專利名稱：旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的主要問(wèn)題之一，它所造成的損失為其它所有因環(huán)境脅迫造成損失的總和(Gaff D.F.Desiccation tolerant-flowering plants insouthern Africa.Science 1741033-1034.1971.)。現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物技術(shù)的進(jìn)展深化了對(duì)植物抗旱分子機(jī)制的研究，也引發(fā)了植物抗逆基因資源的爭(zhēng)奪戰(zhàn)。已知絕大多數(shù)植物(包括主要農(nóng)作物品種和模式植物)只能忍受輕微或中等程度的干旱脅迫，在失去過(guò)多水分后便不可逆地死亡，只有更蘇植物在干旱條件下能很快失去自身的大多數(shù)水分而不死亡，恢復(fù)水分供應(yīng)后就能很快恢復(fù)正常的生命活動(dòng)，因此是一種開發(fā)耐旱基因的極好的植物資源。已知被子植物中的更蘇植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亞?？嘬奶浦参镄糗奶?Boea hygrometrica)是第一種在中亞和東亞地區(qū)展開分子和生理水平系統(tǒng)研究的更蘇植物。該植物的葉片具有很強(qiáng)的耐旱復(fù)蘇能力，在室溫、相對(duì)空氣濕度為0的條件下實(shí)施干旱脅迫72小時(shí)，葉片相對(duì)含水量降至約3％，葉片皺縮至原葉面積的1/3以下，光合作用基本停止，只要重新給水，葉片就可以吸水伸展，并恢復(fù)成未處理前的葉片表觀狀態(tài)和生理狀態(tài)(包括光合作用的恢復(fù))(Deng X，Wang H，Hu Z，mRNA differential display Visualizedby silver staining tested on gene expression in resurrection plant Boeahygrometrica.Plant Moecular Biology Reporter 17279.1999；Deng X，Hu Z，Wang H.Wen X，Kuang T.A comparison of photosynthetic apparatus of the detached1eaves of the resurrection plant Boea hygrometrica with its non-tolerantrelative Chirita heterotrichia in response to dehydration and rehydration.Plant Science.165851-861.2003)。
滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物抵抗干旱脅迫的重要手段之一。脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖包括蔗糖和棉子糖系列寡糖等都是各種植物中常見(jiàn)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。尤其是可溶性糖類的積累已被證實(shí)與更蘇植物耐旱復(fù)蘇能力密切相關(guān)。雖然在眾多植物中都克隆到了與棉子糖系列寡糖合成相關(guān)酶的基因，但受干旱誘導(dǎo)的肌醇半乳糖苷合成酶基因僅在具有耐脫水能力的種子和一種南非土生的草本更蘇植物Xerophyta humilis中發(fā)現(xiàn)。研究表明，肌醇半乳糖苷合成酶催化下列反應(yīng)UDP-半乳糖+myo-肌醇→UDP+1-0-alpha-D-半乳糖基-D-myo-肌醇該反應(yīng)是植物細(xì)胞中棉子糖途徑的起點(diǎn)，也是其關(guān)鍵的限速步驟。通過(guò)基因工程手段，調(diào)節(jié)肌醇半乳糖苷合成酶基因的表達(dá)活性，可能獲得耐脫水、抗旱的植物新品系。該基因?qū)χ参锟鼓娣磻?yīng)的重要性及其在植物抗逆基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值已被廣泛認(rèn)識(shí)。美國(guó)、日本等多家國(guó)外生物公司均在其本國(guó)申請(qǐng)了發(fā)明專利。在我國(guó)，雖然利用抗逆基因培育作物、林草等的抗逆品系已成為抗逆植物育種的主要思路，但擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗逆資源基因還十分缺少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來(lái)源于旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的肌醇半乳糖苷合成酶基因，名稱為BhGOLS，來(lái)源于苦苣苔科旋蒴苣苔屬旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由1002個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1002位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明肌醇半乳糖苷合成酶基因所編碼的蛋白(BhGOLS)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐旱復(fù)蘇能力的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由334個(gè)氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增BhGOLS中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐旱性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐旱性的方法，是將所述旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到耐旱性提高的植物。
所述旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因可通過(guò)含有所述旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達(dá)載體。
使用BhGOLS構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明BhGOLS的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花等農(nóng)作物，還可以是苜蓿、三葉草、冰草等牧草以及草莓、西紅柿等果蔬花卉植物。
本發(fā)明所提供的旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因BhGOLS可調(diào)控植物的耐旱復(fù)蘇能力，從而顯著提高植物的耐旱性，該基因及其編碼蛋白對(duì)于培育耐旱的作物、林草新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為Northern雜交檢測(cè)BhGOLS的表達(dá)模式結(jié)果圖2為旋蒴苣苔葉片經(jīng)NaCl處理后喪失耐旱復(fù)蘇能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖3為Northern雜交法檢測(cè)具有耐旱復(fù)蘇能力的旋蒴苣苔葉片和經(jīng)NaCl處理后喪失耐旱復(fù)蘇能力的旋蒴苣苔葉片中的肌醇半乳糖苷合成酶基因在干旱誘導(dǎo)過(guò)程中表達(dá)水平的結(jié)果圖4為BhGOLS原核表達(dá)載體的物理圖譜圖5為過(guò)量表達(dá)BhGOLS基因的原核細(xì)胞的抗旱能力得到顯著提高的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實(shí)施例1、旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因BhGOLS的克隆提取經(jīng)干旱脅迫8小時(shí)的旋蒴苣苔葉片的總RNA，利用ZAP-cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。從中隨機(jī)挑選4800個(gè)基因，用BioGridrobot(BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)自動(dòng)化點(diǎn)樣在Hybond-N+尼龍膜(AmershamBiosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)上，制成cDNA微陣列(cDNA芯片)。將芯片與未經(jīng)干旱處理正常生長(zhǎng)的旋蒴苣苔葉片和經(jīng)干旱脅迫8小時(shí)的旋蒴苣苔葉片的polyA-RNA所制備的33P標(biāo)記的探針雜交，分析它們?cè)谡l件及干旱誘導(dǎo)后基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有14個(gè)干旱誘導(dǎo)上調(diào)的基因克隆編碼已知的肌醇半乳糖苷合成酶基因3’片段。選其中序列最長(zhǎng)的片段設(shè)計(jì)引物，利用5’-RACE法得到了該基因的全長(zhǎng)序列，具體方法如下所用引物序列為A-P-15’-ggccacgcgtcgactagtacgggggg-3’A-P-25’-ggccacgcgtcgactagtac-3’GSP-15’-GACGAACTAAAGCAGAGCTG-3’GSP-25’-AAGTGTAGTCCAGCGTTTCG-3’GSP-35’-CCTTCACCTCCTCCAGATTCACATT-3’1、合成第一鏈cDNA以經(jīng)干旱脅迫8小時(shí)的旋蒴苣苔葉片的總RNA為模板，反應(yīng)體系為總RNA1.5μl(5μg)、GSP-1引物(1μM)2μl、dNTP(2mM)5μl和EDPC-H2O 5.5μl，70℃加熱5Min，立即置于冰上，隨后加入如下試劑5×第一鏈緩沖液4μl，Inhibitor(20μ/μl)1μl，M-MLV(promega公司)1μl，再42℃溫育1h，加入1μl RNaseH于37℃溫育0.5h，然后95℃5min使酶失活后用鼎國(guó)公司的DNA回收純化柱純化。
2、cDNA的加尾(加C尾)1)加入下列物質(zhì)并輕輕混勻DEPC-H2O 6.5μl，5×tailing緩沖液5.0μl，2mM dCTP 2.5μl，步驟1純化的cDNA 10μl；2)在94℃下孵育3min，在冰上冷卻1min，瞬間離心后置于冰上；3)加入1μl TdT(promega公司)并輕輕混勻，在37℃下孵育60min；4)在65℃下孵育10min失活TdT，瞬間離心后存放于冰上。
3、加尾cDNA的PCR以步驟2加尾的cDNA為模板，按如下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)加尾的cDNA2μl，10×PCR緩沖液2μl，dNTP(2mM)2μl，GSP-2引物(10mM)0.8μl，A-P-1引物(10mM)0.8μl，H2O 12.25μl，Taq DNA聚合酶(TaKaRa)0.15μl。反應(yīng)條件為先94℃2min；然后94℃0.5min，55℃0.5min，72℃1.5min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。
4、巢式PCR擴(kuò)增按如下反應(yīng)體系進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增步驟3的PCR產(chǎn)物2μl，10×PCR緩沖液2μl，dNTPs(2mM)2μl，GSP-3引物(10mM)0.4μl，A-P-2引物(10mM)0.4μl，H2O12.9μl，Taq DNA聚合酶(TaKaRa)0.15μl；PCR反應(yīng)條件為先94℃4min，然后94℃0.5min，60℃0.5min，72℃1.5min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由1002個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1002位堿基，將該基因命名為BhGOLS，該基因編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中的SEQ ID №2由334個(gè)氨基酸殘基組成，將BhGOLS的所編碼蛋白命名為BhGOLS，推測(cè)分子量38.1kD，等電點(diǎn)5.41。與擬南芥、大豆、玉米和水稻等植物的肌醇半乳糖苷合成酶基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，同源性達(dá)70％。
實(shí)施例2、BhGOLS的表達(dá)模式分析實(shí)驗(yàn)分別提取未受干旱脅迫的、經(jīng)干旱脅迫2、8、24、72小時(shí)的及經(jīng)干旱脅迫72小時(shí)后重新給水8小時(shí)的旋蒴苣苔葉片的總RNA并測(cè)定濃度，取等量的各個(gè)樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，待經(jīng)嗅酚藍(lán)染色的樣品遷移到凝膠距點(diǎn)樣孔2/3處，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，在80℃下烤膜120分鐘，再將轉(zhuǎn)有上述RNA的尼龍膜放入雜交管中，經(jīng)65℃預(yù)雜交2.5h后，加入經(jīng)純化、變性的熒光素標(biāo)記的BhGOLS探針(序列表中SEQ ID №1中自5’端第585至1002堿基位核苷酸序列)，65℃雜交24小時(shí)，倒出雜交液，用2×SSC、0.1％SDS、0.1×SSC和0.1％SDS溶液在65℃下，各洗膜30min，最后用Gene Images CDP-Star Detection Module(Amersham Phamacia Biotech，Little Chalfont Buckinghamshire，UK)檢測(cè)雜交信號(hào)的位置和強(qiáng)度。結(jié)果如圖1所示，表明BhGOLS的mRNA在未受干旱脅迫的旋蒴苣苔葉片中檢測(cè)不到表達(dá)，經(jīng)干旱脅迫8-72小時(shí)后可誘導(dǎo)其大量表達(dá)。
實(shí)施例3、BhGOLS的細(xì)胞學(xué)定位利用PSORT計(jì)算機(jī)程序分析軟件(Nakai and Kanehisa，Expert system forpredicting protein localization sites in gram-negative bacteria.Proteins.11(2)95-110，1991)對(duì)BhGOLS所編碼的蛋白質(zhì)BhGOLS進(jìn)行細(xì)胞學(xué)定位，結(jié)果表明BhGOLS定位于旋蒴苣苔葉細(xì)胞的葉綠體中。
實(shí)施例4、BhGOLS的功能分析旋蒴苣苔葉片具有較強(qiáng)的耐旱復(fù)蘇能力，但經(jīng)0.2M NaCl處理9小時(shí)后葉片便喪失耐旱復(fù)蘇能力。實(shí)驗(yàn)分兩組，一組為NaCl處理組，對(duì)葉片進(jìn)行如下處理0.2M NaCl處理9小時(shí)；0.2M NaCl處理9小時(shí)后再進(jìn)行干旱脅迫72小時(shí)；0.2M NaCl處理9小時(shí)，再進(jìn)行干旱脅迫72小時(shí)后復(fù)水8小時(shí)。另一組為水處理組(對(duì)照)。結(jié)果如圖2所示，表明經(jīng)0.2M NaCl處理9小時(shí)后葉片喪失耐旱復(fù)蘇能力，初步推測(cè)是BhGOLS經(jīng)NaCl處理后，功能喪失所致。用下述實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證用Northern雜交的方法檢測(cè)具有耐旱復(fù)蘇能力的旋蒴苣苔葉片和經(jīng)0.2M NaCl處理9小時(shí)后喪失耐旱復(fù)蘇能力的旋蒴苣苔葉片中的肌醇半乳糖苷合成酶基因在干旱誘導(dǎo)過(guò)程中表達(dá)水平的變化。首先對(duì)待測(cè)植株分別做如下處理經(jīng)干旱脅迫8、24、72小時(shí)，0.2M NaCl處理9小時(shí)，0.2M NaCl處理9小時(shí)后干旱脅迫8小時(shí)，同時(shí)以未做處理和用水處理9小時(shí)的植株為對(duì)照；然后用Northern雜交的方法檢測(cè)上述植株中肌醇半乳糖苷合成酶基因的表達(dá)水平，所用探針與實(shí)施2相同，結(jié)果如圖3所示，BhGOLDS在經(jīng)干旱脅迫8小時(shí)后在有耐旱復(fù)蘇能力的旋蒴苣苔葉片組織中迅速響應(yīng)干旱信號(hào)的誘導(dǎo)而大量表達(dá)，但在用0.2M NaCl處理后而喪失耐旱復(fù)蘇能力的旋蒴苣苔葉片組織中不能響應(yīng)干旱信號(hào)的誘導(dǎo)，表明BhGOLS響應(yīng)干旱而誘導(dǎo)表達(dá)是旋蒴苣苔葉片表現(xiàn)出具有耐旱復(fù)蘇能力的必要條件，從而證明BhGOLS在調(diào)控旋蒴苣苔葉片耐旱復(fù)蘇能力的機(jī)制中起到重要作用。
實(shí)施例5、BhGOLS的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)先以經(jīng)干旱脅迫8小時(shí)的旋蒴苣苔葉片的總RNA為模板，由oligo-dT反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，再以此cDNA為模板，在引物5’-TGAATTCATGGCCCCGGAGATTG-3’和5’-ACTCGAGCCGTTGGAGGGGTG-3’的引導(dǎo)下，擴(kuò)增BhGOLS基因的全長(zhǎng)片段，將BhGOLS基因用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1(Pharmacia公司)連接，得到BhGOLS的原核表達(dá)載體，命名為pGEX-4T-1/BhGOLS，其物理圖譜如圖4所示，使BhGOLS與GST融合基因的表達(dá)受到IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子tac的調(diào)控。將構(gòu)建好的BhGOLS的原核表達(dá)載體和pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，接種于含50μg/mL氨芐青霉素的2mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h(150轉(zhuǎn)/min)后，按1∶100稀釋，再37℃振蕩培養(yǎng)1-2h，至OD600值為0.3-0.6后，誘導(dǎo)表達(dá)并檢測(cè)BhGOLS基因在原核細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)對(duì)原核細(xì)胞耐旱能力的影響，具體方法為收集5mL OD600值為0.3-0.6的菌液，離心(8000轉(zhuǎn)/min)1min，收集菌體，將沉淀分別重懸于分別含3.75％、7.5％、15％和30％不同濃度的PEG6000以及50μg/mL氨芐青霉素的5mL LB培養(yǎng)液中，同時(shí)加入終濃度為0.01mm/LIPTG開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，在37℃振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/min)，1小時(shí)后分別測(cè)OD600值，并收集1.5mL菌體，離心(4000轉(zhuǎn)/min)收集菌體，沉淀重懸于100μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液中，沸水10min，12000g離心10min，收集上清，每樣品上樣5μl，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明BhGOLS基因在原核細(xì)胞中得到了過(guò)量表達(dá)，其蛋白質(zhì)表達(dá)水平在0.01mm/L IPTG誘導(dǎo)下增加，同時(shí)相對(duì)于轉(zhuǎn)空載體的細(xì)菌，轉(zhuǎn)BhGOLS基因的細(xì)菌在3.75％、7.5％、15％PEG存在下的存活能力具有一定程度的提高，如圖5所示(以細(xì)菌在不含PEG但其它成分完全相同的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)相同時(shí)間的OD600值為對(duì)照(control)，存活率以百分?jǐn)?shù)表示)，而且在蛋白質(zhì)水平上，轉(zhuǎn)BhGOLS基因的細(xì)菌與對(duì)照相比，耐PEG的能力也得到提高。本實(shí)驗(yàn)在原核細(xì)胞表達(dá)體系中證明BhGOLS基因可提高細(xì)胞的耐旱能力。
序列表<160> 2<210> 1<211> 1002<212> DNA<213> 旋蒴苣苔屬旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)<400> 1atggccccgg agattgctaa cgccgccgtg agacaggcct cctccggcct atcgaaagca60ggcagcttgc agagtcgggc ttttgtcaca ttcttggctg gcgatggtga ctacgtgaaa120ggtgtcgtgg ggctggccaa ggggttgagg aaggtggatt cagtttatcc actggtggtg180gcggtcctgc ctgatgtccc ggctgagcac cgccgtattc tggtggagca aggctgcata240gtaagggaga tcgagcctgt ttatccaccg gagaaccaaa cccagttcgc gatggcttat300tacgtgatca actactccaa gcttcggatt tgggagtttg tggagtacag caagatgata360tacctggatg gtgatatcca ggtgttcgac aacatcgacc atttgttcga cctggaaaat420ggctactttt acgcagtaat ggactgtttc tgcgagaaaa catggagcca cacaacgcag480tataagattg ggtactgcca gcagtgcccc gagaaagtcc agtggccgaa acatgtgggc540cccaagccct ccctctactt caacgccggc atgtttgttt tcgagcccag tcttccgatt600tatcatgatc ttctgcatat actcaagatt acacctccga caccatttgc cgagcaggat660ttcctgaaca tgttctttaa ggacatttac cggccgatcc cgaacgtgta caacttagtg720ctggccatgc tgtggcgcca cccggagaat gtgaatctgg aggaggtgaa ggtggtgcac780tactgtgccg cagggtccaa gccctggagg tatacaggcc aagaggctaa catgcagaga840gaggacatca aaatgcttgt aaagaaatgg acagaaattt atgaagacga aacgctggac900tacactttcg actctgcagt gcaggcggtg ccagagaaac agctgacggc agtgctgacg960gacgccggtg gtgttcattt catcgccacc cctccaacggct1002<210> 2<211> 334<212> PRT<213> 旋蒴苣苔屬旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)
<400>2Met Ala Pro Glu Ile Ala Asn Ala Ala Val Arg Gln Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Leu Ser Lys Ala Gly Ser Leu Gln Ser Arg Ala Phe Val Thr Phe Leu20 25 30Ala Gly Asp Gly Asp Tyr Val Lys Gly Val Val Gly Leu Ala Lys Gly35 40 45Leu Arg Lys Val Asp Ser Val Tyr Pro Leu Val Val Ala Val Leu Pro50 55 60Asp Val Pro Ala Glu His Arg Arg Ile Leu Val Glu Gln Gly Cys Ile65 70 75 80Val Arg Glu Ile Glu Pro Val Tyr Pro Pro Glu Asn Gln Thr Gln Phe85 90 95Ala Met Ala Tyr Tyr Val Ile Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Ile Trp Glu100 105 110Phe Val Glu Tyr Ser Lys Met Ile Tyr Leu Asp Gly Asp Ile Gln Val115 120 125Phe Asp Asn I1e Asp His Leu Phe Asp Leu Glu Asn Gly Tyr Phe Tyr130 135 140Ala Val Met Asp Cys Phe Cys Glu Lys Thr Trp Ser His Thr Thr Gln145 150 155 160Tyr LysIle Gly Tyr Cys Gln Gln Cys Pro Glu Lys Val Gln Trp Pro165 170 175Lys His Val Gly Pro Lys Pro Ser Leu Tyr Phe Asn Ala Gly Met Phe180 185 190Val Phe Glu Pro Ser Leu Pro Ile Tyr His Asp Leu Leu His Ile Leu195 200 205Lys Ile Thr Pro Pro Thr Pro Phe Ala Glu Gln Asp Phe Leu Asn Met210 215 220Phe Phe Lys Asp Ile Tyr Arg ProIle Pro Asn Val Tyr Asn Leu Val225 230235 240
Leu Ala Met Leu Trp Arg His Pro Glu Asn Val Asn Leu Glu Glu Val245 250 255Lys Gly Val His Tyr Cys Ala Ala Gly Ser Lys Pro Trp Arg Tyr Thr260 265 270Gly Gln Glu Ala Asn Met Gln Arg Glu Asp Ile Lys Met Leu Val Lvs275 280 285Lys Trp Thr Glu Ile Tyr Glu Asp Glu Thr Leu Asp Tyr Thr Phe Asp290 295 300Ser Ala Val Gln Ala Val Pro Glu Lys Gln Leu Thr Ala Val Leu Thr305 310 315 320Asp Ala Gly Gly Val His Phe Ile Ala Thr Pro Pro Thr Ala325 330
權(quán)利要求
1.旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶病基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐旱復(fù)蘇能力的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3所述的旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1或2所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
6.一種提高植物耐旱性的方法，是將權(quán)利要求1所述的旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到耐旱性提高的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因通過(guò)含有所述旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述植物宿主為水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三葉草、冰草、草莓或西紅柿。
全文摘要
本發(fā)明公開了旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱性提高的植物中的應(yīng)用。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的旋蒴苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因可調(diào)控植物的耐旱復(fù)蘇能力，從而顯著提高植物的耐旱性，該基因及其編碼蛋白對(duì)于培育耐旱的作物、林草新品種具有重要的理論及實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1772904SQ200510112540
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者鄧馨, 馬克平, 王智, 王麗麗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所