,Days?to?heading)，以及利用轉(zhuǎn)基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因產(chǎn)物對水稻植株形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，用以獲得農(nóng)作物的理想株型，提高水稻的產(chǎn)量。
【專利說明】水稻植株形態(tài)建成調(diào)控基因PTH1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆一個同時影響水稻株高、分蘗、抽穗期及穗發(fā)育，進(jìn)而影響水稻植株整個形態(tài)特征的基因PTHl (Panicle size, Plant height, Tiller number, Days to heading)，以及利用轉(zhuǎn)基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因產(chǎn)物對水稻植株形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，用以獲得農(nóng)作物的理想株型，提高水稻的產(chǎn)量
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國重要的糧食作物之一，也是單子葉植物的理想模式植物。從植株形態(tài)組成來看，株高、分蘗等對于水稻理想株型的建成具有重要影響。適宜的株高能使水稻單株獲得最大產(chǎn)量的同時保持植株的挺拔，Sdl基因作為20世紀(jì)60年代的水稻綠色革命基因，在水稻產(chǎn)量的突破和提高中起到了決定性的作用；分蘗數(shù)尤其是有效分蘗數(shù)在決定水稻產(chǎn)量形成中具有決定性作用。理論上，水稻品種在一定生育期內(nèi)，形成有效分蘗越多，產(chǎn)量越高；但已有研究表明，適量的有效分蘗更有利于水稻高產(chǎn)，使得水稻生長的中后期能有更多的“源”能“流”入以稻穗為目的地的“庫”中，而不是用于形成過多的分蘗。目前已克隆的IPAl理想株型基因就調(diào)節(jié)植株具有稍高于一般品種的株高、較少的分蘗和大穗，具有明顯的增產(chǎn)效應(yīng)；同時，還有Ghd7、Ghd8/DTH8等同時控制水稻株高、抽穗期和穗粒數(shù)的基因也被克隆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的 技術(shù)問題是提供一種能影響水稻植株形態(tài)建成的蛋白質(zhì)及其基因，以及由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，和利用該基因?qū)λ局晷瓦M(jìn)行改造的方法。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻植株形態(tài)建成調(diào)控基因PTHl編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列。
[0005]作為本發(fā)明的水稻植株形態(tài)建成調(diào)控基因PTHl編碼的蛋白質(zhì)的改進(jìn):上述氨基酸序列還包括在SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
[0006]本發(fā)明還提供一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]作為本發(fā)明基因的改進(jìn):上述核苷酸序列還包括在SEQ ID No:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因或衍生物。
[0008]本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的質(zhì)粒以及含有上述基因的植物表達(dá)載體。
[0009]本發(fā)明還同時提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述基因序列。該宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明還同時提供了改良水稻植株形態(tài)的方法:包括用具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。[0011]進(jìn)一步具體說明:本發(fā)明的目的是提供一種從水稻突變體Pthl中克隆的新基因PTHl，如圖7和SEQ ID No:1所示的DNA序列，也包括與SEQ ID No:1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID No:2和圖8所示的蛋白質(zhì)屬于一類表達(dá)蛋白，其中進(jìn)行一個或幾個氨基酸的替換、插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID No:1中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用PTHl基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID No:1和圖7所示的序列的基因或基因部分片段的載體，其中，如圖4所示的pCAMBIA1300-PTHl，該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。[0013]本發(fā)明還提供了一種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞影響水稻植株形態(tài)的方法。具體地是利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以影響農(nóng)作物株高、分蘗、抽穗期及穗部形態(tài)的方法。[0014]實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下:[0015]一、突變體pthl的分離和遺傳分析:[0016]本發(fā)明的同時影響水稻株高、分蘗、抽穗期及穗部形態(tài)的突變體pthl來自粳稻品種日本晴(Nipponbare)組培誘變。通過與野生型的正反交實驗,證明該突變體受隱性單基因控制，如圖1所示。[0017]二、圖位克隆 PTHl:[0018]DPTHl的初步定位:[0019]為了分離PTHl基因，本發(fā)明首先組建了一個定位群體，由pthl與秈稻品種臺中本地I號雜交配組獲得F2定位群體，再通過圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子標(biāo)記對PTHl位點進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第I染色體上，并介于WY7和WE20兩STS標(biāo)記之間，見圖2。[0020]2) PTHl的精細(xì)定位:[0021] 通過對WY7和WE20兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS標(biāo)記將PTHl精確定位于BAC 0SJNBa0052012上、WY4和WY5標(biāo)記之間24.5kb范圍之內(nèi)(圖3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測候選基因。[0022]3) PTHl基因的鑒定和功能分析:[0023]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖5、6)，證明了本發(fā)明正確克隆了 PTHl基因(圖7)，氨基酸序列分析表明PTHl編碼一個功能未知的表達(dá)蛋白(圖8)。[0024]水稻植株形態(tài)是當(dāng)前超高產(chǎn)水稻育種關(guān)注的重點，通過朔造水稻理想株型來提高生物合成量而實現(xiàn)水稻產(chǎn)量的提高，水稻理想株型的構(gòu)成因子包括:株高稍高于一般品種、較少的分蘗、較粗的莖桿即較強(qiáng)的抗倒伏能力和較多的第一和第二次枝梗等。而PTHl基因能同時影響水稻株高、分蘗、抽穗期及穗發(fā)育，該基因的克隆和應(yīng)用，對水稻株型的改良具有重要意義。[0025]綜上所述，本發(fā)明利用水稻植株形態(tài)突變體，通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了 PTHl基因，通過對PTHl基因的功能解讀，進(jìn)一步闡明了植物特別是禾本科植物形態(tài)建成的遺傳機(jī)制及其作用機(jī)理，為水稻株型育種，創(chuàng)建水稻新種質(zhì)打下基礎(chǔ)。本發(fā)明的基因影響水稻株高、分蘗、抽穗期及穗發(fā)育，進(jìn)而影響水稻植株整個形態(tài)特征。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0027]圖1是突變體pthl與野生型材料的表型圖；
[0028]圖2是PTHl基因在水稻第I染色體上的初步定位圖；
[0029]圖3是PTHl基因的精細(xì)定位圖；
[0030]圖4 是 pCAMBIA1300-PTHl 載體圖譜；
[0031]圖5是功能互補實驗T1轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型圖；
[0032]圖6是pthl與轉(zhuǎn)基因互補T1代水稻植株的穗部表型對比圖；
[0033]圖7是PTHl基因的DNA核苷酸序列；
[0034]圖8是PTHl基因編碼的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0035]實施例1:
[0036]1、水稻材料:
[0037]水稻(Oryzasativa L.)突變體 pthl (Panicle size, Plant height, Tillernumber, Days to heading)的原始野生型為粳稻品種日本晴(Nipponbare)。
[0038]水稻(Oryza sativa L.)突變體pthl的獲得過程具體如下:
[0039]我們利用日本晴幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛的愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的EHA105菌株侵染日本晴愈傷，在黑暗、25°C條件下共培養(yǎng)3天后,在含有40mg/LHygromycin的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有50mg/L預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)。一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。在大田轉(zhuǎn)基因圃中，我們發(fā)現(xiàn)一例株高變矮、分蘗增多、抽穗期延遲及穗部發(fā)育異常的材料，經(jīng)過驗證該表型并不是由外源基因的導(dǎo)入造成。該材料經(jīng)多代自交種植，性狀能穩(wěn)定遺傳。因此，將這種同時表現(xiàn)出“株高變矮、分蘗增多、抽穗期延遲及穗部發(fā)育異?！暗牟牧厦麨镻thl (Panicle size, Plantheight, Tiller number, Days to heading)。
[0040]將突變體pthl與野生型進(jìn)行正反交，即以突變體pthl為母本，日本晴為父本進(jìn)行雜交；同時以日本晴為母本，Pthl為父本進(jìn)行雜交。正反雜交F1代植株均表現(xiàn)出正常的類似日本晴的表型，說明該性狀受隱性基因控制。正反雜交的F1代植株自交獲得的&群體中，表現(xiàn)出日本晴表型的單株與表現(xiàn)出Pthl表型的單株遺傳分離比符合3:1，說明該性狀受單基因控制。由以上分析可知，該突變體表型受隱性單基因控制。
[0041]2、分析和定位群體:
[0042]純合的pthl突變體和秈稻品種臺中本地I號進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，得到8247株F2群體；并從8247株F2群體中選出1888株具有pthl突變表型的個體(即表現(xiàn)為矮桿，多蘗，抽穗期遲，穗部發(fā)育異常；屬于隱性個體)作為定位群體。在灌漿期每株取I克左右的嫩葉，用來提取總DNA。[0043]3、SSR和STS標(biāo)記定位PTHl基因
[0044]采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約0.2g水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于200 μ I超純水中。每一個PCR反應(yīng)用2 μ I DNA樣品。
[0045]PTHl基因的初步定位=Wpthl與臺中本地I號雜交組合的F2群體1888個隱性個體中隨機(jī)選取147個隱性個體，組成的小群體進(jìn)行SSR分析，根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下:
[0046]與目標(biāo)基因連鎖的SSR引物為:
[0047]RM3482F:GCCGCTAATGTTGTTGTCAAGC,
[0048]RM3482R:CGAAGCCAACGTAGTCCAATCC ；
[0049]PCR 反應(yīng)體系為:20ng/ul 水稻基因組 DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul (即上述引物各 Iul )，5U/ul Taq DNA 聚合酶
0.3ul, ddH2010.7ul，總體系 20ul。
[0050]PCR擴(kuò)增條件具體為:94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸40秒，35個循環(huán)；72°C補齊10分鐘；
[0051]經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化`乙啶(EB)染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將PTHl初步定位在第I號染色體長臂上STS標(biāo)記WY7和WE20之間。
[0052]PTHl基因的精細(xì)定位:利用pthl與臺中本地I號組合的F2群體中共計1741株隱性個體，在初定位的基礎(chǔ)上繼續(xù)設(shè)計STS標(biāo)記，最終將PTHl精確定位于BAC 0SJNBa0052012上、WY4和WY5標(biāo)記之間24.5kb范圍之內(nèi)。
[0053]STS標(biāo)記引物序列為:
[0054]WY4F: 5，-TCAACAACTGCTATAAGCGAAAG-3，
[0055]WY4R:5’-GCTAGCTCCAAGGTCTCATCT-3’ ；
[0056]WY5F: 5，-ACTACACTAGGGCTAGGGATC-3，
[0057]WY5R: 5 ’ -TTTAGACCAGCGAATGGCAAG-3 ’.[0058]具體如下:
[0059]PCR 反應(yīng)體系為:20ng/ul 水稻基因組 DNAlul, IOXPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul, 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.3ul，ddH2010.7ul，總體系20ul。
[0060]PCR擴(kuò)增條件具體為:94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性50秒，55°C退火50秒，72°C延伸50秒，38個循環(huán)；72°C補齊10分鐘。
[0061]產(chǎn)物檢測:在含有0.5%Ug/Ul EB的5.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照記錄結(jié)果。
[0062]4、基因預(yù)測和比較分析:
[0063]根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在24.5kb范圍內(nèi)根據(jù)Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.g0.jp)的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)共有2個候選基因,根據(jù)兩標(biāo)記剩余的重組個體數(shù)及共分離標(biāo)記，我們設(shè)計了 2個基因的測序引物，采用PCR方法分別從pthl和野生型品種基因組中擴(kuò)增出這兩個候選基因進(jìn)行測序分析。具體如下:
[0064]目標(biāo)基因測序引物的序列:
[0065]SlF:TCTGCTGTTGCGACCTGGA
[0066]SIR:AGAGCAGCAACTGTGGGAAGG
[0067]S2F:CGAAGACTGCCCATTGCTC
[0068]S2R:ACGGCTTCAGTTCTGGATTG
[0069]S3F:GGTGGATAACTCCCAATGCT
[0070]S3R:GGAGAAATAAACTTGTGCGAGATA
[0071]S4F:AGTAAGGTAAAGCCTGGCAAAT
[0072]S4R:TAGCGGTTCAATACGGTAAGTT
[0073]S5F:ATCCTTTCAACAGAGAACAAC
[0074]S5R:CTTGAGAAACAGGTGAGATAAT
[0075]S6F:CAAAAGAAAAACTGTAGTGAGAAC
[0076]S6R:GCCCTATGCCAAACTATGT
[0077]S7F:GCGATTAAGATTTCGGACG
[0078]S7R:TGGTCAATCGGAAGTCAA
[0079]S8F:TTGAGCGGACAGTAGGA
[0080]S8R:CTTCCCACTTCTCAACCT。
[0081]PCR 擴(kuò)增體系:20ng/ul 水稻基因組 DNAlul, 10XPCR Buffer2.0ul, 25mMMgCl22.0ul, 2mM dNTP2.0ul, IOuM 引物 2.0ul, 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.3ul，ddH2010.7ul，總體系20ul。
[0082]PCR擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個循環(huán)；72°C補齊10分鐘。
[0083]發(fā)現(xiàn)其中I個基因的基因組DNA片段中，突變體pthl擴(kuò)增的產(chǎn)物與野生型品種比較有26個堿基缺失。將此結(jié)果重復(fù)驗證三次，發(fā)現(xiàn)突變體pthl基因與野生型比較都存在26個堿基缺失。根據(jù)BAC克隆0SJNBa0052012序列的基因注釋信息(RiceGAAS)，預(yù)測此基因編碼一個表達(dá)蛋白。
[0084]此基因具有SEQ ID No:I所不的核昔酸序列。
[0085]備注說明；SEQ ID No:1中下劃線標(biāo)注(圖7中灰色陰影標(biāo)注)的為編碼570個氨基酸(SEQ ID No:2)對應(yīng)的核苷酸，即基因的外顯子。
[0086]實施例2:
[0087]植物轉(zhuǎn)化:
[0088]將BAC克隆0SJNBa0052012用SacI和EcoRI完全酶切，電泳分離后，割取9.6kb的DNA片段連接到pCAMBIA1300中，該克隆覆蓋了整個目的基因ORF的基因組區(qū)域，還包括ATG上游2.2kb序列和TAG下游800bp序列。通過電擊的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷。我們利用突變體幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛的愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25°C條件下共培養(yǎng)3天后,在含有40mg/LHygromycin的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有50mg/L預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)。一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因Ttl和T1代植株進(jìn)行鑒定和連續(xù)的觀察，發(fā)現(xiàn)植株形態(tài)，包括株高、分蘗、抽穗期和穗部形態(tài)都恢復(fù)了正常。
[0089]實施例3:
[0090]將本發(fā)明所述的基因?qū)胨就蛔凅wpthl中，最終所得的轉(zhuǎn)基因水稻的“株高、分蘗、抽穗期及穗發(fā)育”與對照水稻品種日本晴相比，均恢復(fù)到正常狀態(tài)。
[0091]以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。有必要指出，本發(fā)明不局限于以上實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【權(quán)利要求】
1.水稻植株形態(tài)建成調(diào)控基因PTHl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于:該蛋白質(zhì)具有SEQIDNo: 2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻植株形態(tài)建成調(diào)控基因PTHl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于:所述氨基酸序列還包括在SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.編碼如權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于:該基因具有SEQID No:l所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述核苷酸序列還包括在SEQID No:l所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
5.一種含有權(quán)利要求3或4所述基因的質(zhì)粒。
6.一種含有權(quán)利要求3或4所述基因的植物表達(dá)載體。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于:該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求3或4所述的基因序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于:該宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求3或4所述基因的用途，其特征在于:用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn)基因水稻的植株形態(tài)得以改良。
【文檔編號】A01H5/00GK103613651SQ201310602467
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】郭龍彪, 錢前, 胡時開, 吳立文, 劉堅, 高振宇, 胡江, 董國軍, 曾大力 申請人:中國水稻研究所