水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的應(yīng)用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，如增加水稻籽粒長度、寬度。對于詳細(xì)闡明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關(guān)的遺傳學(xué)和分子 生物學(xué)研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。當(dāng)前水 稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢正在逐漸減弱，而水稻 轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能發(fā)掘水稻進(jìn)一步增產(chǎn)的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學(xué)的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個有次序的、選擇性的基因表達(dá)過 程。而轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)的精確調(diào)控中起到了關(guān)鍵性的作用。
[0004] 近些年，有關(guān)籽粒大小性狀的分子遺傳調(diào)控機(jī)制研究，已取得了一定進(jìn)展，如：研 究者們利用QTL定位了一些籽粒大小相關(guān)基因，其中GS3編碼一個膜蛋白，是籽粒大小和器 官大小的負(fù)調(diào)控因子；張啟發(fā)等研究發(fā)現(xiàn)GS5編碼一個調(diào)節(jié)籽粒大小的絲氨酸羧肽酶，是 控制籽粒大小的正調(diào)節(jié)因子，過表達(dá)GS5可使水稻籽粒明顯變大；轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控籽粒大 小方面起著非常重要的作用，0sWRKY78可以調(diào)節(jié)水稻莖的伸長和種子的發(fā)育，0sWRKY78突 變體可以使莖桿變矮化影響籽粒發(fā)育；螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子能通過調(diào)控 外稃和內(nèi)稃細(xì)胞的長度影響谷粒的大?。籔GLl堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)異源二聚 體作為結(jié)合DNA的bHLH的抑制子過表達(dá)后可增加籽粒長度和重量。
[0005] VP64是4個VP16功能域基序融合在一起組成的，是一類增強(qiáng)子。VP16最早在動 物病毒基因中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到植物中，主要用于植物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究中。轉(zhuǎn) 錄因子在體內(nèi)的作用大體上可以分成兩種：一種為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，另一種為轉(zhuǎn)錄抑制子。當(dāng)轉(zhuǎn) 錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出 現(xiàn)更明顯的表型變化。
[0006] Homeoboxes (同源結(jié)構(gòu)域蛋白）HB家族轉(zhuǎn)錄因子在動物界首先在果蠅中，植物在 擬南芥中首次被發(fā)現(xiàn)。HB家族有300多個成員，參與了生物的生長發(fā)育多個方面。從結(jié)構(gòu) 上分析，Homeoboxes擁有DNA識別位點(diǎn)，包括TATA等一系列和DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。目前HB 家族轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250對種子大小形狀調(diào)控機(jī)制的研究及認(rèn)識很少，因此該轉(zhuǎn)錄因子 的研究在理論上為進(jìn)一步理解植物種子和器官發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理提供了新的線索；在實(shí) 踐上也將為作物高產(chǎn)育種提供理論基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白為 (VP16) 4-Linker-0s02g49250 ；
[0009] 其中，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其序列如SEQ ID No. 9所示，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 3所示；VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白；0s02g49250為水稻轉(zhuǎn) 錄因子 0s02g49250。
[0010] 所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替 換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0011] 其中，（VP16) 4 即 VP64,是由 4個 VP16 功能域基序（Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu)以Gly Ser兩個氨基酸間隔融合在一起組成的增強(qiáng)子，其序列如SEQ ID No. 10所示，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。
[0012] 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因，以及在嚴(yán)格條件下，可與該基因的核苷 酸序列雜交的核苷酸序列 ；其中，所述嚴(yán)格條件為65°C，在0.1XSSPE或0.1XSSC、0.1%SDS 的溶液中雜交并洗膜。
[0013] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。
[0014] 所述載體的構(gòu)建方法如下：
[0015] (1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s02g49250基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引 物對，其為正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAGGAGAAGGAGGAGA-3' 和反向引物 R : 5,-CAAGAAAGCTGGGTCGACCGACATGAACGCGAAATC-3，；
[0016] (2)以野生日本晴水稻總cDNA為模板，進(jìn)行PCR獲得0s02g49250全序列；
[0017] (3)將PCR產(chǎn)物克隆到連接pDONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列；
[0018] (4)以雙元表達(dá)載體左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubi promoter-VP64_Gateway 表達(dá)單兀、35S promoter-asRED 表達(dá)單兀和 35S promoter-hyg 表 達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示；
[0019] (5)通過LR反應(yīng)將0s02g49250構(gòu)建到其目地基因的N端融合了 VP64標(biāo)簽的植 物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED上，獲得載體ubi :VP64-0s02g49250,載體全序列如SEQ ID No. 6所示。
[0020] 攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998， Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁； Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0021] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0022] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，具體為，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法， 將前述載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0023] 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性狀(如增加水稻粒長、 粒寬及千粒重）中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的引物對，其為 5,-CAAGAAAGCTGGGTCGAC CGACATGAACGCGAAATC-3,。
[0025] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因在調(diào)控水稻籽粒性狀中的應(yīng) 用。
[0026] 前述的應(yīng)用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu) 建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。
[0027] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻 轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到水稻中，從而改良水稻 籽粒性狀，如水稻籽粒長度和寬度增加。對于詳細(xì)闡明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論 價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ubi :VP64-0s02g49250載體圖譜。
[0030] 圖3為本發(fā)明Western blot檢測VP64-0s02g49250轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 為 VP64-0s02g49250 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0031] 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料籽粒性狀的表型長度的比較，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 為轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0032] 圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料籽粒性狀的表型寬度的比較，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 為轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0033] 圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料籽粒性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 為轉(zhuǎn)基因水稻株系。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 實(shí)施例10s02g49250基因的分離和植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0036] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s02g49250基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物， 根據(jù)其序列設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引物（Fl :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAGGAGAAGGAGGAGA-3' 和 總cDNA為模板，進(jìn)行PCR獲得0s02g49250全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0037] 按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。此過程中包含兩輪 PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物（Fl和R1)，而第二輪 的模板用第一輪的PCR產(chǎn)物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5' adaptor : 5'-GTGGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。將 PCR 產(chǎn)物克隆到連接 pDONER 克隆載體(購自 Invitrogen) 上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。通過LR反應(yīng)將0s02g49250構(gòu) 建到nVP64-hyg-asRED (圖1，載體全序列如SEQ ID No. 5所示）上，獲得載體ubi : VP64-0s02g49250 (圖 2,載體全序列如 SEQ ID No. 6 所示）。
[0038] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0039] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ubi :VP64-0s02g49250轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的 乙酰丁香酮和〇. D.值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組織 置于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計(jì)算轉(zhuǎn)化所 獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長。
[0040] 其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0041] 共培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 2后加入植物 凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200μ8/ιΛ。
[0042] 篩選培養(yǎng)基配方為：Ν6大量+Β5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物 技術(shù)有限公司）。
[0043] 分化培養(yǎng)基配方為：MS無機(jī)+MS-B5微量+MS有機(jī)+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/ L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0044] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因陽性株系的鑒定
[0045] 為檢測ubi :VP64-0s02g49250基因在T2代轉(zhuǎn)基因水稻中的過表達(dá)情況，利用 VP64抗體對其在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行鑒定，經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電泳一免疫印記一免疫熒光 反應(yīng)，Western Blot鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株存在目的蛋白，而野生型未雜出條帶（圖3)。
[0046] 具體的Western Blot實(shí)驗(yàn)流程如下：
[0047] 將適量樣品放入液氮冰凍后研磨成粉末，加入適量上樣緩沖液混勻，12000rpm離 心10分鐘；取5 μ 1上清加樣，以90V電壓SDS-PAGE電泳30分鐘后，120V電泳60-90分鐘， 當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底端即可停止電泳；電泳后采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色液 對膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果；轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放入含5%的脫脂奶粉的PBST溶液中封閉 室溫封閉60分鐘或4°C過夜；室溫下一抗（VP64抗體）孵育1小時或4°C孵育過夜,然后用 PBST洗滌3次，每次5分鐘；室溫下二抗(羊抗兔，購自Abmart，貨號M21002S)孵育1小時， 然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；在膜上加入底物，進(jìn)行曝光。
[0048] 其中，VP64抗體是由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海）有限公司根據(jù)VP64的氨基酸序列 合成多肽作為特異抗原而制備的兔源多抗。
[0049] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析和考種分析
[0050] 將轉(zhuǎn)基因和野生型水稻種子進(jìn)行比較，從表型上可以明顯的看出，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材 料的籽粒明顯變長、變寬（圖4、圖5)。考種數(shù)據(jù)分析表明（圖6)，轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的長、寬均 顯著大于野生型水稻籽粒。
[0051] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為（％16)4-1^111?51-0802849250 ; 其中，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成；VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白； 0s02g49250為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250的氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 編碼權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述融合蛋白的基因。
4. 含有權(quán)利要求3所述基因的載體。
5. 含有權(quán)利要求3所述基因的工程菌。
6. -種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求 4所述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
7. 權(quán)利要求3所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
8. 用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的引物對，其為正向引物F : 5'-CAAAAAAGCAGGCTTC ATGGAGGAGGAGAAGGAG GAGA-3' 和反向引物 R:5'-CAAGAAAGCTGGGTC GACCGACAT GAACGCGAAATC-3,。
9. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因在調(diào)控水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g49250基因的 ⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良 轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。
【文檔編號】A01H5/00GK104211813SQ201310217962
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月3日
【發(fā)明者】趙濤, 張春雨, 劉斌, 李宏宇, 劉軍, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所