一種凝花菜無菌外植體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凝花菜無菌外植體的制備方法，包括以下步驟：以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和抗真菌素的混合制劑中浸泡15-18h；取出凝花菜外植體將其置于1%-3%的碘化鉀溶液中2-5min；取出凝花菜置于3%-10%的次氯酸鈉溶液中浸泡3-10min，無菌過濾海水清洗干凈后即可獲得無菌的紅藻外植體。本發(fā)明以廣譜抗生素、抗真菌劑、碘化鉀和次氯酸鈉酸鈉為消毒劑，配合使用，可以有效的殺死凝花菜外植體表面的細(xì)菌、真菌和病毒且不損害植株的生長，可以獲得90%無菌可行的外植體。
【專利說明】一種凝花菜無菌外植體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種凝花菜無菌外植體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]凝花菜acerosa (Forsskal))是工業(yè)生產(chǎn)瓊脂產(chǎn)品的重要原材料之一。凝花菜的瓊脂凝膠產(chǎn)量很高，每平方厘米的葉狀體的產(chǎn)量可以達(dá)到600g，如此高的瓊脂產(chǎn)量使人們更青睞于用凝花菜作為提取瓊脂的原材料。每年，從自然種群收獲的200-300噸凝花菜干材料用來本土瓊脂生產(chǎn)，由于生物技術(shù)工業(yè)在國內(nèi)的興起，對瓊脂的需求日益增多，導(dǎo)致其他瓊脂海藻的使用，也導(dǎo)致了為了滿足凝花菜日益增長的市場需求而帶來的過度采集。因為凝花菜分布局限，固有生長和繁殖慢，因此恢復(fù)和保護(hù)過度開發(fā)的凝花菜自然藻床的努力受抑制。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以在短時間內(nèi)繁育大量的微繁體，微繁體與母體的性質(zhì)完全一樣，因而植物組織培養(yǎng)技術(shù)成為目前最受歡迎的快速繁育植株的方法。
[0003]與高等陸生植物組織培養(yǎng)技術(shù)相比，海洋植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究比較落后，海藻組織培養(yǎng)面臨最大的難題就是無法獲得無菌可行的海藻外植體，因為海洋植物是由單層或多層細(xì)胞構(gòu)成的，其的組織結(jié)構(gòu)與陸生植物有很大的差異，沒有高等植物莖葉所具有的維管束結(jié)構(gòu)，也沒有堅硬的表皮保護(hù)；陸生植物常用的酒精、升汞等消毒劑非常容易侵入海藻細(xì)胞的內(nèi)部而造成外植體死亡。目前，大型海藻的組織培養(yǎng)技術(shù)相對落后，已知資料中常用抗生素浸泡或洗滌劑清洗來達(dá)到消毒滅菌的目的，但是，洗滌劑消毒，清洗是非常棘手的問題，而抗生素有很多方面的危害，對處理后的外植體以及再生的植株有怎樣的危害還不得知，上述處理凝花菜外植體的可行性非常低，最多只能獲得50%的無菌外植體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種凝花菜無菌外植體的制備方法，本方法簡單、易行、安全，短時間內(nèi)為凝花菜組織培養(yǎng)提供充足的高效、可行的無菌外植體來源。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法，包括以下步驟:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和抗真菌素的混合制劑中浸泡15-18h ;取出凝花菜外植體將其置于1%_3%的碘化鉀溶液中2-5min ;取出凝花菜置于3%_10%的次氯酸鈉溶液中浸泡3-10min，無菌過濾海水清洗干凈后即可獲得無菌的紅藻外植體。
[0006]一種鑒定凝花菜外植體無菌性的方法，以按照上述消毒方法獲得的外植體作為實驗對象，將實驗對象切成3_5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。
[0007]進(jìn)一步的，所述的抗真菌素為青霉素、土霉素、鏈霉素、制霉菌素中的任意一種。[0008]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明以廣譜抗生素、抗真菌劑、碘化鉀和次氯酸鈉酸鈉為消毒劑，配合使用，可以有效的殺死凝花菜外植體表面的細(xì)菌、真菌和病毒且不損害植株的生長，可以獲得90%無菌可行的外植體。
【具體實施方式】
[0009]以下通過實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的有益效果:
實施例1:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和青霉素的混合制劑中浸泡16h ;取出凝花菜外植體將其置于2%的碘化鉀溶液中3min ;取出凝花菜置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡5min，無菌過濾海水清洗干凈后切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。每個切段單獨接種于一個培養(yǎng)皿中，共接種100塊，其中有8塊被污染，2塊變黑死亡，可以獲得90%的無菌外植體。
[0010]實施例2:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和 土霉素的混合制劑中浸泡16h ;取出凝花菜外植體將其置于2%的碘化鉀溶液中3min ;取出凝花菜置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡5min，無菌過濾海水清洗干凈后切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。每個切段單獨接種于一個培養(yǎng)皿中，共接種100塊，其中有10塊被污染，5塊變黑死亡，可以獲得85%的無菌外植體。
[0011]實施例3:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和鏈霉素的混合制劑中浸泡16h ;取出凝花菜外植體將其置于2%的碘化鉀溶液中3min ;取出凝花菜置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡5min，無菌過濾海水清洗干凈后切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。每個切段單獨接種于一個培養(yǎng)皿中，共接種100塊，其中有14塊被污染，5塊變黑死亡，可以獲得81%的無菌外植體。
[0012]實施例4:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和制霉菌素的混合制劑中浸泡16h ;取出凝花菜外植體將其置于2%的碘化鉀溶液中3min ;取出凝花菜置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡5min，無菌過濾海水清洗干凈后切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。每個切段單獨接種于一個培養(yǎng)皿中，共接種100塊，其中有13塊被污染，10塊變黑死亡，可以獲得77%的無菌外植體。[0013]實施例5:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和青霉素的混合制劑中浸泡15h ;取出凝花菜外植體將其置于1%的碘化鉀溶液中2min ;取出凝花菜置于3%的次氯酸鈉溶液中浸泡3min，無菌過濾海水清洗干凈后切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。每個切段單獨接種于一個培養(yǎng)皿中，共接種100塊，其中有22塊被污染，5塊變黑死亡，可以獲得73%的無菌外植體。
[0014]實施例6:
一種凝花菜無菌外植體的制備方法:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和青霉素的混合制劑中浸泡18h ;取出凝花菜外植體將其置于3%的碘化鉀溶液中5min ;取出凝花菜置于10%的次氯酸鈉溶液中浸泡lOmin，無菌過濾海水清洗干凈后切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。每個切段單獨接種于一個培養(yǎng)皿中，共接種100塊，其中有3塊被污染，15塊變黑死亡，可以獲得82%的無菌外植體。
[0015]上述實例只是為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思以及技術(shù)特點，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種凝花菜無菌外植體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:以凝花菜的葉狀體作為外植體，用無菌過濾海水沖洗干凈后置于3%的廣譜抗生素和抗真菌素的混合制劑中浸泡15-18h ;取出凝花菜外植體將其置于1%_3%的碘化鉀溶液中2-5min ;取出凝花菜置于3%-10%的次氯酸鈉溶液中浸泡3-10min，無菌過濾海水清洗干凈后即可獲得無菌的紅藻外植體。
2.一種檢驗權(quán)利要求1所述的外植體無菌性的方法，其特征在于，包括以下步驟:以按照權(quán)利要求1所述的消毒方法獲得的外植體作為實驗對象，將實驗對象切成3-5mm的切段，將切段接種于無菌檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周檢測無菌性；所述的無菌檢測培養(yǎng)基的配方為，IL VS培養(yǎng)基中添加5g瓊脂、15g葡萄糖和IOg細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的抗真菌素為青霉素、土霉素、鏈霉素、制霉菌素中的任意 一種。
【文檔編號】A01H4/00GK103651126SQ201310592752
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】張亞麗 申請人:張亞麗