一種牛樟莖段組培快繁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛樟莖段組培快繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛棒（CY/zaaffiofiK/ffl/fafleAirae1 ZfejO 隸屬于棒科（LaaraceaeO 棒屬（Cinnamomum)， 又名黑樟，為中國臺(tái)灣本土特有常綠闊葉樹種。牛樟樹干通直、樹體高大及初生葉多變，具 有良好的觀賞價(jià)值，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ木坝^樹木。牛樟木材還具有特殊的香味，且不易 腐朽、材質(zhì)細(xì)致、紋理交錯(cuò)和刨削容易等特點(diǎn)，為著名的建筑、家具及雕刻工藝用材。牛樟全 株均可提煉牛樟油。
[0003] 牛樟樹上寄生的真菌一一牛樟芝，被稱為"深林中的紅寶石"，含有200多種三萜 類化合物，對胃腸疼痛、癌癥、糖尿病和酒精肝等有獨(dú)特療效，具有極高的科研和商業(yè)價(jià)值。 如今牛樟芝價(jià)格飆升，市場供不應(yīng)求。最新研宄表明牛樟椴木可栽培出外觀、香氣、苦味和 成分等能完全取代野生牛樟芝的樟芝，導(dǎo)致原本稀少的牛樟變得異常珍貴，牛樟需求量劇 增，價(jià)格也隨之飆升。
[0004] 牛樟原本在中國南方分別較廣，海拔200~2000公尺均有自然分布，但由于過去牛 樟芝的采集導(dǎo)致牛樟已被過量采伐，現(xiàn)只在中國臺(tái)灣的高山地區(qū)還有零星分布，且多為逾 齡老樹。牛樟花屬黏質(zhì)蟲媒花，母樹間授粉困難，且多開于樹冠頂端，易遭風(fēng)害，偶有種子形 成在成熟前即遭鳥、獸食害，采種困難。在自然狀態(tài)下，即使有成熟種子天然下種，也因林下 光照不足，枯枝落葉過厚使種子不易著床發(fā)芽等原因，導(dǎo)致牛樟自然成苗困難。牛樟數(shù)量稀 少，已列為保育類植物?？焖俣康胤敝碁l危的牛樟樹，供應(yīng)市場需求，應(yīng)當(dāng)是林業(yè)工作 的當(dāng)務(wù)之急。
[0005] 近年來，科研人員對牛樟的扦插育苗、嫁接育苗等無性繁殖方式進(jìn)行了研宄，但 受季節(jié)和材料資源的限制，牛樟扦插苗成活率和出苗率較低，不能進(jìn)行大規(guī)模的繁育。目 前，已公布了以牛樟體胚為材料的牛樟體胚培養(yǎng)基及組培快繁方法(公開號(hào)CN 101429489 A)，但關(guān)于利用牛樟莖段組織為材料進(jìn)行組培快繁的方法還未見報(bào)道。為滿足牛樟的大量 需求，適應(yīng)大規(guī)模林業(yè)生產(chǎn)，拯救牛樟這種即將滅絕的的物種資源，成熟的牛樟莖段組培快 繁技術(shù)具有極其重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對牛樟物種瀕危，目前已有的扦插和嫁接育苗技術(shù)不成熟，成活率低，不能進(jìn)行 大規(guī)模的繁育等問題，本發(fā)明提供了一種牛樟莖段組培快繁的方法。所述方法，能快速批量 地繁殖牛樟，適應(yīng)大規(guī)模林業(yè)生產(chǎn)，滿足市場需求。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。
[0008] -種牛樟莖段組培快繁的方法，包括如下步驟： 51. 誘導(dǎo)培養(yǎng)：將牛樟莖段外植體消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)； 52. 增殖培養(yǎng)：將Sl萌發(fā)的芽依次接種于增殖培養(yǎng)基A和增殖培養(yǎng)基B上，分化出叢 芽； 所述增殖培養(yǎng)基A包括：MS培養(yǎng)基，Vc 2. O mg/L，生物素0. 30 mg/L，L-半胱氨酸5. O mg/L，6-BA 2. 5 mg/L，IBA 0· 25 mg/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 7 g/L，pH 值 5. 8 ; 所述增殖培養(yǎng)基B包括：MS培養(yǎng)基，Vc 2. 0 mg/L，生物素0. 30 mg/L，L-半胱氨酸5. 0 mg/L，6_BA I. 5mg/L，IBA 0· lmg/L，鹿糖 30g/L，瓊脂 7 g/L，pH 值 5. 8 ; 53. 壯苗培養(yǎng)：將S2分化出的叢芽接種于壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)； 54. 生根培養(yǎng)：將S3經(jīng)過壯苗的叢芽切成單株接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生根后繼續(xù) 培養(yǎng)獲得牛樟苗。
[0009] 本發(fā)明優(yōu)化了增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的組分含量。發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)， 用所述增殖培養(yǎng)基A培養(yǎng)牛樟一段時(shí)間后，腋芽萌發(fā)伸長快，且能分化出的大量的芽；后幾 代轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，激素濃度降低，減少葉片干枯死亡，分化出大量叢芽，月繁 殖系數(shù)達(dá)到4~6倍，在繁殖過程中形態(tài)正常，保證增殖的同時(shí)抑制了牛樟死苗，大大提高牛 樟的繁育苗木效率。
[0010] 本發(fā)明首次建立了一套完整的具有高誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)的誘導(dǎo)、增殖、生根和煉 苗的快繁方法，形成批量快速的繁殖局面，極大提高牛樟繁育的效率，拯救了牛樟這種即 將滅絕的的物種資源，為具有極高藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的牛樟芝的生產(chǎn)和研發(fā)提供了大量原材 料。
[0011] 優(yōu)選地，S2所述增殖培養(yǎng)基A培養(yǎng)時(shí)間為60天。
[0012] 優(yōu)選地，S2所述增殖培養(yǎng)基B培養(yǎng)時(shí)間為150~180天。
[0013] S2所述增殖培養(yǎng)使腋芽萌發(fā)伸長，隨后分化出叢芽。
[0014] 優(yōu)選地，所述腋芽萌發(fā)伸長的時(shí)間為接種到增殖培養(yǎng)基A上20天后。優(yōu)選地，所 述分化出叢芽的時(shí)間為接種到增殖培養(yǎng)基A上40天后。
[0015] 優(yōu)選地，Sl所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：MS培養(yǎng)基，Vc 2. 0 mg/L，生物素0. 30 mg/L， L-半胱氨酸 5. 0 mg/L，6-BA 1.0 mg/L，IBA 0· I mg/L，活性炭 0· 5 g/L，鹿糖 30g/L，瓊脂 7 g/L，pH 值 5.8。
[0016] SI所述誘導(dǎo)培養(yǎng)使牛樟莖段先萌發(fā)新芽，后展開葉片。優(yōu)選地，所述萌發(fā)新芽的 時(shí)間為接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上15天后；所述展開葉片的時(shí)間為接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上25天后。 更優(yōu)選地，牛樟莖段萌發(fā)出新芽后即可接種至S2所述增殖培養(yǎng)基上。
[0017] 優(yōu)選地，S3所述壯苗培養(yǎng)基包括：MS培養(yǎng)基，Vc 2. 0 mg/L，生物素0. 30 mg/L， 1^-半胱氨酸5.〇11^凡，6-1^1.〇11^/1^，'\^10.111^/1^鹿糖3(^/1^瓊脂7 8/1^4!1值5.8。
[0018] S3所述壯苗培養(yǎng)使叢芽培養(yǎng)成健壯翠綠的植株。優(yōu)選地，所述將叢芽培養(yǎng)成健壯 翠綠的植株的時(shí)間為接種到壯苗培養(yǎng)基上30天后。
[0019] 優(yōu)選地，S1~S3所述的所有培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為每天光照10~12h，溫度為25° C。
[0020] 優(yōu)選地，S4所述生根培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基，IBA 0. 05mg/L、ABT生根粉 0.2〇11^/1，活性炭1.〇8/1，鹿糖358/1，瓊脂7 8/14!1值5.8。
[0021] S4所述生根培養(yǎng)得到有根的完整植株。優(yōu)選地，所述得到有根的完整植株的時(shí)間 為接種到生根培養(yǎng)基上30天后。
[0022] 優(yōu)選地，Sl所述牛樟莖段選自當(dāng)年生牛樟嫩枝去葉留柄。更優(yōu)選地，Sl所述牛樟 莖段選自健康牛樟母樹當(dāng)年生的腋芽飽滿且尚未萌發(fā)的幼嫩側(cè)枝，除去葉片并保留1~2 cm 的葉柄，切成4~6 cm長的莖段進(jìn)行后續(xù)處理。
[0023] 優(yōu)選地，Sl所述外植體消毒為將牛樟莖段依次于甲基托布津、酒精和升汞溶液中 進(jìn)行處理，并用無菌水沖洗干凈。更優(yōu)選地，Sl所述外植體消毒先將牛樟莖段于洗衣粉水 中浸泡30 min后，再依次于甲基托布津、酒精和升汞溶液中進(jìn)行處理。
[0024] 所述Sl將甲基托布津、酒精和升汞配合使用，可進(jìn)行深度殺菌，達(dá)到比單一消毒 劑或僅使用酒精和升汞時(shí)更好的消毒效果。其中，甲基托布津是一種光譜性的高效、低毒、 低殘留的內(nèi)吸性殺菌劑，被植物吸收后轉(zhuǎn)化為多菌靈，干擾真菌有絲分裂中紡錘體的形成， 影響細(xì)菌細(xì)胞分裂，使細(xì)胞壁中毒，孢子萌發(fā)長出的芽管畸形，從而殺死病菌?，F(xiàn)有技術(shù)中 甲基托布津主要用于對苗床、栽培基質(zhì)和組培苗等進(jìn)行消毒，或預(yù)防并治療植株栽培過程 中出現(xiàn)的白粉病、煙煤病等真菌病，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將甲基托布