一種無(wú)菌可注射材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種無(wú)菌可注射材料的制備方法，特別涉及無(wú)菌可注射透明質(zhì)酸凝膠 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid)是一種是由單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺 組成的高分子粘多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之間由0-1，3-配糖鍵相連，雙糖 單位之間由0-1，4-配糖鍵相連。商品化透明質(zhì)酸一般為其鈉鹽，即透明質(zhì)酸鈉（Sodium Hyaluronate)，簡(jiǎn)稱HA，習(xí)慣上仍稱為透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性 質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，尤其具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界 中保濕性最好的物質(zhì)，被稱為理想的天然保濕因子（Natural moisturizing factor，NMF)。 透明質(zhì)酸廣泛分布于人體各部位，其中皮膚也含有大量的透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸被廣泛應(yīng)用 于眼科粘彈性保護(hù)、骨關(guān)節(jié)功能改善、外科防粘連、組織填充等醫(yī)用和整形美容領(lǐng)域。透明 質(zhì)酸被注入真皮或皮下組織中，使皮下組織容積增大，同時(shí)透明質(zhì)酸可以吸收周圍組織的 水分，使原本松弛、凹陷的皮膚體積增大而恢復(fù)飽滿的形態(tài)。在整形美容領(lǐng)域，透明質(zhì)酸主 要用于填充面部凹陷、除皺、隆鼻、治療半側(cè)顏面部萎縮等方面。
[0003] 由于人體透明質(zhì)酸酶、自由基降解等原因，外援天然的透明質(zhì)酸在體內(nèi)維持存在 的時(shí)間短，限制了透明質(zhì)酸在皮下組織填充或皮膚修復(fù)、手術(shù)防粘連以及關(guān)節(jié)腔潤(rùn)滑等方 面的應(yīng)用。因此，國(guó)內(nèi)外一些公司研究通過(guò)改進(jìn)不同的加工工藝來(lái)提高透明質(zhì)酸在人體內(nèi) 降解周期。
[0004] 透明質(zhì)酸在體內(nèi)的降解周期受到材料本身和體內(nèi)微環(huán)境的影響，而本身主要受到 材料組成和加工工藝影響。最近一些年，國(guó)外一些公司使用交聯(lián)劑，例如1，4-丁二醇縮水 甘油醚（BDDE)，制造的交聯(lián)透明質(zhì)酸被應(yīng)用于軟組織填充，在體內(nèi)降解周期只有達(dá)到6到 12個(gè)月的時(shí)間，整形美容患者需要連續(xù)注射兩次才可以達(dá)到預(yù)期效果。很顯然，這樣快的降 解周期滿足不了人們對(duì)于更長(zhǎng)降解周期透明質(zhì)酸產(chǎn)品的需求。
[0005] 大家知道，透明質(zhì)酸注射前必須滅菌，透明質(zhì)酸凝膠在110°C以上加熱處理或者輻 照處理后，穩(wěn)定性不好，滅菌后的彈性模量G'顯著降低，降解加快，會(huì)影響其被植入體內(nèi)后 填充效果。一些專利講到透明質(zhì)酸與維生素C或其衍生物的應(yīng)用，專利W0 2012/104419提 示可以通過(guò)添加一定量的維生素C及其衍生物到含有鎮(zhèn)靜劑的透明質(zhì)酸，可以提高透明質(zhì) 酸的熱穩(wěn)定性，使得滅菌后彈性模量G'的變化不大。但是，該專利又指出單獨(dú)添加維生素 C及其衍生物對(duì)透明質(zhì)酸材料的穩(wěn)定性沒(méi)有作用或者作用不顯著。專利US2014/0088037 也顯示添加維生素C磷酸酯鎂（MAP)HA的彈性模量G'滅菌后保持不變或者提高5-400Pa。 但專利的產(chǎn)品存在大小不一的透明質(zhì)酸顆粒，通過(guò)增大顆粒來(lái)維持降解周期的。透明質(zhì)酸 顆粒較大時(shí)，雖然對(duì)穩(wěn)定有幫助，但是大顆粒常常不柔軟，植入時(shí)非常困難，而且植入人體 后往往伴有脹痛和不舒適感的產(chǎn)生。瑞典公司Q-MED AB公司生產(chǎn)透明質(zhì)酸產(chǎn)品一瑞藍(lán) 2 被臨床應(yīng)用多年，將近150萬(wàn)人次使用過(guò)，顯示安全、有效。但是，臨床也反 映，由于該產(chǎn)品含有大小不均一的凝膠顆粒，柔軟度不高，植入體后會(huì)有脹痛等不舒適感而 且體內(nèi)降解周期太短，半年內(nèi)往往需要二次注射。美國(guó)專利No. 2011/0171286提到，添加維 生素B、維生素C、微生素E中至少一個(gè)的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠表現(xiàn)出比不含添加物的交聯(lián)透 明質(zhì)酸凝膠有更大的穩(wěn)定性。該專利產(chǎn)品成凝膠狀態(tài)，雖然延展性好，但是可塑形較差，影 響了在整形方面應(yīng)用。
[0006] 因此，本發(fā)明提供一種制備降解周期更長(zhǎng)、可塑性強(qiáng)、穩(wěn)定性好且柔軟度高的無(wú)菌 可注射材料的方法，來(lái)解決上述存在的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種無(wú)菌可注射材料制備方法。
[0008] 透明質(zhì)酸凝膠是指由交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠和自由透明質(zhì)酸組成的混合物。交聯(lián)透明 質(zhì)酸凝膠是指用交聯(lián)劑交聯(lián)透明質(zhì)酸形成的凝膠。自由透明質(zhì)酸溶液是指透明質(zhì)酸干粉溶 解于中性生理性等滲磷酸緩沖液或水中形成的溶液，不含交聯(lián)劑。中性生理性等滲磷酸緩 沖液是指由Na2HP04、NaH2P04和NaCl組成或Na2HP04、KH2P04和NaCl組成構(gòu)成的pH值為 6. 5-7. 5、滲透壓為280-320m0sm〇l/L溶液。交聯(lián)度是指透明質(zhì)酸雙糖單體結(jié)合一個(gè)交聯(lián)劑 分子的百分比，用透明質(zhì)酸單體與交聯(lián)劑的摩爾比計(jì)算。
[0009] 將平均分子量在1. OMDa-4. OMDa的稱為高分子量透明質(zhì)酸，將0. 2MDa-0. 99MDa的 稱為低分子量透明質(zhì)酸。高分子量透明質(zhì)酸對(duì)延長(zhǎng)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠降解周期很重要，低 分子量對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠柔軟度很重要，選擇合適的比例，對(duì)于產(chǎn)品的長(zhǎng)效性、柔軟度很 關(guān)鍵。
[0010] 一種制備無(wú)菌可注射材料的方法，步驟包括：
[0011] 第一步，提供交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠：將高分子量透明質(zhì)酸和低分子量透明質(zhì)酸干粉 至少3:1(W/W)的比例溶解形成水溶液，堿性條件下漸進(jìn)添加雙功能或多功能的交聯(lián)劑，添 加總濃度范圍是0. 005-0. 05mol/L。然后外力作用下使透明質(zhì)酸分子垂直方向、水平方向 間歇交錯(cuò)交聯(lián)，隔一段時(shí)間交錯(cuò)進(jìn)行一次。接著低溫自由平衡溶脹分離除去多余的自由交 聯(lián)劑殘，交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中自由交聯(lián)劑的殘留量小于lppm。交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)度 是2. 5% -15%，也可以是3% -12%，或者5% -10%，當(dāng)然，其他適宜的交聯(lián)度只要滿足要 求也是可以的。雙功能或多功能的交聯(lián)劑，比如可以是1，4-丁二醇縮水甘油醚、乙二醇而 縮水甘油釀、1 _乙基_3_ (3-二甲氨基-丙基）-碳二亞胺、二乙烯基諷、聚乙二醇、1，3-二 環(huán)氧丁烷、N-羥基琥珀酰亞胺、1，2, 7, 8-二環(huán)氧辛烷其中的一種或多種。
[0012] 第二步，將第一步形成的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠低溫均質(zhì)，形成均一微粒。所謂的低溫 范圍是不高于8°C。可以是液氮溫度，也可以在-20-10°C或者-12-8°C，也可以是-4-6°C或 者0-4°C。低溫條件可以保證交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠和透明質(zhì)酸分子在均質(zhì)過(guò)程沒(méi)有受到或者 受到的熱所引起不利影響非常小，同時(shí)也可以改變其形態(tài)。低溫后可以采用研磨均質(zhì)、粉碎 均質(zhì)、切割均質(zhì)，或者其他適宜的低溫均質(zhì)方式得到均一的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠微粒，當(dāng)然， 均質(zhì)的方式不局限以上幾種，其他適宜的均質(zhì)方式只要滿足要求也是可以的。根據(jù)需要， 可以將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠均質(zhì)成能通過(guò)27G-32G的注射針的均一顆粒，粒徑大小的范圍是 40-300 y m，也可以是60-200 y m或者80-120 y m。這樣的粒徑，可以保證注射時(shí)阻力小且柔 軟度高，又可以保證可塑性強(qiáng)，易于塑形，且能保證合適的降解周期。
[0013] 第三步是將高分子量透明質(zhì)酸干粉溶解于中性生理性等滲磷酸緩沖液中形 成自由透明質(zhì)酸溶液，然后添加水溶性維生素，比如水溶性維生素B、維生素C或維生 素E的衍生物中的一種或多種，添加濃度是0. 01-50mg/ml，也可以是0. l-30mg/ml或者 0.5-20mg/ml。維生素B的衍生物可以硫是辛酸。維生素C衍生物可以是維生素C糖苷 (Ascorbyl-2-glucoside)，比如選用AA2G?。維生素C衍生物可以是維生素C磷酸酯鹽，比 如維生素C磷酸酯鎂、維生素C磷酸酯鈉、維生素C磷酸酯鈣。水溶性維生素E衍生物可以 是TPGS，一種叫做天然水溶性維生素E。水溶性維生素的添加，不僅可以提高透明質(zhì)酸對(duì)熱 或者輻照的穩(wěn)定性，如彈性模量G'提高10-300Pa，而且還能起到美白、清除自由基等其他 功效，但是水溶性維生素濃度太高反而會(huì)產(chǎn)生其他不利結(jié)果。因此，本步驟必須衡量一個(gè)平 衡點(diǎn)，將預(yù)期想要的和預(yù)期避免的結(jié)果保留在一個(gè)可接受的范圍，而且這個(gè)范圍符合相關(guān) 安全要求。將制備的自由透明質(zhì)酸溶液以1:49-3:7(W/W)比例添加至第二步獲得的產(chǎn)物 中，比例還可以是1:24-2:8 (W/W)，其他適宜的比例滿足要求也是可以的。接著，在不剪切透 明質(zhì)酸分子鏈的機(jī)械力作用下混勻，可以使用設(shè)備混勻或者用手進(jìn)行混勻。
[0014] 本步驟中，還可以添加右旋糖酐和/或利多卡因。右旋糖酐對(duì)植入部位的血液微 循環(huán)起到一定的幫助作用，對(duì)減少后遺癥會(huì)產(chǎn)生有利的幫助，右旋糖酐可以是高分子量右 旋糖酐、中分子量右旋糖酐、低分子量右旋糖酐、小分子量右旋糖酐中的一種或幾種，濃度 為1%-10% (W/W)之間。利多卡因的添加，可以在透明質(zhì)酸產(chǎn)品植入后一段時(shí)間提高使用 者的舒適度，減少疼痛感等癥狀。本發(fā)明推薦的利多卡因添加濃度為0.1 %-3% (W/W)，也 可以是0.3%-1% (W/W)，或其他適宜的濃度范圍。
[0015] 第四步是將第三步形成的產(chǎn)物進(jìn)行滅菌。滅菌方式可以是濕熱滅菌、環(huán)氧乙烷滅 菌、輻照滅菌其中一種或多種組合。濕熱滅菌可以是115-130°C、4-30min高壓滅菌。輻照 可以是x射線、0射線或y射線輻照滅菌。無(wú)論哪一種滅菌方式均不能影響可注射材料 的理化性能，例如降解周期、彈性模量G'、推擠力等性能。
[0016] 本發(fā)明提供的無(wú)菌可注射材料，濃度為15-35mg/ml，或者為18-30mg/ml，也可以 是20-27mg/ml或者22-25mg/ml，當(dāng)然，其他適宜的濃度滿足要求也是可以的。
[0017] 本方法制備的無(wú)菌注射材料，體內(nèi)降解周期至少在18個(gè)月以上，常常能保持 24-36個(gè)月，有的甚至36個(gè)月以上。無(wú)菌注射材料穩(wěn)定性好，可以在高溫加熱、輻照或者環(huán) 氧乙烷處理后，彈性模量G'有良好的維持效果。此外，無(wú)菌注射材料有優(yōu)良的可塑性與柔 軟度，制備工藝簡(jiǎn)單、易于產(chǎn)業(yè)化。
[0018] 本發(fā)明提供的無(wú)菌注射材料，可應(yīng)用于軟組織填充、修復(fù)以及外科手術(shù)醫(yī)療等。例 如，可以用于非醫(yī)療的提高皮膚的美觀度、填充或去除皺紋、隆鼻、隆胸，也可以用于醫(yī)療外 科手術(shù)用的防粘連和骨科關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑。 實(shí)施例
[0019] 實(shí)施例一：制備交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠
[0020] 取3g高分子量透明質(zhì)酸（1. OMDa)和lg低分子量透明質(zhì)酸（0. 4MDa)干粉溶解于 50ml、pH 8. 5水溶液，分兩次添加1，4- 丁二醇縮水甘油醚進(jìn)行交聯(lián)，1，4- 丁二醇縮水甘油 醚終濃度0.001M。交聯(lián)過(guò)程有兩次向下壓力、兩次左右水平的力各作用10分鐘。接著中性 生理性等滲磷酸緩沖液在4-8°C條件下溶脹至pH值為7. 2除去未交聯(lián)的交聯(lián)劑，交聯(lián)產(chǎn)物 的交聯(lián)度是2. 5%。在4-8°C均質(zhì)化，形成均一的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠微粒，然后分成四等份。
[0021] 實(shí)施例二：制備無(wú)菌可注射透明質(zhì)酸凝膠
[0022] 取0. 2g高分子量透明質(zhì)酸（1. 6MDa)溶解于5ml中性生理性等滲磷酸緩沖液形 成自由透明質(zhì)酸溶液，添加250mg維生素C磷酸酯鎂（MAP)。將制得溶液以1:49的比例添 加至實(shí)施例一產(chǎn)物的一份中，然后手動(dòng)攪拌混勻。130°C、4min濕熱滅菌。實(shí)施例二制得的 透明質(zhì)酸凝膠性能參數(shù)見(jiàn)表1，其中推擠力是通過(guò)一次性注射器帶30G的針頭、在推擠速度 10. 5mm/min條件下測(cè)定的。
[0023]表1.
[0