一種脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物凍存液及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物凍存液，所述的凍存液中含有：0.2-0.8mol/L海藻糖；和10-40%促紅細(xì)胞生成素。本發(fā)明還公開了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法，并提示通過本發(fā)明提供的方法處理的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物經(jīng)過檢測其細(xì)胞存活率和活力都保持在較高的水平，且動物體內(nèi)回植實驗結(jié)果顯示經(jīng)該方法凍存的細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物仍能得到很好的修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
【專利說明】一種脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物凍存液及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物凍存液和脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)深低溫凍存要求精確的降溫速率控制，操作復(fù)雜，但仍無法避免在降溫過程中出現(xiàn)冰晶對細(xì)胞造成傷害。玻璃化凍存方法很好地解決了這個問題。在玻璃化過程中，物質(zhì)并不結(jié)晶，而是形成一種超冷凍液體，外觀接近固體，但仍保持著作為液體特征的分子無序性。細(xì)胞或組織在玻璃化過程中受到的損傷降到了最小。
[0003]脂肪來源干細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖及成骨能力，且采集時對病人造成的創(chuàng)傷較小，臨床應(yīng)用潛能較大。組織工程骨構(gòu)建技術(shù)與玻璃化凍存的結(jié)合為臨床應(yīng)用提供了更大的便利性和更多的選擇性。
[0004]因此本領(lǐng)域迫切需要提供簡便而有效地凍存以脂肪來源干細(xì)胞為種子細(xì)胞的種子細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的凍存液。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種如上述的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的凍存液的用途。
[0007]本發(fā)明的再一個目的是提供一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物凍存液，所述的凍存液中含有:0.2-0.8mol/L海藻糖；和10-40m/v%促紅細(xì)胞生成素。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的凍存液中含有:0.4-0.8mol/L海藻糖；和20_38m/V%促紅細(xì)胞生成素。
[0010]更佳地，所述的凍存液中含有:0.6-0.8mol/L海藻糖；和25_35m/V%促紅細(xì)胞生成素。
[0011 ] 在另一優(yōu)選例中，所述凍存液含有余量的無血清DMEM培養(yǎng)液。
[0012]最佳地，所述凍存液含有0.8mol/L海藻糖，30m/v%促紅細(xì)胞生成素和余量的無血清DMEM培養(yǎng)液。
[0013]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的凍存液的用途，所述的凍存液可用于保存脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物。
[0014]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法，所述的方法包括步驟:
[0015](I)將脂肪干細(xì)胞接種脫鈣骨，使用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0016](2)將步驟(1)得到的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物和如上所述的本發(fā)明提供的凍存液混合；和[0017](3)將與凍存液混合的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物在液氮中凍存，得到冷凍保存的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:
[0019](4)將冷凍保存的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物在40 - 80°C水浴復(fù)溫。
[0020]更佳地，復(fù)溫3 — 8天，最佳地為4 — 6天。
[0021]據(jù)此，本發(fā)明提供了簡便而有效地凍存以脂肪來源干細(xì)胞為種子細(xì)胞的種子細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1顯示了不同組分凍存液凍存后細(xì)胞存活率變化。
[0023]圖2顯示了不同組分凍存液凍存后堿性磷酸酶活性變化。
[0024]圖3顯示了不同組分凍存液凍存后骨鈣素分泌變化。
[0025]圖4顯示了 Design -expert (軟件名稱,用于實驗設(shè)計,為本領(lǐng)域并不限于本領(lǐng)域的公認(rèn)頂級實驗設(shè)計軟件，美國Stat-Ease，Inc公司產(chǎn)品)運(yùn)行多響應(yīng)優(yōu)化結(jié)果，即分類因素水平的16個組合的結(jié)果。
[0026]圖5顯示了復(fù)蘇后細(xì)胞生長曲線。
[0027]圖6顯示了復(fù)蘇后堿性磷酸酶活性。
[0028]圖7顯示了凍存與未凍存的細(xì)胞-支架復(fù)合物對骨修復(fù)效果相同。
【具體實施方式】
[0029]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的冷凍保存液，它可以長久而有效地保持脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物中脂肪干細(xì)胞的存活率、及其細(xì)胞功能。另外，發(fā)明人針對多個優(yōu)化目標(biāo)，采用期望函數(shù)(The desirabilityfunction)的多響應(yīng)優(yōu)化方法，將每個響應(yīng)轉(zhuǎn)換成期望函數(shù)，并求得期望函數(shù)的幾何平均值即為最終的響應(yīng)目標(biāo)。
[0030]具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以將脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物和含有海藻糖和促紅細(xì)胞生成素的溶液混合后，進(jìn)行凍存。
[0031]如本文所用，“促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin; erythrogenin;ΕΡ0) ”是指在哺乳動物腎臟和肝臟產(chǎn)生的一種分子質(zhì)量為46kDa的糖蛋白細(xì)胞因子；能刺激幼稚紅細(xì)胞的增生，血紅蛋白化和紅細(xì)胞的成熟。
[0032]如本文所用，“脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells,ADSCs) ”是指從脂肪組織中得到的具有增殖分化能力的干細(xì)胞。更佳地，指同時具有多向分化能力的脂肪干細(xì)胞。
[0033]所述脂肪干細(xì)胞可以來自同種同體、同種異體、異種異體，優(yōu)選來自同種的脂肪干細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選人脂肪干細(xì)胞。
[0034]可以使用本領(lǐng)域熟知的方法獲得脂肪干細(xì)胞，例如但不限于，所述的方法包括步驟:a、人脂肪抽吸物用I型膠原酶消化；b、離心棄上清，有核細(xì)胞接種；和c、加入DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)、傳代。
[0035]如本文所用，“醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料”、“支架材料”、或“生物材料”可以互換使用，包括(但并不限于):[0036](a)人工合成的高分子可降解性材料，例如聚α _羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸 PGA、聚羥基丁酸 PHB 等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿燒(poIyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙燒、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；
[0037](b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan, GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸|丐凝膠等；各種脫細(xì)胞基質(zhì)；
[0038](C)上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料。
[0039]如本文所用，“成骨誘導(dǎo)”是指體外培養(yǎng)的ADSCs在成骨誘導(dǎo)條件下，表達(dá)成骨細(xì)胞表型。
[0040]本發(fā)明所用術(shù)語“成骨細(xì)胞”和“骨細(xì)胞”可互換使用。
[0041]如本文所用，“m/v”或“m/v%”是指質(zhì)量體積比，單位可以是克/100ml。
[0042]凍存液
[0043]本發(fā)明提供的脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的凍存液中含有海藻糖和促紅細(xì)胞生成素，優(yōu)選含有余量的無血清DMEM培養(yǎng)液。
[0044]所述凍存液中海藻糖的濃度為0.2-0.8mol/L，促紅細(xì)胞生成素的濃度為10_40% ；優(yōu)選海藻糖的濃度為0.4-0.8mol/L，促紅細(xì)胞生成素的濃度為20-38m/v% ;更優(yōu)選海藻糖的濃度為0.6-0.8mol/L，促紅細(xì)胞生成素的濃度為25-35m/v% ;最優(yōu)選海藻糖的濃度為
0.8mol/L，促紅細(xì)胞生成素的濃度為30m/v%。其中的體積百分比是以凍存液的總體積計。
[0045]脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的凍存和復(fù)蘇
[0046]可以使用本領(lǐng)域熟知的方法獲得脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物，例如但不限于，將傳代脂肪干細(xì)胞接種于生物材料上，然后使用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0047]本發(fā)明中ADSCs-生物材料復(fù)合物的細(xì)胞接種濃度通常約為2X IOVml至7X IO7/ml或更高。材料優(yōu)選固體性材料，以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時培養(yǎng)液與固體性材料的比例沒有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養(yǎng)液的最大量為準(zhǔn)。
[0048]所述的成骨誘導(dǎo)液是本領(lǐng)域中熟知的。優(yōu)選在培養(yǎng)液中加入地塞米松、維生素D3與β_磷酸甘油。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于):1)F-12培養(yǎng)基+10%胎牛血清；2)F-12培養(yǎng)基+20%小牛血清；3)F-12培養(yǎng)基+10-20%自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長因子、各種轉(zhuǎn)基因成分和各種細(xì)胞成分。
[0049]將經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物(為脂肪干細(xì)胞與誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞并存)浸入本發(fā)明提供的凍存液中(浸沒)，在冰上孵育10 - 20分鐘后直接投入液氮凍存，得到冷凍保存的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物。 [0050]將冷凍保存的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物在40 - 800C (優(yōu)選50 — 70°C )快速融化使
其復(fù)蘇。
[0051]本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0052]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0053]1、本發(fā)明提供的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物凍存液可以使凍存的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物中的細(xì)胞存活率高。
[0054]2、本發(fā)明提供的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物凍存液可以使凍存的細(xì)胞-生物材料復(fù)合物中的細(xì)胞活力高。
[0055]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。
[0056]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0057]本發(fā)明實施例中的主要物質(zhì)的來源為:
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物凍存液，其特征在于，所述的凍存液中含有: 0.2-0.8mol/L 海藻糖；和 10-40m/v%促紅細(xì)胞生成素。
2.如權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述的凍存液中含有: 0.4-0.8mol/L 海藻糖；和 20-38m/v%促紅細(xì)胞生成素。
3.如權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述的凍存液中含有: 0.6-0.8mol/L 海藻糖；和 25-35m/v%促紅細(xì)胞生成素。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的凍存液，其特征在于，所述凍存液含有余量的無血清DMHM培養(yǎng)液。
5.如權(quán)利要求4所述的凍存液，其特征在于，所述凍存液含有0.8mol/L海藻糖，30m/v%促紅細(xì)胞生成素和余量的無血清DMEM培養(yǎng)液。
6.—種如權(quán)利 要求1-5任一所述的凍存液的用途,其特征在于,所述的凍存液可用于保存脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物。
7.一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法，其特征在于，所述的方法包括步驟: (1)將脂肪干細(xì)胞接種脫鈣骨，使用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)； (2)將步驟(1)得到的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物和如權(quán)利要求1-5任一所述的凍存液混合；和 (3)將與凍存液混合的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物在液氮中凍存，得到冷凍保存的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟: (4)將冷凍保存的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物在40- 80°C水浴復(fù)溫。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，復(fù)溫3— 8天；優(yōu)選4 一 6天。
【文檔編號】A01N1/02GK104012519SQ201310063006
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月28日
【發(fā)明者】戴建英, 劉占杰, 張澤宇, 俞鐵鋒 申請人:杭州啟迪生物科技有限公司