專利名稱：紅苞半蒴苣苔的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅苞半蒴苣苔的繁殖方法。
背景技術(shù)：
全世界苦苣苔科(Gesneriaceae)植物約有150屬3700余種，分布于亞洲東部和南部、非洲、歐洲南部、大洋洲、南美洲至墨西哥的熱帶至溫帶地區(qū)。我國現(xiàn)已知的有58屬463種(27屬特產(chǎn)于中國)，均屬苦苣苔亞科，絕大部分種類具有較高的觀賞價(jià)值，其中藥用植物約100多種，且有相當(dāng)一部分為瀕危植物。半蒴苣苔屬為中國特有屬，共24種，5個(gè)變種，其中貴州半蒴苣苔(Hemiboeacavaleriei)、蛾眉半蒴苣苔(Hemiboea omeiensis)、半蒴苣苔(Hemiboea subcapitata)、短莖半蒴苣苔(Hemiboea subacaulis)、華南半蒴苣苔(Hemiboea follicularis)等均為民間傳統(tǒng)草藥，但由于分布范圍狹窄、對環(huán)境條件要求較高、生境惡劣，致使種群數(shù)量過少，而在自然狀態(tài)下該屬植物常籍匍匐枝行營養(yǎng)繁殖，增殖速度較慢。紅荀半蒴苣苔(Hemiboea rubribracteata)是2004年發(fā)表的苦苣苔科半蒴苣苔屬的新種，為多年生草本或半灌木，花和紅色總苞美麗，供觀賞。目前僅在廣西靖西發(fā)現(xiàn)一個(gè)分布點(diǎn)，生于石灰?guī)r山地峽谷疏林中潮濕巖石上，數(shù)量稀少，個(gè)體總數(shù)不及60株，急需保護(hù)。因此，如何妥善保存稀有 的種植資源成為一個(gè)需要迫切解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅苞半蒴苣苔的繁殖方法。本發(fā)明提供的紅苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步驟:(I)將紅苞半蒴苣苔的葉片滅菌后切塊，即為外植體；(2)將步驟(I)得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20-280C (如23 ± I °C -25 ± I °C、25±1 V -27±1 °C、23±1 °C、25±1 V 或 27±1 °C)、光強(qiáng)為 20 μ mol.πΓ2.s_1 以下(如10-20 μ mol.πΓ2.s-1、10 μ mol.πΓ2.s-1、20 μ mol.πΓ2.s_1 或黑暗)的條件下培養(yǎng)，獲得不
定芽；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.0 ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的濃度為20-30g.Γ1 (如 20g.Γ1 或 30g.Γ1)、KT 的濃度為 0.1-1.0mg.L-1 (如 0.1-0.2mg.L'0.2-0.5mg.L \θ.5-1.0mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L \0.5mg.L 1 或 1.0mg.L 0、IBA 的濃度為 0.1-0.5mg.L 1 (如 0.1-0.2mg.L \θ.2-0.3mg.L \θ.3-0.5mg.L \0.1mg.L \0.2mg.L \0.3mg.L 1 或 0.5mg.L1);(3)將步驟(2)得到的不定芽轉(zhuǎn)接至繁殖培養(yǎng)基，20-28°C (如23±1°C _25±1°C、25±1°C -27±1°〇、23±11:、25±11:或27±1°0光照培養(yǎng)，獲得叢生芽；所述繁殖培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.0 ；所述繁殖培養(yǎng)基是在MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的濃度為20-30g.Γ1 (如 20g.Γ1 或 30g.Γ1)、KT 的濃度為 0.1-1.0mg.L-1 (如 0.1-0.2mg.L'0.2-0.5mg.L \θ.5-1.0mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L \0.5mg.L 1 或 1.0mg.L 1)> NAA 的濃度為 0.1-0.5mg.L 1 (如 0.1-0.2mg.L \θ.2-0.3mg.L \θ.3-0.5mg.L \0.1mg.L \0.2mg.L \0.3mg.L 1 或 0.5mg.L1);(4)將步驟(3)得到的叢生芽切分后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，20-28 °C (如23±1°C -25±1°C、25±1°C _27± 1°C、23± 1°C、25± 1°C或 27± 1°C )光照培養(yǎng)至生根；所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.0 ；所述生根培養(yǎng)基為培養(yǎng)基甲或培養(yǎng)基乙；所述培養(yǎng)基甲的制備方法:在1/2MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖和IBA，蔗糖的濃度為20_30g.L 1 (如 20g.L 1 或 30g.L O、IBA 的濃度為 0.1-0.5mg.L 1 (如 0.1-0.2mg.L \0.2-0.5mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L 1 或 0.5mg.L1);所述培養(yǎng)基乙的制備方法:在1/2MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖、IBA和活性炭，蔗糖的濃度為 20-30g.I71 (如 20g.I71 或 30g.I71)、IBA 的濃度為 0.1-0.5mg.I71 (如
0.1-0.2mg.L \θ.2-0.5mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L 1 或 0.5mg.L 0、活性炭的濃度為 0.1-0.5g/100mL (如 0.1-0.2g/100mL、0.2-0.5g/100mL、0.lg/100mL、0.2g/100mL 或
0.5g/100mL)。 所述步驟(I)中:將紅苞半蒴苣苔的葉片滅菌后切成0.5-0.8cm2大小，即為外植體；所述步驟(I)中所述滅菌的方法為:用質(zhì)量百分含量為0.1%的HgCl2水溶液侵泡
1.5-2.5分鐘(如1.5-2分鐘、2-2.5分鐘、1.5分鐘、2分鐘或2.5分鐘)。所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為30-50天(如30-40天、40-45天、45-50天、40天、45天、50天或30天)。所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)為光照培養(yǎng)，每天的光照時(shí)間為12-14小時(shí)。所述步驟(3)中，所述光照培養(yǎng)的光強(qiáng)為50-80 μ mol.m_2.s—1 (如50-60 μ mol.m 2.s \60~80 μ mol.m 2.s \50 μ mol.m 2.s \60 μ mol.m 2.s 1 或80 μ mol.πΓ2.s4),每天的光照時(shí)間為14小時(shí)。所述步驟(3)中，每30-45天繼代一次，每個(gè)繼代周期增殖3.6-4.3倍(如3.6-3.9倍、3.9-4.3 倍、3.6 倍、3.9 倍或 4.3 倍)。所述步驟(3)中，所述光照培養(yǎng)的時(shí)間為30-45天。所述步驟(4)中，所述光照培養(yǎng)的光強(qiáng)為50-80 μ mol.m_2.s—1 (如50-60 μ mol.m 2.s \60~80 μ mol.m 2.s \50 μ mol.m 2.s \60 μ mol.m 2.s 1 或80 μ mol.πΓ2.s4),每天的光照時(shí)間為14小時(shí)。所述步驟(4)中，所述光照培養(yǎng)的時(shí)間為30天。所述方法還包括將步驟(4)得到的生根的幼苗移栽至培養(yǎng)基質(zhì)并培養(yǎng)，獲得栽培苗的步驟；所述培養(yǎng)基質(zhì)由1-2質(zhì)量份石灰石、2-5質(zhì)量份蛭石和1-2質(zhì)量份河沙混合得至IJ。所述培養(yǎng)的時(shí)間可為20-30天。所述培養(yǎng)的條件為:濕潤、遮陰的環(huán)境。外植體處理是影響外植體存活的重要因素，由于紅苞半蒴苣苔葉片略為革質(zhì)，單薄，兩面無毛或僅脈上疏生短柔毛，在滅菌處理過程中要格外注意時(shí)間控制，避免過分殺菌而導(dǎo)致外植體死亡。
本發(fā)明的方法中所用培養(yǎng)基均以MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，附加不同劑量的活性炭和激素類物質(zhì)(KT、NAA和IBA)。MS為國際通用的培養(yǎng)基。1/2MS培養(yǎng)基于MS培養(yǎng)基的差別僅在于大量兀素和微量兀素減半。本發(fā)明通過摸索一系列合理的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了使紅苞半蒴苣苔有效繁殖的目的，可有目的地誘導(dǎo)外植體細(xì)胞不定芽的形成、叢生芽繁殖體系的建立以及生根。利用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行快速繁殖，試管苗的繁殖速度是以幾何級數(shù)增殖的，本發(fā)明從外植體的誘導(dǎo)到獲得栽培苗只需要130天，試管苗移栽成活率可達(dá)90%以上。本發(fā)明開辟了一條人工快速繁殖紅苞半蒴苣苔的途徑，使紅苞半蒴苣苔的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)成為可能，從而為今后進(jìn)一步保護(hù)和利用該物種奠定了良好的基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。KT即激動素。IBA即3-吲哚丁酸。NAA即α-萘乙酸。紅荀半蒴苣苔(Hemiboea rubribracteata):李振宇，劉演.廣西半蒴苣苔屬(苦苣苔科)一新種——紅苞半蒴苣苔.植物分類學(xué)報(bào)，2004, 42 (6): 537-540.。MS培養(yǎng)基的組成見表I。

表IMS培養(yǎng)基的組成
權(quán)利要求
1.紅苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步驟: (1)將紅苞半蒴苣苔的葉片滅菌后切塊，即為外植體； (2)將步驟(I)得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20-28°C、光強(qiáng)為20μπιο1.πΓ2 s—1以下的條件下培養(yǎng)，獲得不定芽； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5.8-6.0 ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的濃度為20-30g.L-1、KT的濃度為0.1-1.0mg.L-1、IBA的濃度為0.1-0.5mg.L 1 ； (3)將步驟(2)得到的不定芽轉(zhuǎn)接至繁殖培養(yǎng)基，20-28°C光照培養(yǎng)，獲得叢生芽； 所述繁殖培養(yǎng)基的PH值為5.8-6.0 ;所述繁殖培養(yǎng)基是在MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的濃度為20-30g.L' KT的濃度為0.1-1.0mg.L' NAA的濃度為0.1-0.5mg.L 1 ； (4)將步驟(3)得到的叢生芽切分后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，20-28°C光照培養(yǎng)至生根； 所述生根培養(yǎng)基的PH值為5.8-6.0 ;所述生根培養(yǎng)基為培養(yǎng)基甲或培養(yǎng)基乙； 所述培養(yǎng)基甲的制備方法:在1/2MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖和IBA，蔗糖的濃度為20-30g.L' IBA 的濃度為 0.1-0.5mg.Γ1 ； 所述培養(yǎng)基乙的制備方法:在1/2MS固體培養(yǎng)基中加入蔗糖、IBA和活性炭，蔗糖的濃度為20-30g.L' IBA的濃度為 0.1-0.5mg.L'活性炭的濃度為0.1-0.5g/100mL。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中所述滅菌的方法為:用質(zhì)量百分含量為0.1%的HgCl2水溶液侵泡1.5-2.5分鐘。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為30-50 天。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)為光照培養(yǎng)，每天的光照時(shí)間為12-14小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，所述光照培養(yǎng)的光強(qiáng)為50-80 μ mol.m_2.s_\每天的光照時(shí)間為14小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，每30-45天繼代一次，每個(gè)繼代周期增殖3.6-4.3倍。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，所述光照培養(yǎng)的時(shí)間為30-45天。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述光照培養(yǎng)的光強(qiáng)為50-80 μ mol.m_2.s_\每天的光照時(shí)間為14小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述光照培養(yǎng)的時(shí)間為30天。
10.如權(quán)利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于:所述方法還包括將步驟(4)得到的生根的幼苗移栽至培養(yǎng)基質(zhì)并培養(yǎng)，獲得栽培苗的步驟；所述培養(yǎng)基質(zhì)由1-2質(zhì)量份石灰石、2-5質(zhì)量份蛭石和1-2質(zhì)量份河沙混合得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅苞半蒴苣苔的繁殖方法。本發(fā)明提供的紅苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步驟(1)將紅苞半蒴苣苔的葉片滅菌后切塊，即為外植體；(2)將步驟(1)得到的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20-28℃、光強(qiáng)為20μmol·m-2·s-1以下的條件下培養(yǎng)，獲得不定芽；(3)將步驟(2)得到的不定芽轉(zhuǎn)接至繁殖培養(yǎng)基，20-28℃光照培養(yǎng)，獲得叢生芽；(4)將步驟(3)得到的叢生芽切分后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，20-28℃光照培養(yǎng)至生根。本發(fā)明開辟了一條人工快速繁殖紅苞半蒴苣苔的途徑，使紅苞半蒴苣苔的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)成為可能，從而為今后進(jìn)一步保護(hù)和利用該物種奠定了良好的基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H4/00GK103141390SQ20131007776
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者石雷, 賈蕙寧, 陳維倫, 郭東紅, 邢全, 李揚(yáng) 申請人:中國科學(xué)院植物研究所