無融合生殖大豆植物及生成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了無融合生殖大豆品種及其生成方法。本發(fā)明涉及無融合生殖大豆植物，其具有賦予無融合生殖的稱作AP1的突變體等位基因。本發(fā)明涉及雜交含有AP1等位基因的大豆植物以生成無融合生殖大豆植物的新類型和品種。
【專利說明】無融合生殖大豆植物及生成方法
[0001]發(fā)明背景
[0002]一般地，本發(fā)明提供了無融合生殖大豆植物，且更具體地，具有在花轉(zhuǎn)化成豆莢方面大于51%或者在花轉(zhuǎn)化成豆莢方面大于60%的平均百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少51個(gè)豆莢或每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢或每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢的平均值的無融合生殖大豆植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于生成無融合生殖大豆植物的方法。本申請(qǐng)中引用的所有出版物通過提及并入本文。
[0003]開發(fā)任何新的、期望的植物種質(zhì)有許多步驟。植物育種以目前種質(zhì)的問題和弱點(diǎn)的分析和限定、期望目的的建立、以及特定育種目標(biāo)的限定開始。下一步是選擇擁有滿足期望目的的性狀的種質(zhì)。目的是在單一品種中組合來自親本種質(zhì)的期望性狀的改善的組合。這些重要的性狀可以包括較高的種子產(chǎn)率、對(duì)疾病和昆蟲的抗性、較好的莖和根、對(duì)干旱和熱的耐受性、較好的農(nóng)藝學(xué)質(zhì)量、對(duì)除草劑的抗性、和組成性性狀的改善。
[0004]植物的生殖通常分類為有性或無性的。術(shù)語無融合生殖一般公認(rèn)為用各種無性生殖方式替換有性生殖(Rieger 等，In Glossary of Genetics and Cytogenetics, Springer-Verlag, New York, N.Y.，1976)。無融合生殖是一種遺傳受控的植物生殖方法,其中在沒有卵和精子核的聯(lián)合的情況下形成胚。在大多數(shù)無融合生殖形式中，極核假受精或受精以生成胚乳對(duì)于種子生存力是必需的。認(rèn)為專性無融合生殖體具有一種完全閉合的重組系統(tǒng)；也就是說，重組僅在小孢子發(fā)生過程中發(fā)生，并且在大孢子發(fā)生過程中是缺乏的。在兼性無融合生殖體中，無融合生殖和有性生殖模型兩者共存。所有已知的無融合生殖機(jī)制共享三個(gè)形成組分:生成能夠在沒有在先減數(shù)分裂的情況下形成胚的細(xì)胞(未減數(shù)孢子生殖)；自發(fā)的、不依賴于受精的胚發(fā)育(孤雌生殖)；以及自主生成胚乳或使用源自受精的胚乳的能力(Koltunow, A.M., Plant Cell5, 1425-1437，1993及Carman J.G., Biol.J.Linn.Soc.61，51-94，1997)。
[0005]在植物育種中使用無融合生殖具有經(jīng)濟(jì)潛力，因?yàn)樗梢宰屓魏位蛐?不管多么雜合)正確育出。無融合生殖是一種繞過雌性減數(shù)分裂和配子配合來生成在遺傳上與母性親本相同的胚的生殖方法。
[0006]大豆(Glycine max(L))是一種有價(jià)值的田間作物。如此，植物育種人員的持續(xù)目的是開發(fā)農(nóng)藝學(xué)完好的、穩(wěn)定的、高產(chǎn)率的大豆品種。此目的的原因是使所用土地上生產(chǎn)的谷物量最大化以及為動(dòng)物和人兩者供應(yīng)食物。為了實(shí)現(xiàn)此目的，大豆育種人員必須選擇并開發(fā)具有產(chǎn)生卓越品種的性狀的大豆植物。目前已知的大豆品種顯示在花轉(zhuǎn)化成豆莢方面小于50%的平均百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物不超過50個(gè)豆莢的平均值。
[0007]因此，會(huì)期望具有如下的大豆品種，其具有花至豆莢的較高百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物較大數(shù)目的豆莢。存在有用于生成此類品種的容易方法會(huì)是進(jìn)一步想要的。
[0008]發(fā)明概述
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種生成大豆無融合生殖(apomictic)植物的方法，所述大豆無融合生殖植物比商業(yè)大豆品種展現(xiàn)出更大百分比的花至豆莢轉(zhuǎn)化(conversion)和每個(gè)植物更大數(shù)目的豆莢，所述方法包括下列步驟:選擇多個(gè)雙胚珠種子；將所述種子種植成大豆植物；并選擇具有大于約51%的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少51個(gè)豆莢的植物或者選擇具有大于約60%的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢的植物或者選擇具有大于約60%的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢的植物。選擇的植物具有作為無融合生殖的別的特征。
[0010]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了生成大豆無融合生殖植物的方法的別的步驟，所述大豆無融合生殖植物與親本植物相比展現(xiàn)出升高的雜合優(yōu)勢(shì)，所述步驟包括將選擇的無融合生殖大豆植物作為雄性與作為雌性的不同大豆植物雜交育種；從所述雌性大豆植物收獲多個(gè)種子；將所述種子種植成大豆植物；并選擇具有大于約30%的雜合優(yōu)勢(shì)和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢的植物或者選擇具有大于約50%的雜合優(yōu)勢(shì)和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢的植物或者選擇具有大于約50%的雜合優(yōu)勢(shì)和每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢的植物。選擇的植物具有作為無融合生殖的別的特征。
[0011]在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了品種s-201、CN-0629和7B1的無融合生殖大豆植物。還提供了這些品種的種子和后代。
[0012]在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了生成大豆種子的方法，其包括將大豆品種S-201的植物與自身或第二大豆植物雜交，所述大豆品種的代表性種子已經(jīng)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)并指定為保藏號(hào) PTA-11892。
[0013]在本發(fā)明的又一個(gè) 方面，提供了生成包含添加的期望性狀的大豆品種S-201植物的方法，該方法包括將賦予期望性狀的轉(zhuǎn)基因?qū)氪蠖蛊贩NS-201植物中，所述大豆品種的代表性種子具有ATCC登錄號(hào)PTA-11892。
[0014]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了生成源自大豆品種S-201的近交大豆植物的方法，該方法包括如下的步驟，即通過雜交大豆品種S-201的植物與第二品種的大豆植物雜交來制備源自大豆品種S-201的后代植物，所述大豆品種S-201的代表性種子具有ATCC登錄號(hào)PTA-11892 ;將所述后代植物與自身或第二植物雜交以生成后續(xù)世代的后代植物的種子；從所述種子種植出后續(xù)世代的后代植物，并將所述后續(xù)世代的后代植物與自身或第二植物雜交；并重復(fù)最后兩個(gè)步驟，直到生成源自所述大豆品種S-201的近交大豆植物。
[0015]參考以下圖、描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)會(huì)得被更好地理解。
[0016]附圖簡(jiǎn)述
[0017]圖1的照片顯示了來自大豆品種S-201的選擇雙胚珠種子的例子；
[0018]圖2的照片顯不了來自大豆品種CN-0629的一對(duì)端到端(end-to-end)雙胚珠種子的例子；
[0019]圖3的照片顯示了來自大豆品種7B1的端到端和側(cè)到側(cè)(side-to-side)雙胚珠的例子；
[0020]圖4的照片顯示了為了選擇而種植的大豆品種S-201的幾個(gè)大豆植物的一致性；
[0021]圖5的照片顯示了依照本發(fā)明的無融合生殖大豆品種的典型百分比轉(zhuǎn)化；
[0022]圖6的照片顯示了每個(gè)植物具有超過150個(gè)豆莢的兩個(gè)7B1植物；
[0023]圖7的照片顯示了具有16個(gè)豆莢的7B1植物的單個(gè)節(jié)；
[0024]圖8的照片顯示了具有較高百分比的花至豆莢轉(zhuǎn)化的7B1植物的單個(gè)節(jié)；
[0025]圖9是圖6、7和8中顯示的系的7B1植物的照片；[0026]圖10的照片顯示了 7B1植物的9個(gè)節(jié)上的90個(gè)豆莢；以及
[0027]圖11的照片顯示了 7B1植物的3個(gè)節(jié)上的38個(gè)豆莢。
[0028]發(fā)明詳述
[0029]在以下描述和實(shí)施例中，使用許多術(shù)語。為了對(duì)說明書和權(quán)利要求書(包括此類術(shù)語給予的范圍)提供清楚且一致的理解，提供以下定義。若沒有提供定義，則本文中使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。
[0030]等位基因。等位基因指涉及一種性狀或特征的基因的一種或多種備選形式之任一。在雙倍體細(xì)胞或生物體中，給定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)純合染色體對(duì)上的相應(yīng)基因座。
[0031 ] 無融合生殖(apomictic)。如本文中使用的，“無融合生殖”描述使用無融合生殖來繁殖的植物。
[0032]無融合牛殖(aoomixis)。也能夠有性生殖的生物體中的無性生殖，其中在沒有受精或產(chǎn)生專門的生殖細(xì)胞的情況下形成胚。
[0033]回交?；亟恢赣N人員將雜種后代返回與親本之一，例如第一代雜種F1與F1雜種的親本基因型之一重復(fù)雜交的方法。
[0034]雜交育種。如本文中使用的，“雜交育種”指將植物的不同物種或品種的個(gè)體交配(雜交)以生成雜種的行 為。
[0035]有限生長(zhǎng)。受限于花生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育的軸，或中心莖在生長(zhǎng)季期間沒有無限生長(zhǎng)或延長(zhǎng)的生長(zhǎng)。有限生長(zhǎng)的植物具有較短的開花期，并且沿著莖的整個(gè)長(zhǎng)度生成豆莢。
[0036]雙胚珠種子。兩個(gè)共享豆莢中的一個(gè)種臍的能萌發(fā)種子的生成。一個(gè)種子稱作正常的種子，而第二個(gè)種子稱作“姐妹細(xì)胞”。通常，僅極小百分比的大豆植物生成雙胚珠種子。
[0037]異位表汰?；蛟谄漕A(yù)期時(shí)間或位置外的表達(dá)。
[0038]去雄。除去雄花或花藥以防止自花傳粉。
[0039]通。胚是成熟種子內(nèi)含有的小植物。
[0040]基通。如本文中使用的，“基因”指核酸的區(qū)段。可以使用轉(zhuǎn)化或各種育種方法將基因?qū)胛锓N的基因組(無論來自不同物種或者來自同一物種)中。
[0041]基因型。如本文中使用的，“基因型”指細(xì)胞或生物體的遺傳構(gòu)成。
[0042]生長(zhǎng)季。從春天種植種子到秋天收獲作物的時(shí)間。
[0043]勝臟。此術(shù)語指種子上留下的標(biāo)記種子被收獲前種子附著于豆莢的位置的瘢痕。
[0044]雜赴。在一種或多種可遺傳特征上有所不同的兩個(gè)親本的雜合后代。
[0045]雜合優(yōu)勢(shì)。此術(shù)語指由種間雜種表達(dá)的，源自其遺傳異質(zhì)性的較高的或改善的性能(通常就產(chǎn)率而言)。此較高的性能通常在雜種后代中喪失，迫使農(nóng)民獲得新雜種種子進(jìn)行每次種植。
[0046]下胚軸。下胚軸指子葉和根之間的胚或幼苗部分。因此，可以認(rèn)為它是枝條和根之間的過渡區(qū)。
[0047]無限牛長(zhǎng)。軸或中心莖在生長(zhǎng)季期間不斷生長(zhǎng)或延長(zhǎng)并且由于莖不斷生長(zhǎng)，開花通常持續(xù)30 - 38天的生長(zhǎng)。無限生長(zhǎng)的植物具有較長(zhǎng)的開花期并且在莖的頂生端的最后三個(gè)節(jié)上不生成豆莢。[0048]主蓋。從根到頂生端且具有節(jié)(其中一些攜帶分支，且一些僅攜帶花和豆莢)的植物部分。它是植物中作為莖的唯一部分。
[0049]成熟日期。當(dāng)95%豆莢達(dá)到其成熟顏色時(shí)認(rèn)為植物是成熟的。從8月31日或從種植日期計(jì)算天數(shù)。
[0050]成熟期組。此術(shù)語指基于地理區(qū)域的約定的品種組別產(chǎn)業(yè)劃分，在所述地理區(qū)域中它們主要依照日長(zhǎng)或緯度改編。它們由非常長(zhǎng)的日長(zhǎng)度品種(組000，00，0)組成，并且延伸到非常到的日長(zhǎng)度品種(組VII，VIII，IX，X)。
[0051]大孢子母細(xì)胞。胚珠的前體；在受精后分成2個(gè)相等的細(xì)胞，分成4個(gè)細(xì)胞，分成8個(gè)細(xì)胞，等等，直到它們分化成種子的單細(xì)胞。在無融合生殖中，刺激大孢子母細(xì)胞以在沒有受精的情況下開發(fā)分裂，并且會(huì)生成2個(gè)細(xì)胞、4個(gè)細(xì)胞、8個(gè)細(xì)胞，等等，它們都含有與大孢子母細(xì)胞中的遺傳材料相同的完全相同的遺傳材料。分化如同正常細(xì)胞一樣發(fā)生，并且生成能萌發(fā)的種子。
[0052]減數(shù)分裂。在有性生殖生物體中生成生殖細(xì)胞的細(xì)胞分裂；核分成四個(gè)各含有半數(shù)染色體數(shù)目的核。
[0053]I。植物莖上葉、豆莢或側(cè)枝生長(zhǎng)的點(diǎn)。
[0054]通迭。含有雌性植物的全部遺傳材料的單細(xì)胞。
[0055]百分比轉(zhuǎn)化。如本文中使用的，術(shù)語“百分比轉(zhuǎn)化”指大豆植物上轉(zhuǎn)化或發(fā)育成豆莢的花的平均百分比。
[0056]植逾。如本文中 使用的，術(shù)語“植物”包括指未成熟的或成熟的全植物，包括除去了種子、谷物或花藥的植物。會(huì)生成植物的種子或胚也認(rèn)為是植物。
[0057]植物高度。植物高度從土壤頂部至植物的頂端點(diǎn)或軸取得，并且以英寸測(cè)量。
[0058]植物部分。如本文中使用的，術(shù)語“植物部分”(或大豆植物，或其部分)包括但不限于原生質(zhì)體、葉、莖、根、根尖、花藥、雌蕊、種子、谷物、胚、花粉、胚珠、子葉、下胚軸、豆莢、花、枝條、組織、葉柄、細(xì)胞、分生細(xì)胞，等等。
[0059]豆荽。此術(shù)語指大豆植物的果實(shí)。它由莢或殼(果皮)和莢內(nèi)部的大豆種子組成。
[0060]多倍體。從其每個(gè)親本接受超過一組染色體的植物。
[0061]適也。如本文中使用的，包括從兩個(gè)大豆植物的雜交生成的F1大豆植物，并且后代進(jìn)一步包括但不限于與回歸親本系的后續(xù)F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9，和Fltl世代雜交。
[0062]總狀花序?；ㄑ刂髑o散布，其中最久的花在基部的花序。總狀花序可以是簡(jiǎn)單的或復(fù)合的。
[0063]相對(duì)成熟度(RM)。術(shù)語相對(duì)成熟度是基于與其它大豆品種的成熟值的比較歸于大豆品種的數(shù)字值。RM中小數(shù)點(diǎn)前的數(shù)字指成熟期組。小數(shù)點(diǎn)后的數(shù)字指每個(gè)成熟期組內(nèi)的相對(duì)早熟性或晚熟性。例如，3.0是早期組III品種，而3.9是晚期組III品種。
[0064]種子產(chǎn)率(蒲式耳/英畝)。以蒲式耳/英畝計(jì)的產(chǎn)率是收獲時(shí)谷物的實(shí)際產(chǎn)率。
[0065]每磅的種子。大豆種子在種子大小上有所變化；因此，構(gòu)成I磅需要的種子數(shù)目也變化。每磅的種子數(shù)目影響種植給定面積需要的種子磅數(shù)，并且也可以影響最終用途。
[0066]姐妹細(xì)胞。姐妹細(xì)胞是在發(fā)育過程中在完全相同的時(shí)間發(fā)生的正常大孢子母細(xì)胞的雙胎。通常，姐妹細(xì)胞的遺傳構(gòu)成完全匹配大孢子母細(xì)胞的遺傳構(gòu)成。若這兩者都受精，則生成相同的雙生種子。若一個(gè)沒有受精(其是正常的規(guī)程)，則其衰退并死亡；然而，非常罕見地，姐妹細(xì)胞可以在不受精的情況下繼續(xù)生成種子，這產(chǎn)生雙胚珠種子。在本發(fā)明的突變體等位基因前，雙胚珠種子在50億中的約I個(gè)種子中出現(xiàn)。
[0067]配子配合。受精中兩個(gè)配子的融合。
[0068]轉(zhuǎn)基因。通過遺傳工程從一個(gè)物種的生物體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種的生物體的基因。
[0069]以下詳細(xì)描述具有實(shí)施本發(fā)明的目前涵蓋的模式。描述不應(yīng)以限制性意義采用，而是僅為了例示本發(fā)明的一般原則而做出，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書最好地限定。
[0070]寬廣地，本發(fā)明涉及無融合生殖大豆品種，其包括植物和種子兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的無融合生殖大豆植物在正常的生長(zhǎng)條件下具有大于約51%的花至豆莢的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少51個(gè)豆莢或每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的無融合生殖大豆植物在正常的生長(zhǎng)條件下具有大于約60%的花至豆莢的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，這些數(shù)值可以由于超出熟練技術(shù)人員控制的環(huán)境參數(shù)而有所變化。
[0071]本發(fā)明還涉及生成本發(fā)明的無融合生殖大豆品種的方法，其中可以經(jīng)由使用無融合生殖使任何品種的特征穩(wěn)定化。在一個(gè)實(shí)施方案中，將種子種植，并對(duì)所得的植物選擇期望的性狀，包括較高的產(chǎn)率到大于約51%的較高百分比的花至豆莢的轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少51個(gè)豆莢或每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢。在一個(gè)實(shí)施方案中，將種子種植，并對(duì)所得的植物選擇期望的性狀，包括較高的產(chǎn)率到大于約60%的較高百分比的花至豆莢的轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢。
[0072]雜種大豆品種可以是兩個(gè)近交系的雜交，每個(gè)所述近交系可以具有一種或多種為另一個(gè)缺乏或互補(bǔ)另一個(gè)`的期望特征。第一代的雜種后代稱作匕。在雜種的形成中，僅尋找匕雜種種子。雜種比其近交親本更有活力。此雜合優(yōu)勢(shì)，或雜種優(yōu)勢(shì)可以以多種方式表現(xiàn)，包括升高的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和增加的產(chǎn)率。
[0073]憑借無融合生殖，專門適應(yīng)性或雜合基因型的后代會(huì)貫穿整個(gè)重復(fù)生活周期維持其遺傳保真性。在固定雜合優(yōu)勢(shì)外，無融合生殖可以在不知道或未開發(fā)用于生成雜種的有效雄性不育或能育恢復(fù)系統(tǒng)的情況中使作物中的商業(yè)雜種生成變得可能。另外，無融合生殖可以提高具有歪曲或不利的染色體構(gòu)成的植物的生殖能力，尤其在人類已經(jīng)改變所述染色體的基因內(nèi)容的情況下。
[0074]無融合生殖可以通過消除對(duì)多次雜交的需要使雜種開發(fā)更有效。它還簡(jiǎn)化雜種生成，并且提高具有良好雄性不育系統(tǒng)的植物物種中的遺傳多樣性。會(huì)理想的是，尋找控制栽培物種中專性或高水平的無融合生殖的基因并且能夠容易地將雜交相容性有性X無融合生殖基因型雜交以生成純育F1雜種。
[0075]雖然無融合生殖在柑桔(Citrus)(Parlevliet J.E.等，in Citrus.Proc.Am.Soc.Hort.Sc1., Vol.74, 252-260，1959)中及在水牛草(buffelgrass)(Bashaw, Crop Science, Vol.20, 112, 1980)和早熟禾(Poa) (Pepin 等，CropScience, Vol.11, 445-448, 1971)中有效用于生成一致的且無疾病和無病毒的站木,從而生成改善的栽培種，但是它尚未成功轉(zhuǎn)移至栽培的作物植物。將無融合生殖轉(zhuǎn)移至重要的作物會(huì)使不需要細(xì)胞質(zhì)-核雄性不育和高成本、勞動(dòng)密集的方法的純育雜種的開發(fā)和雜種的商業(yè)生成變得可能。專性無融合生殖F1雜種會(huì)經(jīng)由種子無限純育，并且可以認(rèn)為是經(jīng)由種子的營(yíng)養(yǎng)或克隆生殖方法。無融合生殖栽培植物的開發(fā)還會(huì)對(duì)發(fā)展中國家的食物安全提供主要貢獻(xiàn)(Wilson等，于Proceedings of the International Workshop on Apomixis inRice, Changsha, People’s Republic of China, 13Jan.- 15Jan., 1992.Hunan Hybrid RiceResearch Center, Changsha, People’ s Republic of China)。
[0076]目前種植的商業(yè)大豆植物和種子在花轉(zhuǎn)化成豆莢方面具有不大于50%的平均百分比轉(zhuǎn)化。目前的商業(yè)大豆植物具有多至100個(gè)花，并且在收獲時(shí)會(huì)具有每個(gè)植物不超過約50個(gè)豆莢。這顯示目前每英畝生成的大豆量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢且經(jīng)常每個(gè)植物超過300或400個(gè)豆莢的平均值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢且經(jīng)常每個(gè)植物超過300個(gè)豆莢的平均值。此外,本發(fā)明的大豆品種的生成由于雜種雜交的一個(gè)親本中的無融合生殖而以比用于生成新品種的正常育種短的時(shí)間范圍生成。本發(fā)明的無融合生殖大豆品種滿足經(jīng)由使用雜合優(yōu)勢(shì)將每英畝的大豆產(chǎn)率從目前水平提高的期望。
[0077]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于生成無融合生殖大豆品種的方法，所述無融合生殖大豆品種與目前的大豆品種相比具有較高百分比的花至豆莢轉(zhuǎn)化和較大數(shù)目的總體豆莢。所述方法包括從具有期望的大豆種質(zhì)性狀的資源的種子批次選擇雙胚珠種子的步驟。需要的種子數(shù)目可以隨種子的兩個(gè)胚珠的生存力而變化。雙胚珠種子源自姐妹細(xì)胞沿著豆莢中任何位置處正常單一胚珠的側(cè)面或末端的形成，并且必須共享同一種臍。雙胚珠種子以高得相當(dāng)?shù)念l率出現(xiàn)，但是通常由于姐妹細(xì)胞的高死亡率而變得觀察不到。存活的姐妹細(xì)胞的出現(xiàn)對(duì)于大豆評(píng)估為50億中的I個(gè)。
[0078]為了尋找正常大豆中的僅一個(gè)雙胚珠種子，通?；ㄙM(fèi)超過一年。即使在同一年中找到一打左右的雙胚珠種子，它們會(huì)完全與親本系一樣，并且根本沒有價(jià)值。然而，可以在多年中生成一次具有價(jià)值的雙胚珠種子，因?yàn)樗跊]有雄性大豆植物貢獻(xiàn)的情況下生成種子；也就是說，它不需要花粉來生成種子。取而代之，大孢子母細(xì)胞自身啟動(dòng)胚珠的分裂；而正常情況下，直到受精后也不開始分裂。在完成新植物的生成時(shí)，基因的貢獻(xiàn)都來自雌性植物，并且會(huì)純育，即所有性狀會(huì)與雌性植物的性狀相同，因?yàn)樾誀钍墙忝眉?xì)`胞基因的特征并且沒有改變。此特性是無融合生殖。
[0079]在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，經(jīng)濟(jì)發(fā)展目的需要的雙胚珠種子數(shù)目可以是約10，000至30，000。然而，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，本發(fā)明的方法不限于最初選擇的雙胚珠種子數(shù)目。對(duì)于本發(fā)明的無融合生殖大豆的三種不同品種，圖1-3中顯示了雙胚珠種子的例子。雙胚珠種子可以是端到端或側(cè)到側(cè)的。尚未觀察到產(chǎn)生關(guān)于雙重胚珠取向的差異。經(jīng)由大豆品種開發(fā)程序，包括大豆品種的常規(guī)雜交育種、選擇、自交和/或進(jìn)一步雜交育種和進(jìn)一步選擇，開發(fā)稱作S-201的品系。發(fā)現(xiàn)了 S-201品種與常規(guī)的大豆品種相比具有高的雙胚珠種子頻率。在收獲2009年作物后，一致努力尋找盡可能多的雙胚珠對(duì)。經(jīng)由幾蒲式耳的S-201種子及其衍生物的分選產(chǎn)生超過3，200個(gè)不同的雙胚珠種子對(duì)。這些形成關(guān)于雙胚珠種子的遺傳力和無融合生殖的大多數(shù)目前研究的基礎(chǔ)。
[0080]在下一步中，將種子出芽，并對(duì)其觀察花至豆莢的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物的豆莢總數(shù)。在這些性狀方面具有高于正常的數(shù)目的品系選擇為用于生成本發(fā)明的無融合生殖植物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以選擇具有大于約51%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以選擇具有大于約60%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在別的實(shí)施方案中，可以選擇具有大于約70%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，可以選擇具有大于約80%或甚至約90%或甚至接近約100%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在一些實(shí)施方案中，可以選擇具有介于約51%和約70%之間的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在其它實(shí)施方案中，可以選擇具有介于約60%和約70%之間的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在別的實(shí)施方案中，可以選擇具有介于約70%和約80%之間或介于約70%和約90%之間的百分比轉(zhuǎn)化的植物。在別的實(shí)施方案中，可以選擇具有介于約90%和約100%之間的百分比轉(zhuǎn)化的植物。另外，每個(gè)植物的豆莢數(shù)目可以大于約60個(gè)豆莢，或大于約100個(gè)豆莢，或大于約200個(gè)豆莢，或大于約300個(gè)豆莢，或甚至大于約400個(gè)豆莢。如本文中顯示的，已經(jīng)通過本發(fā)明的方法生成具有每個(gè)植物大于400個(gè)豆莢的植物。在一些實(shí)施方案中，植物可以具有每個(gè)植物介于約60和約100個(gè)之間的豆莢。在其它實(shí)施方案中，植物可以具有每個(gè)植物介于約100和約200個(gè)之間的豆莢。在別的實(shí)施方案中，植物可以具有每個(gè)植物介于約200和約300個(gè)之間的豆莢。在別的實(shí)施方案中，植物可以具有每個(gè)植物介于約300和約400個(gè)之間的豆莢。在其它實(shí)施方案中，植物可以具有每個(gè)植物大于約400個(gè)豆莢。還可以對(duì)植物測(cè)試無融合生殖，其牽涉測(cè)試的品系的幾個(gè)植物的所有花藥的去雄和觀察去雄的花所結(jié)的豆莢。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)(若不是全部)源自S-201的雙胚珠種子的植物，以及源自S-201品種的后代植物也具有為無融合生殖的特征。
[0081]圖4顯示了通過此方法生成的品種之一的例子。出乎意料地，S-201具有接近100%，且平均為92%的花至豆莢的百分比轉(zhuǎn)化。出乎意料地，S-201還生成高于正常量的雙胚珠種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，S-201生成高于正常量的雙胚珠種子，其具有每千個(gè)總體種子介于約I和約2之間的雙胚珠種子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，S-201生成高于正常量的雙胚珠種子，其具有每千個(gè)總體種子介于約I和約3之間的雙胚珠種子。在別的實(shí)施方案中，S-201生成高于正常量的雙胚珠種子，其具有每千個(gè)總體種子介于約I和約4之間的雙胚珠種子。在別的實(shí)施方案中，S-201生成高于正常量的雙胚珠種子，其具有每千個(gè)總體種子介于約I和約5之間的雙胚珠種子。平均而言，S-201生成每千個(gè)總體種子約1.3個(gè)雙胚珠種子。目前的大豆品種具有50億中約I個(gè)種子的雙胚珠頻率。
`[0082]來年種植來自選擇植物的雙胚珠種子，并對(duì)10個(gè)隨機(jī)選擇的，標(biāo)示為品種7B1的植物實(shí)施去雄(圖6-11)。從每個(gè)植物上的10朵花除去所有花粉，并且標(biāo)簽指示每個(gè)去雄的花定位的地方。當(dāng)胚珠在沒有通常需要的傳粉的情況下開始分裂生成種子時(shí)發(fā)生無融合生殖。推斷將花去雄后生成的種子是由于無融合生殖得到。選擇的植物上的花應(yīng)當(dāng)?shù)貌坏交ǚ郏驗(yàn)榛ㄋ幵诨ǚ鄢墒烨昂芫帽愠?。從那些植物上生成的第一豆莢種植的植物作為無融合生殖單一品種繼續(xù)至少三年，總體上從2009年產(chǎn)生的種子起每年在植物中觀察到顯著一致性。另外，10個(gè)初始植物中的3個(gè)已經(jīng)生成具有至少一個(gè)雙胚珠的后代。
[0083]不限于任何理論，認(rèn)為S-201中雙胚珠種子的此高產(chǎn)量是由于S-201品種開發(fā)期間出現(xiàn)的突變體等位基因的存在所致。此突變體等位基因可以單獨(dú)或與S-201中存在的其它基因一致起作用以提供較高的雙胚珠種子頻率。進(jìn)一步認(rèn)為此突變體等位基因也可以對(duì)本發(fā)明的植物和后代植物的無融合生殖特征具有影響。
[0084]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括將大豆品種S-201的選定植物或其后代與具有期望性狀的另一種大豆品種雜交育種的步驟。在一個(gè)例示性的例子中，大豆品種S-201的植物或其后代用作雄性植物，而別的品種用作雌性植物。然后，將來自雌性植物的種子收獲并種植。然后，對(duì)植物選擇期望的性狀，如上文描述的。根據(jù)期望，可以將此步驟重復(fù)多次以獲得具有添加的期望性狀的大豆植物。添加的期望性狀可以是但不限于雄性不育、除草劑耐受性、昆蟲或有害生物抗性、疾病抗性、經(jīng)修飾的脂肪酸代謝、經(jīng)修飾的碳水化合物代謝和經(jīng)修飾的大豆纖維特征。在一個(gè)交替的例子中，添加的性狀可以是除草劑耐受性，其中對(duì)除草劑賦予耐受性，所述除草劑諸如但不限于草甘膦(glyphosate)、橫酸服(sulfonylurea)、咪唑啉酮(imidazalinone)、麥草畏(dicamba)、草丁憐(glufosinate)、勝絲菌素(phosphinothricin)、苯氧基丙酸(phenoxy proprionicacid)、環(huán)己燒(cycloshexone)、三嗪(triazine)、苯基氰(benzonitrile)和溴草臆(broxynil)。(參見美國專利N0.7，868，231，7，868，232和7，572，958，其全部通過提及完整并入本文)。
[0085]在另一個(gè)實(shí)施方案中，大豆品種S-201的植物或其后代用作雌性植物，而別的品種用作雄性植物。
[0086]在一個(gè)交替的環(huán)境中，可以通過其它方法，諸如重組技術(shù)大豆品種S-201的植物和/或其后代對(duì)賦予期望的性狀。此類方法是本領(lǐng)域中公知的。
[0087]大豆的另一種無融合生殖品種選自S-201的F4后代并且標(biāo)記為CN-0629。隨后，使用此實(shí)驗(yàn)系CN-0629來衍生新的品系，許多所述品種已經(jīng)生成每個(gè)植物超過400個(gè)豆莢。在CN-0629、S-201、或7B1的雜交育種中，61種不同品系在雜交中用作雌性，所述雜交牽涉來自CN-0629、S-201、或7B1的選擇后代作為雄性。來自此雜交育種的F1世代顯示百分比轉(zhuǎn)化和豆莢數(shù)目的相當(dāng)大的變化。大部分F1世代在后一年種植時(shí)顯示表型相似性。一個(gè)此類后代是圖5-11中顯示的品種7B1。該圖顯示每個(gè)植物的豆莢數(shù)目增加，特別在每個(gè)單獨(dú)節(jié)處。
[0088]無融合生殖大豆品種S-201及其后代的另一個(gè)特征是它們具有有限生長(zhǎng)特征。幾乎所有大豆品種展現(xiàn)出兩種可能的生長(zhǎng)習(xí)性之一:有限或無限生長(zhǎng)。大多數(shù)無限品種適合于成熟期組IV及更早。這些品種通常在美國北部種植。這些品種具有重疊的營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)期。通常，小于半數(shù)的主莖節(jié)在開始開花時(shí)已經(jīng)形成。隨著開花進(jìn)行到莖，莖生長(zhǎng)繼續(xù)。無限的莖不以頂生總狀花序結(jié)束或者總狀花序在大小上大幅降低。根據(jù)節(jié)位置，花和豆莢以不同時(shí)間和速率形成。具有最早的花和最慢形成的豆莢的節(jié)位于莖底部附近。
[0089]大多數(shù)具有有限生長(zhǎng)習(xí)性的品種在成熟期組V到X中分類，并且通常在美國南部種植，且更北部生長(zhǎng)得不好。這些品種具有相當(dāng)獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)和生殖發(fā)育期。少數(shù)莖節(jié)在開始開花后形成，并且莖以頂生總狀花序結(jié)束。對(duì)于所有的莖節(jié)，花和豆莢趨于以大致相同的時(shí)間和速率形成。已經(jīng)對(duì)北方大豆生產(chǎn)區(qū)推廣幾種具有有限生長(zhǎng)習(xí)性的品種。這些品種通常分類為半矮生，并且獲得其它適應(yīng)品種的高度的約一半至三分之二。
[0090]本發(fā)明的無融合生殖大豆品種的獨(dú)特特征在于它們具有有限生長(zhǎng)習(xí)性，并且具有有頂生總狀花序的莖。然而，與具有有限生長(zhǎng)習(xí)性的常見大豆不一樣，本發(fā)明的大豆品種顯示鍛煉/耐抗性(hardiness)，這容許它們?cè)诿绹辈可L(zhǎng)。此外，與具有有限或無限生長(zhǎng)特征的兩種常見的品種形成對(duì)比，本發(fā)明的大豆品種具有較高的花至豆莢的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物較大數(shù)目的豆莢。
[0091]本發(fā)明的無融合生殖植物部分源自本發(fā)明的突變體等位基因，在本文中稱作AP1，其會(huì)有利地導(dǎo)入含有期 望遺傳性狀諸如對(duì)疾病的抗性、干旱耐受性、熱和/或冷耐受性等等的品種中以生成含有會(huì)純育的含有期望性狀的新無融合生殖植物。
[0092]本發(fā)明的遺傳因子能夠傳遞高于正常產(chǎn)量的可用于生成本發(fā)明無融合生殖植物的雙胚珠種子以及高于正常百分比的花至豆莢轉(zhuǎn)化及高于正常數(shù)目的豆莢的特征。APl突變體似乎是單顯性或部分顯性突變體等位基因?；蛘撸蛔凅w等位基因可以由顯性基因及影響表達(dá)水平的別的修飾基因控制。對(duì)牽涉S-201和7B1的雜交的F1和F2后代進(jìn)行的觀察指示少量基因可能造成觀察到的“部分顯性”，或者它可以是具有幾個(gè)不同強(qiáng)度的修飾基因的顯性基因。由于一個(gè)或多個(gè)等位基因中的突變，基因間的此類關(guān)系可以已經(jīng)以報(bào)告的頻率出現(xiàn)。此類突變可以已經(jīng)容許先前未觀察到的現(xiàn)象的表達(dá)。此突變體等位基因可以用于并轉(zhuǎn)移至其它大豆品種正是本發(fā)明的特征。
[0093]當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解前文涉及本發(fā)明的例示性實(shí)施方案，并且可以在不偏離所附權(quán)利要求書中所列的本發(fā)明精神和范圍的前提下進(jìn)行修飾。
[0094]本發(fā)明的其它實(shí)施方案
[0095]新的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)已經(jīng)容許具有特定功能，諸如編碼特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的遺傳元件的分離和表征。植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對(duì)將植物基因組工程化改造為含有并表達(dá)外來遺傳元件，或者天然或內(nèi)源遺傳元件的別的，或經(jīng)修飾的型式，從而以特定方式改變植物的性狀產(chǎn)生強(qiáng)烈興趣。使用轉(zhuǎn)化或各種育種方法導(dǎo)入基因組中的任何DNA序列(無論來自不同物種或來自同一物種)在本文中通稱為“轉(zhuǎn)基因”。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，無融合生殖大豆的轉(zhuǎn)基因變體可以含有至少一種轉(zhuǎn)基因，但是可以含有至少I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10 和 / 或不超過 15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，或 2 種。在過去的15至20年里，已經(jīng)開發(fā)出幾種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，并且本發(fā)明還涉及要求保護(hù)的無融合生殖大豆的轉(zhuǎn) 基因變體。
[0096]核酸或多核苷酸指線性或分支、單鏈或雙鏈的RNA或DNA或其雜合物。該術(shù)語還涵蓋RNA/DNA雜合物。這些術(shù)語還涵蓋位于基因編碼區(qū)的3’和5’兩者的非翻譯序列:基因編碼區(qū)5’端上游的至少約1000個(gè)核苷酸的序列和編碼區(qū)3’端下游的至少約200個(gè)核苷酸的序列。不太常見的堿基，諸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤等也可以用于反義、dsRNA和核酶配對(duì)。例如，已經(jīng)顯示了含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的多核苷酸以高親和力結(jié)合RNA，并且是基因表達(dá)的有力反義抑制劑。也可以進(jìn)行其它修飾，諸如對(duì)磷酸二酯主鏈或RNA的核糖糖基中的2’-羥基的修飾。反義多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸組成，或者可以含有混合的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以通過任何手段，包括基因組制備、cDNA制備、體外合成、RT-PCR、和體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄來生成。
[0097]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用于生成進(jìn)一步包含期望性狀的無融合生殖大豆植物的方法，所述方法包括導(dǎo)入對(duì)本發(fā)明的無融合生殖大豆植物賦予期望性狀的轉(zhuǎn)基因。另一個(gè)實(shí)施方案是通過此方法生成的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，期望的性狀可以是下列一項(xiàng)或多項(xiàng):除草劑抗性、昆蟲抗性、疾病抗性、降低的肌醇六磷酸、或經(jīng)修飾的脂肪酸或碳水化合物代謝。特定的基因可以是本文中公知的或本文中所列的，包括:賦予對(duì)咪唑啉酮、麥草畏、磺酰脲、草甘膦、草丁磷、三嗪、苯基氰、環(huán)己二酮、苯氧基丙酸、和L-膦絲菌素的抗性的多核苷酸；編碼蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)多肽的多核苷酸；編碼肌醇六磷酸酶、FAD-2、FAD-3、肌醇半乳糖苷合酶、或棉子糖合成酶的多核苷酸；或賦予對(duì)大豆孢囊線蟲、褐莖腐朽(brown stem rot)、疫霉(Phytophthora)根部腐朽、大豆花葉病毒、或突然死亡綜合征的抗性的多核苷酸。
[0098]已經(jīng)開發(fā)出許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括生物學(xué)和物理植物轉(zhuǎn)化方案。參見例如 Miki 等，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants, ” 于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson編，CRC Press, Inc., Boca Raton, pp.67-88(1993)，及 Armstrong, “The First Decadeof Maize Transformation:A Review and Future Perspective, ^Maydica, 44:101-109(1999)。另外，用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和再生植物的表達(dá)載體及體外培養(yǎng)方法是可用的。參見例如 Gruber 等，“Vectors for Plant Transformation,，，于 Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson 編，CRC Press,Inc., BocaRaton, pp.89-119(1993)。
[0099]然后，可以使用植物育種領(lǐng)域中公知的傳統(tǒng)育種技術(shù)將已經(jīng)工程化改造入特定大豆植物的基因組中的遺傳性狀移到另一品種的基因組中。例如，回交方法通常用于將轉(zhuǎn)基因從經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆品種移到已經(jīng)開發(fā)的大豆品種中，然后，所得的回交轉(zhuǎn)化植物會(huì)包含轉(zhuǎn)基因。
[0100]可以使用轉(zhuǎn)化將各種遺傳元件導(dǎo)入植物基因組中。這些元件包括但不限于基因、編碼序列、誘導(dǎo)型、組成性和組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)序列、和信號(hào)和靶向序列。例如，參見美國專利N0.6，118，055中所列的性狀、基因和轉(zhuǎn)化方法。
[0101]植物轉(zhuǎn)化牽涉構(gòu)建會(huì)在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。此類載體包含DNA，該DNA包含在調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)的控制下或與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)可操作連接的基因。表達(dá)載體可以含有一個(gè)或多個(gè)此類可操作連接的基因/調(diào)節(jié)元件組合。載體可以為質(zhì)粒的形式，并且可以單獨(dú)或與其它質(zhì)粒組合使用以提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆植物，其使用如下文描述的轉(zhuǎn)化方法將轉(zhuǎn)基因摻入大豆植物的遺傳材料中進(jìn)行。
[0102]同樣地，依靠本發(fā)明，可以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體地，可以將植物遺傳工程化改造為表達(dá)農(nóng)藝學(xué)`目的的各種表型。牽涉這點(diǎn)的例示性基因包括但不限于下文分類的那些基因:
[0103]I.賦予對(duì)有害生物或疾病的抗性且編碼下列各項(xiàng)的基因:
[0104]A.植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中疾病抗性基因(R)產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)的無毒性(Avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活?？梢杂靡环N或多種克隆的抗性基因轉(zhuǎn)化植物品種以工程化改造對(duì)特定病原性菌株有抗性的植物。參見例如Jones,等川(^61?^，266:789(1994)(克隆番茄0卜9基因，用于對(duì)黃枝抱霉(Cladosporium fulvum)的抗性);Martin,等,Science, 262:1432(1993)(用于對(duì)丁香假單胞菌番爺致病變種(Pseudomonas syringae pv.tomato)的抗性的番茄Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinos等，Cell，78:1089 (1994)(擬南芥RSP2基因，用于對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性)；McDowell&Woffenden, Trends Biotechnol.,21 (4):178-83(2003);及 Toyoda等，Transgenic Res., 11(6):567-82 (2002)。
[0105]B.賦予對(duì)有害生物，諸如大豆孢囊線蟲的抗性的基因。參見例如PCT申請(qǐng)W096/30517 和 PCT 申請(qǐng) W093/19181。[0106]C.蘇蕓金芽胞桿菌蛋白，其衍生物或以其為模型的合成多肽。參見例如Geiser等，Gene，48:109 (1986)，其披露了 Bt δ -內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼δ -內(nèi)毒素基因的DNA分子可以購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas, Virginia,例如在 ATCC 登錄號(hào) 40098、67136、31995、和 31998 下。
[0107]D.凝集素。參見例如 Van Damme,等，Plant Molec.Biol.，24:25 (1994)，其披露了幾種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。
[0108]E.維生素結(jié)合蛋白諸如親合素。參見PCT申請(qǐng)US93/06487，其教導(dǎo)了使用親合素和親合素同系物作為針對(duì)昆蟲有害生物的殺幼蟲劑。
[0109]F.酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abe，等，J.Biol.Chem.，262:16793 (1987)(稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑的核苷酸序列)；Huub,等，PlantMolec.Biol.,21:985 (1993)(編碼煙草蛋白酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列);Sumitani,等，Biosc1.Biotech.Biochem.，57:1243(1993)(硝抱鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus) α -淀粉酶抑制劑的核苷酸序列);及美國專利N0.5，494，813 (Hepher和Atkinson, 1996 年 2 月 27 日公告).[0110]G.昆蟲特異性激素或信息素，諸如蛻化類固醇(ecdysteroid)或保幼激素，其變 體，基于其的模擬物，或其拮抗劑或激動(dòng)劑。參見例如Hammock,等，Nature, 344:458 (1990)的公開內(nèi)容，其關(guān)于克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的一種滅活劑)的桿狀病毒表達(dá)。
[0111]H.昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受影響有害生物的生理學(xué)。例如參見Regan, J.Biol.Chem.,269:9(1994)的公開內(nèi)容(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的 DNA) ; Pratt,等,Biochem.Biophys.Res.Comm., 163:1243 (1989)(在太平洋折翅爐(DiPloptera puntata)中鑒定抑咽側(cè)體神經(jīng)月太(allostatin, allatostatin)) ;Chattopadhyay,等,Critical Reviews in Microbiology, 30(I):33-54(2004);Zjawiony,J Nat Prod, 67(2):300-310(2004);Carlini&Gross1-de-Sa, Toxicon, 40(11):1515-1539 (2002);Ussuf,等，Curr Sc1.,80(7):847-853(2001);Vasconce1s&Oliveira, Toxicon, 44(4):385-403(2004)。還可見Tomalski等的美國專利N0.5，266，317，其披露了編碼昆蟲特異性麻痹性神經(jīng)毒素的基因。
[0112]1.本質(zhì)上由蛇、胡蜂等生成的昆蟲特異性毒液。例如，參見Pang等，Gene，116:165(1992)，關(guān)于在植物中異源表達(dá)編碼蝎昆蟲毒性肽的基因的公開內(nèi)容。
[0113]J.負(fù)責(zé)單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯基丙烷衍生物或具有殺昆蟲性活性的另一種非蛋白質(zhì)分子的超積累的酶。
[0114]K.牽涉對(duì)生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見PCT申請(qǐng)W093/02197 (Scott,等)，，其披露了纖維二糖酶(callase，cellase)基因的核苷酸序列。含有幾丁質(zhì)酶編碼序列的DNA分子可以例如以登錄號(hào)39637和67152獲自ATCC。還可參見 Kramer,等，Insect Biochem.Molec.Biol.，23:691 (1993)(其教導(dǎo)了編碼煙草天蛾幾丁質(zhì)酶的 cDNA 的核苷酸序列)和 Kawalleck 等,Plant Molec.Biol.,21:673 (1993)(其提供了歐芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)，美國專利N0.7，145,060, 7,087,810,和6，563，020ο[0115]L.刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如，參見Botella等，Plant Molec.Biol., 24:757 (1994)(關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPhysiol., 104:1467(1994)(其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開內(nèi)容。
[0116]M.疏水矩肽。參見？(^申請(qǐng)冊(cè)95/16776和美國專利如.5，580，852(其披露了抑制真菌植物病原體的鱟抗菌肽的肽衍生物)和PCT申請(qǐng)W095/18855和美國專利N0.5，607，914 (其教導(dǎo)了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。
[0117]N.膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見Jaynes等，PlantSci, 89:43(1993)的公開內(nèi)容，其關(guān)于殺菌肽_ β溶解肽類似物的異源表達(dá)以給予對(duì)青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植物。
[0118]0.病毒侵入性蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的積累賦予對(duì)由可以衍生外殼蛋白基因的病毒及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見Beachy等,Ann.Rev.Phytopathol., 28:451 (1990)。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予針對(duì)苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、和馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。
[0119]P.昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功能的抗體會(huì)使受影響的酶失活，殺死昆蟲。參見Taylor等,摘要號(hào)497, Seventh Int’ ISymposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotlandl994)(經(jīng)由生成單鏈抗體片段來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中的酶促失活)。
[0120]Q.病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki,等，Nature, 366:469 (1993),其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)免于病毒攻擊。
[0121]R.本質(zhì)上由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌內(nèi)a -1, 4_D_多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁同-a - a-1，4-D-半乳糖醒`酸酶(galacturonase)來促進(jìn)真菌定殖(colonization)和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。參見Lamb,等，Bio/Technology, 10:1436 (1992)。編碼豆內(nèi)多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征由Toubart，等，Plant J., 2:367 (1992)描述。
[0122]S.本質(zhì)上由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology, 10:305(1992)已經(jīng)顯示了表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌疾病的抗性升高。
[0123]T.牽涉系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)響應(yīng)和/或發(fā)病機(jī)制相關(guān)基因的基因。Briggs, S., Current Biology,5 (2) (1995);Pieterse&Van Loon,Curr.0pin.PlantBi0.,7(4):456-64(2004);及 Somssich, Cell, 113(7):815-6(2003)。
[0124]U.抗真菌基因。參見 Cornelissen 和 Melchers, Plant Physiol., 101:709-712 (1993);Parijs 等，Planta, 183:258-264 (1991);及 Bushnell,等，Can.J.0f PlantPath.，20 (2): 137-149 (1998)。還可見美國專利 N0.6，875，907。
[0125]V.解毒基因，諸如用于煙曲霉毒素(fumonisin)、白僵菌素(beauvericin)、串珠鐮刀菌毒(moniliformin)、和玉米赤霉烯酮(zearalenone)及其結(jié)構(gòu)相關(guān)衍生物。參見例如美國專利N0.5，792,931。
[0126]W.半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。參見美國專利N0.7，205，453。
[0127]X.防衛(wèi)素(Defensin)基因。參見 TO03/000863 和美國專利 N0.6，911，577。[0128]Y.賦予對(duì)線蟲，特別是大豆孢囊線蟲的抗性的基因。參見例如PCT申請(qǐng)W096/30517, W093/19181,及 W003/033651;Urwin,等，Planta, 204:472-479 (1998) ;ffilliamson,Curr Opin Plant Bi0., 2 (4):327-31(1999)?
[0129]Z.賦予對(duì)疫霉根部腐朽的抗性的基因，諸如Rpsl, Rpsla, Rpslb, Rpslc, Rpsld, Rpsle, Rpslk, Rps2, Rps3a, Rps3b, Rps3c, Rps4, Rps5, Rps6, Rps7 和其它 Rps 基因。參見例如 Shoemaker 等，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, PlantGenome IV Conference, San Diego, Calif.(1995)。
[0130]AA.賦予對(duì)褐莖腐朽的抗性的基因，諸如記載于美國專利N0.5，689，035，其為此目的通過提及并入。
[0131]可以經(jīng)由多種手段，包括但不限于轉(zhuǎn)化和雜交將上文所列的任何疾病或有害生物抗性基因(A-AA)導(dǎo)入要求保護(hù)的大豆栽培種中。
[0132]2.賦予對(duì)除草劑的抗性的基因，所述除草劑例如:
[0133]A.抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，諸如咪唑啉酮或磺酰脲。在此種類中的例示性基因編碼突變型ALS和AHAS酶，如分別由Lee等，EMBO J.,7:1241 (1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet., 80:449 (1990)描述的。
[0134]B.草甘膦(分別由突變型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因和aroA基因賦予的抗性)和其它膦酰基化合物諸如草丁膦(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)PAT bar基因)、和吡唳氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(ACC酶抑制劑編碼基因)。參見例如Shah等的美國專利N0.4，940，835，其披露了可以賦予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。Barry的美國專利N0.5，627，061也描述了編碼EPSPS酶的基因。還可見美國專利 N0.6，566，587，6，338，961，6，248，876，6，040，497，5，804，425，5，633，435，5，145，783，4，971，908，5，312，910，5，188，642，4，940，835，5，866，775，6，225，I14，6，130，366，5，310，667，4，535，060，4，769，061，5，633，448，5，510，471，RE36, 449，RE37,287，和 5，491，288;及國際公開文`本 EP1173580, W001/66704, EP1173581,和 EP1173582，其為此目的通過提及并入本文。也對(duì)表達(dá)編碼酶草甘膦氧化還原酶的基因的植物賦予草甘膦抗性，如更完整記載于美國專利N0.5，776，760和5，463，175的，其為此目的通過提及并入本文。另外，可以通過過表達(dá)編碼草甘膦N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)χ参镔x予草甘膦抗性。參見例如美國N0.7，462，481。編碼突變體aroA基因的DNA分子可以在ATCC登錄號(hào)39256下獲得，并且突變體基因的核苷酸序列披露于Comai的美國專利N0.4，769，061。Kumada等的歐洲專利申請(qǐng)N0.0333033和Goodman等的美國專利N0.4，975，374披露了賦予對(duì)除草劑諸如L-膦絲菌素的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。Leemans等的歐洲專利申請(qǐng)N0.0242246 中提供了 PAT 基因的核苷酸序列。DeGreef,等，Bio/Technology, 7:61 (1989)描述了生成轉(zhuǎn)基因植物，其表達(dá)編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因。賦予對(duì)苯氧基丙酸和環(huán)己酮(cyclohexones),諸如拿捕凈(sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop)的抗性的基因的例子是Marshall 等，Theor.Appl.Genet., 83:435 (1992)描述的 Accl-Sl、Accl-S2、和 Acc2_S3 基因。
[0135]C.抑制光合成的除草劑，諸如三嗪(psbA和gs+基因)或氰苯(腈水解酶基因)。Przibila,等，Plant Cell, 3:169 (1991)描述了編碼突變型psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美國專利N0.4, 810, 648,并且含有這些基因的DNA分子以ATCC登錄號(hào)53435，67441，和67442可獲得。編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)由Hayes等，Biochem.J.，285:173 (1992)描述。
[0136]D.已經(jīng)將乙酰羥酸合酶導(dǎo)入多種植物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了所述乙酰羥酸合酶使表達(dá)此酶的植物對(duì)多類除草劑有抗性。參見Hattori等，Mol.Gen.Genet.，246:419 (1995)。賦予對(duì)除草劑的耐受性的其它基因包括編碼大鼠細(xì)胞色素P4507A1和酵母NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota,等，Plant Physiol., 106:17 (1994));谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono，等，Plant Cell Physiol.，36:1687 (1995));和各種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Datta,等，Plant Mol.Biol.，20:619 (1992))。
[0137]E.原卟啉原氧化酶(protox)對(duì)于生成葉綠素是必需的，所述葉綠素對(duì)于所有植物存活是必需的。protox酶充當(dāng)多種除草劑化合物的靶物。這些除草劑還抑制存在的所有不同植物物種的生長(zhǎng)，引起其完全破壞。開發(fā)對(duì)這些除草劑有抗性的含有改變的protox活性的植物記載于美國專利N0.6，288，306，6，282，837，5，767，373，及國際公開文本 TO01/12825。
[0138]可以經(jīng)由多種手段，包括但不限于轉(zhuǎn)化和雜交將上文列出的任何除草劑基因(A-E)導(dǎo)入本發(fā)明的無融合生殖大豆植物中。
[0139]3.賦予或促成如下增值性狀的基因，所述增值性狀諸如:
[0140]A)經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以增加植物的硬脂酸含量。參見 Knultzon 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:2625(1992)。
[0141]B.降低的肌醇六磷酸含量:1)肌醇六磷酸酶編碼基因的導(dǎo)入增強(qiáng)肌醇六磷酸的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多游離的磷酸鹽。例如，參見Van Hartingsveldt,等，Gene, 127:87 (1993),關(guān)于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開內(nèi)容。2)降低肌醇六磷酸含量的基因的上調(diào)。例如在玉米中，這可以如下實(shí)現(xiàn)，即克隆，然后再次導(dǎo)入與在以低水平肌醇六磷酸為特征的玉米突變體中鑒定(諸如在Raboy等，Maydica, 35:383 (1990)中)的一種或多種等位基因，諸如LPA等位基因關(guān)聯(lián)的DNA和/或改變肌醇激酶活性，如W002/059324，美國公開文本N0.2003/000901, W003/027243,美國公開文本 N0.2003/0079247，W099/05298,美國申請(qǐng)N0.6, 197,561，美國申請(qǐng) N0.6，291，224，美國申請(qǐng) N0.6，391，348，W02002/059324,美國公開文本 N0.2003/0079247，W098/45448, W 099/55882，和 W001/04147 中的。
[0142]C.通過例如用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因或改變硫氧還蛋白，諸如NTR和/或TRX (參見美國專利N0.6，531，648，其為此目的通過提及并入)，和/或gamma玉米醇溶蛋白敲除或突變體，諸如cs27或TUSC27或en27 (參見美國專利N0.6，858，778，及美國公開文本N0.2005/0160488和2005/0204418，其為此目的通過提及并入)的基因轉(zhuǎn)化植物實(shí)現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳水化合物組成。參見Shiroza,等,J.Bacteriol., 170:810 (1988)(鏈球菌(Streptococcus)突變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等，Mol.Gen.Genet., 200:220 (1985)(枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因的核苷酸序列)；Pen 等,Bio/Technology, 10:292 (1992)(表達(dá)地衣芽胞桿菌(Bacillus lichenifonn, Bacillus licheniformis) α -淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的生成)；Elliot等，Plant Molec.Biol.，21:515 (1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard 等，J.Biol.Chem.，268:22480 (1993)(大麥 α -淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)；Fisher等，Plant Physiol.，102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶 II) ;W099/10498 (經(jīng)由修飾UDP-D-木糖4-差向異構(gòu)酶、Fragilel和2、Refl、HCHL、C4H實(shí)現(xiàn)的改善的消化率和/或淀粉提取);美國專利N0.6，232，529 (通過修飾淀粉水平(AGP)生成高油種子的方法)。
[0143]上文提及的脂肪酸修飾基因也可以用于經(jīng)由淀粉和油途徑的相互關(guān)系影響淀粉含量和/或組成.[0144]D.經(jīng)由FAD-2基因修飾得到的升高的油酸和/或經(jīng)由FAD-3基因修飾得到的降低的亞麻酸。參見美國專利N0.6，063，947，6，323，392，及國際公開文本W(wǎng)093/11245。亞麻酸是大豆種子中5種最豐富的脂肪酸之一。亞麻酸的低氧化穩(wěn)定性是大豆油經(jīng)歷部分氫化的一個(gè)原因。當(dāng)部分氫化時(shí)，所有不飽和脂肪酸形成反式脂肪。大豆是美國最大的食用油來源，并且40%的大豆油生產(chǎn)是部分氫化的。反式脂肪的消費(fèi)增加心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。禁止反式脂肪的規(guī)章鼓勵(lì)開發(fā)低亞麻酸大豆。含有低亞麻酸百分比的大豆產(chǎn)生不常需要?dú)浠妮^穩(wěn)定的油。這在諸如食用油等產(chǎn)品中提供無反式脂肪的備選。
[0145]E.改變綴合的亞麻酸或亞油酸含量，諸如在W001/12800中。改變LEC1, AGP, Dekl, Superall, mi lps,及各種 Ipa 基因，諸如 Ipal, Ipa3, hpt,或 hggt。參見例如 W002/42424, W098/22604, W003/011015, W002/057439, W003/011015,美國專利 Nο.6，423，886，6，197，561，6，825，397，7，157，621，美國公開文本 N0.2003/0079247，及Rivera-Madrid, R.等,Proc.Natl.Acad.Sc1., 92:5620-5624 (1995)。
[0146]F.改變的抗氧化劑含量或組成,諸如改變生育酹或生育三烯酸(tocotrienols)。參見例如美國專利N0.6，787，683，7，154，029，W000/68393 (牽涉經(jīng)由改變?nèi)~綠基異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(PPt)操作抗氧化劑水平)；W003/082899(經(jīng)由改變尿黑酸牦牛兒基牦牛兒基轉(zhuǎn)移酶(hggt)) ο
[0147]G.改變的必需種子氨基酸。參見例如美國專利N0.6，127，600 (增加種子中必需氨基酸積累的方法)；美國專 利N0.6，080，913 (增加種子中必需氨基酸積累的二元方法)；美國專利N0.5，990，389 (高賴氨酸);美國專利N0.5，850，016 (改變種子中的氨基酸組成)；美國專利N0.5，885，802 (高甲硫氨酸);美國專利N0.5，885，801 (高蘇氨酸)；美國專利N0.6，664，445 (植物氨基酸生物合成酶);美國專利N0.6，459，019 (增加的賴氨酸和蘇氨酸)；美國專利N0.6，441，274 (植物色氨酸合酶beta亞基)；美國專利N0.6，346，403 (甲硫氨酸代謝酶);美國專利N0.5，939，599 (高硫)；美國專利N0.5，912，414 (增加的甲硫氨酸);美國專利N0.5，633，436(增加硫氨基酸含量);美國專利N0.5，559，223 (具有限定結(jié)構(gòu)的合成儲(chǔ)存蛋白，其含有可編程水平的必需氨基酸，用于改善植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值)；美國專利N0.6，194,638(半纖維素);美國專利N0.7，098，381 (UDPGdH);美國專利N0.6，194，638 (RGP);美國專利 Nos.6，399，859，6，930，225，7，179，955，及 6，803，498 ;美國公開文本N0.2004/0068767 ;W099/40209(改變種子中的氨基酸組成);W099/29882 (用于改變蛋白質(zhì)的氨基酸含量的方法)；W098/20133(具有升高的必需氨基酸水平的蛋白質(zhì))；W098/56935(植物氨基酸生物合成酶)；W098/45458 (具有較高的必需氨基酸百分比的工程化種子蛋白)；W098/42831(增加的賴氨酸)；W096/01905 (增加的蘇氨酸)；W095/15392 (增加的賴氨酸)；W001/79516; R W000/09706 (Ces A;纖維素合酶)。
[0148]用于大豆轉(zhuǎn)化的方法
[0149]已經(jīng)開發(fā)出許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括生物學(xué)和物理植物轉(zhuǎn)化方案。參見例如 Miki 等，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants, ” 于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 和 Thompson 編，CRCPress, Inc., Boca Raton, pp.67-88 (1993)。另外，用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和再生植物的表達(dá)載體和體外培養(yǎng)方法是可用的。參見例如Gruber等，“Vectors for PlantTransformation,，，于 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glickand Thompson 編,CRC Press, Inc., Boca Raton, pp.89-119(1993)。
[0150]A.土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化:一種用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中的方法基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。參見例如Horsch,等，Science, 227:1229 (1985)。根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)是遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌各自的Ti和Ri質(zhì)粒攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見例如Kado, C.1.，Crit.Rev.Plant Sc1., 10:1(1991)。土壤桿菌載體系統(tǒng)和用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法的描述由Gruber等，見上文，Miki等，見上文及Moloney,等，Plant Cell Reports, 8: 238 (1989)提供。還可見美國專利 N0.5，563，055 (Townsend 和Thomas)，1996 年 10 月 8 日公告。
[0151]B.直接的基因轉(zhuǎn)移:幾種植物轉(zhuǎn)化方法，統(tǒng)稱為直接基因轉(zhuǎn)移，已經(jīng)作為土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的備選開發(fā)。一般可適用的植物轉(zhuǎn)化方法是微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中測(cè)量為I至4μπι的微粒的表面上攜帶DNA。用將微粒加速到足以穿透植物細(xì)胞壁和膜的速度300至600m/s的生物射彈裝置將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中。Sanford等，Part.Sc1.Technol.,5:27 (1987) ;Sanford,J.C., Trends Biotech.,6:299(1988) ;Klein等，Bio/Tech.,6:559-563(1988);Sanford, J.C.，Physiol Plant,7:206(1990);Klein等，Biotechnology, 10:268(1992)。還可見美國專利 N0.5，015，580 (Christou,等)，1991年5月14日公告和美國專利N0.5，322，783 (Tomes,等)，1994年6月21日公告。
[0152]另一種將DNA物理投遞到植物的方法是超聲處理靶細(xì)胞。Zhang,等，Bio/Technology, 9:996 (1991)。或者，已經(jīng)使用脂質(zhì)體和球形體(spheroplast)融合將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。Deshayes 等，EMBO J.，4:2731 (1985) ;Christou 等，Proc Natl.Acad.Sc1.USA，84:3962 (1987)。還已經(jīng)報(bào)告了使用 CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接攝取到原生質(zhì)體中。Hain 等，Mol.Gen.Genet.，199:161 (1985)及 Draper,等，Plant CellPhysiol.，23:451 (1982)。還已經(jīng)描述了原生質(zhì)體和全細(xì)胞及組織的電穿孔(Donn,等，InAbstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p.53(1990) ;D，Halluin,等，Plant Cell, 4:1495-1505 (1992);及 Spencer,等，Plant Mol.Biol.，24:51-61 (1994))。
[0153]在轉(zhuǎn)化大豆靶組織后，上文描述的選擇標(biāo)志物基因的表達(dá)容許優(yōu)先選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織、和/或植物，其使用本領(lǐng)域中公知的再生和選擇方法進(jìn)行。
[0154]前述轉(zhuǎn)化方法通常會(huì)用于生成轉(zhuǎn)基因品種。然后，可以將轉(zhuǎn)基因品種與另一種(非轉(zhuǎn)化的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的)品種雜交，以生成新的轉(zhuǎn)基因品種。或者，可以使用植物育種領(lǐng)域中公知的傳統(tǒng)回交技術(shù)將已經(jīng)使用前述轉(zhuǎn)化技術(shù)工程化改造到特定大豆系中的遺傳性狀移到另一種品系中。例如，可以使用回交方法將工程化性狀從公共的、非良種品種移到良種品種中，或者從在其基因組中含有外來基因的品種移動(dòng)一種或多種不含所述基因的品種中。如本文中使用的，根據(jù)上下文，“雜交”可以指簡(jiǎn)單的X與I雜交或者回交過程。[0155]經(jīng)由SSR和第一代后代得到的遺傳標(biāo)志物概況(Profile)
[0156]在表型觀察外，植物也可以通過其基因型鑒定。植物的基因型可以經(jīng)由可鑒定同一品種或相關(guān)品種的植物，或者用于測(cè)定或確認(rèn)譜系的遺傳標(biāo)志物概況表征。遺傳標(biāo)志物概況可以通過諸如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、任意引發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增指紋法(DAF)、序列表征的擴(kuò)增區(qū)(SCAR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)(其又稱為微衛(wèi)星)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)等技術(shù)獲得。例如參見 Cregan 等，“An Integrated Genetic Linkage Map of the SoybeanGenome,，，Crop Science, 39:1464-1490 (1999)和 Berry,等，“Assessing Probabilityof Ancestry Using Simple Sequence Repeat Profiles:Applications to Maize InbredLines and Soybean Varieties,’’Genetics, 165:331-342 (2003),每篇通過提及完整收入本文。
[0157]用于這些目的的特定標(biāo)志物不限于任何特定組的標(biāo)志物，但是設(shè)想包括提供區(qū)別品種的手段的任何類型的標(biāo)志物和標(biāo)志物概況。
實(shí)施例
[0158]實(shí)施例中列出的數(shù)據(jù)集證明無融合生殖大豆植物7B1和S-201，以及通過雜交作為雄性或雌性親本的無融合生殖系7B1或S-201與許多不同雌性或雄性大豆系，或者通過自交獲得的無融合生殖大豆植物選擇的突出性狀和特征。在2007-2011年在印地安那州的Brookston實(shí)施雜交和評(píng)估。將植物雜交，并容許在雌性植物上結(jié)種子,然后,種植種子,并對(duì)所得的植物觀察和選擇；這些雜交和/或選擇的觀察結(jié)果用于形成下文的表。如實(shí)施例和所附表中顯示的，生成的無融合生殖大豆植物表明非常好的豆莢計(jì)數(shù)和雜合優(yōu)勢(shì)。
[0159]實(shí)施例1:通過93χ17Χ7Β1雜交生成的無融合生殖大豆。
[0160]以下實(shí)施例描述了`通過雜交雄性無融合生殖系7B1與雌性大豆系93x17生成的無融合生殖大豆植物的性狀。如表1中顯示的，欄I中列出了使用的育種雜交，欄2中列出了以英寸計(jì)的植物高度，欄3中列出了主莖(MS)上的節(jié)數(shù)目，欄4中列出了主莖(MS)上的豆莢數(shù)目，欄5列出了主莖(MS)上的每個(gè)節(jié)的豆莢平均數(shù)目，欄6中列出了每個(gè)植物的節(jié)總數(shù)，欄7中列出了每個(gè)植物的豆莢總數(shù)，且欄8中列出了按總節(jié)的總豆莢的平均數(shù)目。
[0161]表1
[0162]
植物平均
育種雜交高度:ms豆總節(jié)總豆莢?
(i,) ^ ^ 莢/節(jié)m
93x17 X 7B1 24 14 131 9.3 65 419 6.5
[0163]實(shí)施例2:無融合牛殖大豆系7B1的單一棺物詵擇
[0164]以下實(shí)施例描述了稱作7B1標(biāo)簽7-2(其是自用于去雄研究的第7個(gè)植物且來自生成的第二個(gè)豆莢的單一植物選擇)的無融合生殖大豆植物7B1的單一植物選擇的性狀。如表2中顯示的，欄I中列出了植物，欄2中列出了以英寸計(jì)的植物高度，欄3中列出了主莖(MS)上的節(jié)數(shù)目，欄4中列出了主莖(MS)上的豆莢數(shù)目，欄5中列出了主莖(MS)上的每個(gè)節(jié)的豆莢平均數(shù)目，欄6中列出了每個(gè)植物的節(jié)總數(shù)，欄7中列出了每個(gè)植物的豆莢總數(shù)，且欄8中列出了按總節(jié)的總豆莢的平均數(shù)目。
[0165]表2
[0166]
【權(quán)利要求】
1.一種生成大豆無融合生殖(apomictic)植物的方法，所述大豆無融合生殖植物比商業(yè)大豆品種展現(xiàn)出更大的百分比轉(zhuǎn)化(conversion)和每個(gè)植物更大數(shù)目的豆莢，所述方法包括下列步驟: a.選擇多個(gè)雙胚珠種子； b.將所述種子種植成大豆植物；和 c.選擇具有大于約51%的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢的大豆植物，其中生成大豆無融合生殖植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中選擇具有大于約60%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中選擇具有每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢的植物。
4.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟: a.將選擇的無融合生殖大豆植物作為雄性與作為雌性的不同大豆植物雜交育種； b.從所述雌性大豆植物收獲種子； c.種植來自所述雌性大豆植物的所述種子；和 d.選擇具有大于約51%的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢的大豆植物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中選擇具有大于約60%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中選擇具有每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢的植物。
7.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟:` a.將選擇的無融合生殖大豆植物作為雌性與作為雄性的不同大豆植物雜交育種； b.從所述雌性大豆植物收獲種子； c.種植來自所述雌性大豆植物的所述種子；和 d.選擇具有大于約51%的百分比轉(zhuǎn)化和每個(gè)植物至少60個(gè)豆莢的大豆植物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中選擇具有大于約60%的百分比轉(zhuǎn)化的植物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中選擇具有每個(gè)植物至少100個(gè)豆莢的植物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有有限生長(zhǎng)習(xí)性(determinate growth habit),并且適合于成熟期組(maturity group) V 到 X。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有約51%和約70%之間的百分比轉(zhuǎn)化。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有約70%和約90%之間的百分比轉(zhuǎn)化。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有約90%和約100%之間的百分比轉(zhuǎn)化。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物約60和約100個(gè)之間的豆莢。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物約100和約200個(gè)之間的豆莢。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物約200和約300個(gè)之間的豆莢。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物約300和約400個(gè)之間的豆莢。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物具有每個(gè)植物大于400個(gè)豆莢。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述無融合生殖大豆植物是在ATCC登錄號(hào)PTA-11892下保藏的品種S-201的。
20.通過權(quán)利要求1的方法生成的無融合生殖大豆植物。
21.一種無融合生殖大豆種子，其中所述種子由權(quán)利要求20的無融合生殖大豆植物生成。
22.大豆品種S-201的無融合生殖大豆植物,所述大豆品種的代表性種子已經(jīng)在ATCC登錄號(hào)PTA-11892下保藏。
23.一種無融合生殖大豆植物，其中所述無融合生殖大豆植物是權(quán)利要求22的大豆品種S-201的后代。
24.大豆品種S-201的種子，所述大豆品種的代表性種子已經(jīng)在ATCC登錄號(hào)PTA-11892 下保藏。
25.一種生成大豆種子的方法，所述方法包括將權(quán)利要求22的無融合生殖大豆品種與自身或第二大豆植物雜交，并收獲所得的種子。
26.—種生成雜種大豆種子的方法，所述方法包括將權(quán)利要求22的植物與獨(dú)特的第二大豆植物雜交，并收獲所得的F1雜種種子。
27.通過權(quán)利要求26的方法生成的F1雜種種子?！?br> 28.無融合生殖大豆植物或其部分，其通過種植權(quán)利要求27所述的種子生成。
29.—種將期望的性狀引入權(quán)利要求22的無融合生殖大豆植物中的方法，所述方法包括導(dǎo)入賦予所述期望的性狀的轉(zhuǎn)基因，其中所述期望的性狀選自下組:雄性不育、除草劑耐受性、昆蟲或有害生物抗性、疾病抗性、經(jīng)修飾的脂肪酸代謝、經(jīng)修飾的碳水化合物代謝和經(jīng)修飾的大豆纖維特征。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述期望的性狀是除草劑耐受性，且對(duì)選自下組的除草劑賦予所述耐受性:草甘膦(glyphosate)、磺酰脲(sulfonylurea)、咪唑啉酮(imidazalinone)、麥草畏(dicamba)、草丁憐(glufosinate)、勝絲菌素(phosphinothricin)、苯氧基丙酸(phenoxy proprionic acid)、環(huán)己燒(cycloshexone)、三嗪(triazine)、苯基氰(benzonitrile)和溴草臆(broxynil)。
31.一種通過權(quán)利要求29的方法生成的植物，其中所述植物具有所述期望的性狀。
32.—種生成源自權(quán)利要求22的無融合生殖大豆植物的近交大豆植物的方法，所述方法包括下列步驟: a.通過雜交所述大豆品種S-201的植物與第二品種的大豆植物來生成源自大豆品種S-201的后代植物； b.將所述后代植物與自身或第二植物雜交以生成后續(xù)世代的后代植物的種子； c.從所述種子種植出后續(xù)世代的后代植物，并將所述后續(xù)世代的后代植物與自身或第二植物雜交；和 d.重復(fù)最后兩個(gè)步驟，直到生成源自所述大豆品種S-201的近交大豆植物。
33.一種生成商品植物產(chǎn)品的方法，其包括獲得權(quán)利要求22的無融合生殖大豆植物或其部分，并自其生成所述商品植物產(chǎn)品。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述商品植物產(chǎn)品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、大豆莢(soybean hull)、粗粉(meal)、面粉(flour)或油。
35.大豆品種的大豆植物，其具有每千個(gè)種子介于約I至約5個(gè)之間的雙胚珠種子的雙胚珠種子頻率的特征，其中所述雙胚珠種子頻率由突變體等位基因APl賦予，含有所述突變體等位基因的種子的代表性樣品在ATCC登錄號(hào)PTA-11892下保藏。
36.權(quán)利要求35的大豆植物，其中所述雙胚珠種子頻率是每千個(gè)種子介于約I至約4個(gè)之間的雙胚珠種子。
37.權(quán)利要求35的大豆植物，其中所述雙胚珠種子頻率是每千個(gè)種子介于約I至約3個(gè)之間的雙胚珠種子。
38.權(quán)利要求35的大豆植物，其中所述雙胚珠種子頻率是每千個(gè)種子介于約I至約2個(gè)之間的雙胚珠種子。
39.權(quán)利要求35的大豆植物，其中所述雙胚珠種子頻率平均是每千個(gè)種子約1.3個(gè)雙胚珠種子。
40.權(quán)利要求35的大豆植物，其中所述植物具有別的無融合生殖特征。
41.權(quán)利要求36的大豆植物，其中所述植物具有別的無融合生殖特征。
42.權(quán)利要求37的大豆植物，其中所述植物具有別的無融合生殖特征。
43.權(quán)利要求38的大豆植物，其中所述植物具有別的無融合生殖特征。
44.權(quán)利要求39的大豆植物，其中所述植物具有別的無融合生殖特征。
45.從來自權(quán)利要求22的植物的原生質(zhì)體或細(xì)胞生成的組織培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞或原生質(zhì)體從選自下組的植物部分生成:葉、花粉、胚珠、胚、子葉、下胚軸、分生細(xì)胞、根、根尖、雌蕊、花藥、花、種子、 枝條、莖、豆莢和葉柄。
46.從權(quán)利要求45的組織培養(yǎng)物再生的大豆植物。
47.大豆種子，其含有稱作APl的突變體等位基因，其中含有所述等位基因APl的種子的代表性樣品在ATCC登錄號(hào)PTA-11892下保藏。
48.通過種植權(quán)利要求47的種子生成的大豆植物或其部分。
49.一種有限無融合生殖大豆植物，其在與美國成熟期組V到X中種植的商業(yè)大豆品種相比時(shí)具有增加的產(chǎn)率。
【文檔編號(hào)】A01H5/10GK103826446SQ201280033462
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月6日
【發(fā)明者】喬治.R.泰勒 申請(qǐng)人:科納維斯有限責(zé)任公司