兔眼藍(lán)莓組培快繁體系的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】兔眼藍(lán)莓組培快繁體系的構(gòu)建方法，涉及植物組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明選取水培苗的莖段為外植體，用酒精和升汞處理后接種在莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)一步將莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段豎直插于莖芽系增殖培養(yǎng)中，并在生根培養(yǎng)中取IBA濃度2.0mgL-1，生根率高于85%。上述取水培苗作為來(lái)源，其污染率和褐化率明顯低于溫室培育苗；用酒精和升汞消毒相互促進(jìn)；莖芽系誘導(dǎo)、增殖與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；IBA對(duì)生根的影響為單因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】兔眼藍(lán)莓組培快繁體系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物的栽培方法，特別是涉及植物組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)莓是ー種重要的經(jīng)濟(jì)林木，果實(shí)深藍(lán)色，果肉細(xì)膩，風(fēng)味獨(dú)特，被譽(yù)為“水果皇后”，“美瞳之果”，被國(guó)際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一。藍(lán)莓具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，果肉富含維生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素(Debnath & McRAE, 2001 ；Debnath,2005)。兔眼藍(lán)莓{Vacciniutn ashe1.)屬杜醇花科越桔屬多年生落葉灌木(Vander, 1988;Ratnaparkhe, 2007)。Lohachoompol (2008)認(rèn)為兔眼藍(lán)莓花青苷含量顯著高于高叢藍(lán)莓，豐富的花青苷色素可以緩解眼睛疲勞、改善人的視力。兔眼藍(lán)莓較其它藍(lán)莓長(zhǎng)勢(shì)更強(qiáng)，抗病又抗旱(Powell et al，1989)，且較其它藍(lán)莓產(chǎn)量高。除了作為ー種水果食用外，兔眼藍(lán)莓正在被開(kāi)發(fā)成果醬、飲料等多種形式(Su & Silva，2006)，人們對(duì)藍(lán)莓的需求越來(lái)越大形成了良好的市場(chǎng)前景，從而帶動(dòng)了大量?jī)?yōu)質(zhì)藍(lán)莓品系的擴(kuò)繁和栽培(Scherm & Krewer, 2003 ；Strik & Yarborough, 2005)。
[0003]藍(lán)莓的繁殖方式主要為扦插和組培，扦插育苗存在時(shí)間限制，而組織培養(yǎng)是無(wú)性系快繁、種質(zhì)改良和遺傳資源保存的重要方式之一(Debnath，2007)，具有周期短、不受季節(jié)和時(shí)間的限制及繁埴系數(shù)高等特點(diǎn)(Yin & Wang, 2009)。據(jù)報(bào)道(Cao & Hammerschlag,2000;Debnath, 2004):藍(lán)莓的組培途徑分為莖芽系微繁和愈傷增殖兩種方式。藍(lán)莓的增殖培養(yǎng)，影響增殖的主導(dǎo)因素有ZT、TDZ和2iP。Debnath和McRAE(2001)在canberry增殖培養(yǎng)中，使用 2.5mg/L 2iP綜合效果最佳。在bilberry (Shibli 和 Smith, 1996) >Iingonberry(Debnath, 2005)和 highbush blueberry (Cao 和 Hammerschlag, 2000)增通培養(yǎng)中，使用1.lmg/L TDZ 綜合效果最佳。在 half-highbush blueberry (Zhao 等，2011)的增埴培養(yǎng)中，使用 5mg/L ZT 綜合效果最佳。在 lowbush blueberry (Debnath, 2004 ；2009)的增值培養(yǎng)中，使用0.9mg/L ZT綜合效果最好。藍(lán)莓的生根方式有瓶?jī)?nèi)生根和體外生根兩種。目前，在 bilberry (Shibli 和 Smith, 1996)、lowbush blueberry (Debnath, 2004)和 lingonberry(Debnath, 2005)體外生根培養(yǎng)中，使用IBA生根粉綜合效果最佳。在half-highbushblueberry (Zhao等，2011)的瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)中，使用2mg/L IBA綜合效果最佳。同時(shí),在藍(lán)莓無(wú)菌培養(yǎng)系建立過(guò)程中，鮮有關(guān)于取材來(lái)源對(duì)消毒效果影響的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明g在通過(guò)對(duì)兔眼藍(lán)莓組織培養(yǎng)的各步驟研究，包括外材來(lái)源、外植體消毒、ZT、NAA和栽培品種對(duì)莖芽系増殖、IBA對(duì)生根培養(yǎng)的影響，提供一種兔眼藍(lán)莓組培快繁體系的構(gòu)建方法，建立其優(yōu)良品系。
[0005]本發(fā)明通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)兔眼藍(lán)莓的構(gòu)建方法的目的:
構(gòu)建方法包括莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)、莖芽系増殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，其中:
選取水培苗的莖段為外植體，先用70%的酒精處理20seC，再用0.1%的升汞處理18min，然后接種在莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組合為WPM+1.0 mgじ1ZT +5g/LAgar+30g/L Sucrose。
[0006]所述的構(gòu)建方法是將兔眼藍(lán)莓莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段豎直插于莖芽系増殖培養(yǎng)中，該培養(yǎng)基組合為 WPM+2.0 IngL1ZT +0.01 IngL1NAA +5g/L Agar+30g/L Sucrose,綜合表現(xiàn)最佳。
[0007]所述的構(gòu)建方法是在兔眼藍(lán)莓組培的生根培養(yǎng)中，該培養(yǎng)基組合為l/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，其中，IBA 濃度 2.0mgじ1 IBA 對(duì)生根培養(yǎng)綜合表現(xiàn)最好,生根率高于85%。
[0008]本發(fā)明具有的積極效果和意義是:
本發(fā)明在兔眼藍(lán)莓無(wú)菌培養(yǎng)系建立過(guò)程中，選取水培苗和溫室培育苗作為來(lái)源，對(duì)取材來(lái)源與消毒效果影響進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明:取水培苗作為來(lái)源，其污染率和褐化率明顯低于溫室培育苗。而在相同來(lái)源外材的條件下，最佳的莖段消毒體系為取水培苗莖段，先用70%酒精處理20s，然后用0.1%升汞處理18min。在此過(guò)程中，升汞的效應(yīng)大于酒精，而且兩者之間有交互作用，即酒精和升汞對(duì)消毒會(huì)產(chǎn)生相互促進(jìn)的效果。這與Debnath(2004)、Debnath (2005)和Zhao等(2011)的觀點(diǎn)不一致。出現(xiàn)這種情況的可能原因有:⑴兔眼藍(lán)莓與其它藍(lán)莓物種不同，莖段消毒體系有所差異；(2)酒精増加莖段表面的透性，提高升汞對(duì)外材的消毒效果；(3)水培苗相對(duì)溫室苗而言，整體的污染度會(huì)降低。
[0009]在兔眼藍(lán)莓莖芽系增殖培養(yǎng)中，2.0mg/L ZI^P0.01mg/L NAA的綜合表現(xiàn)最佳。其中，品種間遺傳差異是影響株高的主導(dǎo)因素；ZT是影響葉片數(shù)量及長(zhǎng)度、增值倍數(shù)的主導(dǎo)效應(yīng)，且以2.0mg/L的濃度表現(xiàn)最佳。后者區(qū)別于已知的影響藍(lán)莓増殖的主導(dǎo)因素中選擇的 5mg/L ZT 最佳綜合效果(half-highbush blueberry, Zhao 等，2011),以及在 lowbushblueberry (Debnath, 2004 ；2009)的增值培養(yǎng)中，使用0.9mg/L ZT得到最好綜合效果的文獻(xiàn)記載。
[0010]本發(fā)明在兔眼藍(lán)莓生根培養(yǎng)中，2.0mgL 1IBA對(duì)藍(lán)莓生根培養(yǎng)綜合表現(xiàn)最佳，生根率大于85%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖f 4是本發(fā)明涉及的兔眼藍(lán)莓在增值培養(yǎng)中，葉片數(shù)與長(zhǎng)度、株高和增值倍數(shù)隨各因素水平極差變化圖。其中，
圖1為株高在不同ZT濃度水平和不同NAA濃度水平數(shù)值的折線(xiàn)圖。
[0012]圖2為葉片數(shù)量在不同ZT濃度水平和不同NAA濃度水平數(shù)值的折線(xiàn)圖。
[0013]圖3為葉片長(zhǎng)在不同ZT濃度水平和不同NAA濃度水平數(shù)值的折線(xiàn)圖。
[0014]圖4為增值倍數(shù)在不同ZT濃度水平和不同NAA濃度水平數(shù)值的折線(xiàn)圖。
[0015]圖5~圖10為兔眼藍(lán)莓組培苗的無(wú)菌培養(yǎng)系各階段示意圖。其中，
圖5為兔眼藍(lán)莓組培苗的無(wú)菌培養(yǎng)系示意圖。
[0016]圖6為兔眼藍(lán)莓‘Brightwell’莖芽系的增殖示意圖。
[0017]圖7為兔眼藍(lán) 莓‘Premier’莖芽系的增殖示意圖。
[0018]圖8為兔眼藍(lán)莓‘Garden Blue’莖芽系的增殖示意圖。
[0019]圖9為兔眼藍(lán)莓組培苗生根培養(yǎng)示意圖。[0020]圖10為兔眼藍(lán)莓組培苗移栽馴化。
[0021]以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明對(duì)進(jìn)ー步說(shuō)明。本發(fā)明包括但不限于實(shí)施方式記載的內(nèi)容。
【具體實(shí)施方式】
[0022](一)以L18(2 X 37)考査酒精和升汞對(duì)水培兔眼藍(lán)莓幼莖段消毒的影響
培養(yǎng)基組合選用l/2MS+5g/L Agar+30g/L Sucrose,調(diào)節(jié)pH至5.8分裝至SigmaChemical C0.的175mL塑料蓋玻璃瓶，121 °C滅菌20min。外植體選用‘Brightwell’、‘Premier’、‘Garden Blue’之3種兔眼藍(lán)莓水培的和大田中的當(dāng)年生幼莖段，采自西南林業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。用0.1%的洗潔精浸泡葉片lmin，然后用流水沖洗2h，置于超凈工作臺(tái)上，采用L18(2X37)正交實(shí)驗(yàn)研究70%酒精和0.1%升汞對(duì)外植體消毒的影響，接著用無(wú)菌水浸泡3次，毎次5min。將單芽莖段插于培養(yǎng)基上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)設(shè)18個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合接種30個(gè)外植體，如表1。在培養(yǎng)架上擺放采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，光照16h/d，培養(yǎng)7d后，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果表明:使用水培苗的莖段，先用70%的酒精處理20sec，再用0.1%的升萊處通18min,污染率最低,活性最聞。
[0023]表1幼莖段消毒水平和參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.兔眼藍(lán)莓組培快繁體系的構(gòu)建方法，包括莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)、莖芽系増殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，其特征是選取水培苗的莖段為外植體，先用70%的酒精處理20seC，再用0.1%的升汞處理18min，然后接種在莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組合為WPM+1.0 mg.じ1ZT +5g/LAgar+30g/L Sucrose。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是將兔眼藍(lán)莓莖芽系誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段豎直插于莖芽系增殖培養(yǎng)中，該培養(yǎng)基組合為WPM+2.0 mg?じ1ZT +0.01 mg.じ1NAA +5g/LAgar+30g/L Sucrose,綜合表現(xiàn)最佳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征是在兔眼藍(lán)莓組培的生根培養(yǎng)中，該培養(yǎng)基組合為 l/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，其中，IBA濃度 2.0mg.じ1 IBA對(duì)生根培養(yǎng)綜合表現(xiàn)最好，生根率聞?dòng)?5%。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103583368SQ201310592650
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】張?zhí)? 劉小珍, 張漢堯 申請(qǐng)人:西南林業(yè)大學(xué)