用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)的水解和發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，包括：a）部分水解發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物，其中部分水解將非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體；b）發(fā)酵部分水解的原料或非乙醇副產(chǎn)物中的可溶性低聚物和單體以產(chǎn)生乙醇；c）回收從步驟b）發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物來生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品，更具體地為具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分水平的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。本發(fā)明還公開了一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，包括：a）部分水解對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物，其中部分水解將非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體；b）回收來自步驟a）的所述部分水解的產(chǎn)物以除去可溶性低聚物和單體，從而生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品，更具體地為具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分水平的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。該方法借助降低的戊糖水平、增加的相對(duì)蛋白質(zhì)濃度、降低相對(duì)的纖維濃度、降低的可溶性低聚物和單體水平或降低的還原糖水平，生產(chǎn)具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分水平的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
【專利說明】用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)的水解和發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法以及動(dòng)物飼料產(chǎn)品。尤其是，本發(fā)明涉及依賴于水解發(fā)酵原料或發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物的方法，以及可選地發(fā)酵，來改進(jìn)所生成的動(dòng)物飼料產(chǎn)品的營養(yǎng)成分。
【背景技術(shù)】
[0002]已有研究工作來開發(fā)微生物，其包括嗜熱地芽孢桿菌微生物，以由混合的戊糖和己糖或單獨(dú)戊糖來生產(chǎn)生物乙醇。W02007/110606描述了用一種編碼NAD連接甲酸脫氫酶的基因轉(zhuǎn)化的嗜熱微生物，以使乙醇生產(chǎn)最大化。W02006/117536和W002/29030都描述了攜帶一種失活的乳酸脫氫酶基因的嗜熱微生物。
[0003]Linde (生物資源技術(shù)，Bioresource Technology99 (2008) 6506-6511)研究了，通過施加熱處理然后對(duì)從淀粉-乙醇工廠中工藝物料流中得到的料漿的殘留的無淀粉纖維素和半纖維素餾分進(jìn)行酶水解，理論上增加了乙醇的產(chǎn)量。所研究的該工藝料漿是發(fā)酵前和發(fā)酵后的面粉，淀粉糖化后的漿液。與只用淀粉相比，假設(shè)發(fā)酵額外的分離的戊糖和己糖，理論上乙醇的產(chǎn)量可以實(shí)現(xiàn)14%的增長。半纖維素的水解產(chǎn)生大比例的戊糖，而纖維素的水解產(chǎn)生易發(fā)酵為乙醇的葡萄糖。戊糖需要目前沒有用于工業(yè)過程中的戊糖發(fā)酵酵母。Linde方法的實(shí)施只考慮了使乙醇產(chǎn)量最大化。
[0004]Cookman (生物資源技術(shù)，Bioresource TechnologylOO (2009) 2012-2017)研究了從酒糟(DG)中提取油和蛋白質(zhì)來得到更高價(jià)值的富含蛋白質(zhì)的產(chǎn)品的可行性。蛋白質(zhì)提取以含水乙醇、堿性乙醇和水酶處理為基礎(chǔ)。留下的碳水化合物準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖。不需要檢查回收的蛋白質(zhì)來確定其價(jià)值。
[0005]Misailidis (化學(xué)工程研究與設(shè)計(jì)，Chemical Engineering Research andDesign87 (2009) 1239-1250)研究了用來自小麥的乙醇聯(lián)合生產(chǎn)阿拉伯木聚糖(AX)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)可行性。模擬了三種方案:以DDGS為主要副產(chǎn)品的傳統(tǒng)的小麥到生物乙醇的生產(chǎn)；伴隨有AX生產(chǎn)的生物乙醇生產(chǎn)，使用傳統(tǒng)的錘式粉碎和篩分來回收用于AX提取的麩；和使用粉粒技術(shù)來回收用于AX提取的麩。將通過粉粒移除的麩直接送到DDGS是不經(jīng)濟(jì)的。
[0006]Srinivasan (生物資源技術(shù)，Bioresource TechnologylOO (2OO9) 354S-3555)描述了一種用于從DDGS中除去纖維的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的篩分和風(fēng)選工藝。
[0007]US2010/0196979描述了廢啤酒糟作為生產(chǎn)乙醇和其它產(chǎn)品如牲畜飼料的生物質(zhì)源的用途。
[0008]W02010/107944涉及木質(zhì)纖維素材料向可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化和由其生產(chǎn)的其它產(chǎn)品如動(dòng)物飼料。
[0009]US6, 444，437涉及一種將農(nóng)村生物質(zhì)和其它纖維素材料轉(zhuǎn)化為富含蛋白的動(dòng)物飼料添加劑的兩步法。
[0010]US2003/0232109描述了一種以在前段的去殼和去芽步驟為基礎(chǔ)，從玉米胚乳生產(chǎn)聞度易消化的聞蛋白廣品的方法。[0011]W082/01483涉及一種從廢料回收有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)的方法和裝置。
[0012]W02005/079190涉及溶解淀粉和加強(qiáng)纖維中纖維素的酶消化性的預(yù)處理步驟。
[0013]US2010/0167367描述了從多種纖維素的原材料中回收乙醇的方法。
[0014]W02009/079183涉及發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物的纖維素發(fā)酵的使用以提高飼料混合物中的蛋白質(zhì)水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]許多用于動(dòng)物飼料的副產(chǎn)品動(dòng)物飼料材料，如干酒糟和可溶物(DDGS)、麥麩、玉米纖維和甜菜渣，并沒有與其它動(dòng)物飼料產(chǎn)品如大豆粉一樣被有效地利用。原因在于它們有:更低的蛋白含量；更高的纖維含量；高水平的可溶性非淀粉多糖(NSPs)以及含有還原糖。
[0016]該高纖維含量降低了豬和禽類中的蛋白可消化性和代謝能量。較高的NSPs水平引起豬后腸中的發(fā)酵，其限制了豬和禽類中的DDGS包含率。由于該DDGS或麩干燥過程中的美拉德反應(yīng)(Maillard reaction),在DDGS和麩中的還原糖,如葡萄糖、麥芽糖和阿拉伯糖，引起賴氨酸的降解(一種必需氨基酸)。
[0017]
【發(fā)明者】已發(fā)明了一種方法，其目的是控制乙醇的額外發(fā)酵的程度(除了在現(xiàn)有的生物乙醇生產(chǎn)工藝中進(jìn)行的)，以提升該副產(chǎn)品流(來自現(xiàn)有的生物乙醇生產(chǎn)工藝)的動(dòng)物飼料品質(zhì)。因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，該方法包括:
[0018]a)部分水解發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物，該部分水解將非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體；
[0019]b)發(fā)酵該部分水解的發(fā)酵原料或非乙醇副產(chǎn)物中的可溶性低聚物和單體，以產(chǎn)生乙醇；
[0020]c )回收從步驟b )中發(fā)酵的該非乙醇副產(chǎn)物以生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品，更具體地為具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
[0021]該方法也可以被認(rèn)為是一種提升動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，特別地為一種發(fā)酵處理中聯(lián)合生產(chǎn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
[0022]在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明也提供了 一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，具體地為一種具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分的動(dòng)物飼料產(chǎn)品，該方法包括:
[0023]a)部分水解對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行的發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物，其中，該部分水解將非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體。
[0024]b)回收從步驟a)中部分水解的產(chǎn)物以除去該可溶性低聚物和單體，從而生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品，更具體地為具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
[0025]這個(gè)方法可以被認(rèn)為是其中一種較普遍方法，其直接對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行的發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物進(jìn)行。因此，該方法可以作為一種提升作為發(fā)酵處理的副產(chǎn)品生產(chǎn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品的手段，且被包括在現(xiàn)有的生物乙醇生產(chǎn)加工的“后段”。部分水解之后回收該部分水解的產(chǎn)物，其中不包括釋放的還原糖，這改進(jìn)了該動(dòng)物飼料產(chǎn)品的相對(duì)營養(yǎng)成分。
[0026]可以將該釋放的可溶性低聚物和單體發(fā)酵為乙醇。因此在一些具體實(shí)施方案中，該方法在步驟a)和b)之間進(jìn)一步包括:發(fā)酵部分水解的非乙醇副產(chǎn)物中的可溶性低聚物和單體以生產(chǎn)乙醇。在這樣的實(shí)施方案中，對(duì)發(fā)酵的該非乙醇副產(chǎn)物進(jìn)行步驟b)。在可選的實(shí)施方案中，該可溶性低聚物和單體可以簡(jiǎn)單地從該部分水解產(chǎn)物的殘?jiān)蟹蛛x而不是發(fā)酵。例如，可以通過離心分離不可溶產(chǎn)物來生產(chǎn)該固體動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
[0027]在本發(fā)明的方法中可以使用任何合適的發(fā)酵原料。存在許多生物乙醇工廠，其中一些材料被發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇。在具體的實(shí)施方案中，該發(fā)酵原料包括含半纖維素材料，特別是植物材料。合適的實(shí)例包括玉米、小麥、大麥和甜菜渣。本發(fā)明可以依賴于能夠發(fā)酵來自植物材料的半纖維素糖的嗜熱微生物。該原料可以額外地或可選地包括含纖維素材料。因此，可以發(fā)酵戊糖和/或己糖。
[0028]本發(fā)明依賴發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物或可能同時(shí)包括兩者的部分水解，其中部分水解將非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體。該水解是部分的，其代表一種重要的平衡，以確保相比于那些沒有水解的方法改進(jìn)了乙醇產(chǎn)量，同時(shí)允許動(dòng)物飼料產(chǎn)品的提升。同樣，通過最大化水解來最大化乙醇產(chǎn)量，這可能對(duì)該動(dòng)物飼料產(chǎn)品的質(zhì)量不利。同樣地，大量的水解可能一定程度上增加方法成本以致其變得不經(jīng)濟(jì)。因此，在具體的實(shí)施方案中，該部分水解包括該非淀粉多糖(存在于發(fā)酵處理的發(fā)酵原料乙醇副產(chǎn)物中)相當(dāng)于大約 75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15% 或大約 10% 的水解。
[0029]該部分水解可以通過任何合適的方法進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，該部分水解通過化學(xué)方法和/或酶促方法進(jìn)行。典型地，如果使用化學(xué)水解，將需要在不同反應(yīng)條件下分別進(jìn)行發(fā)酵。在一些實(shí)施方案中，特別是進(jìn)行酶促水解的實(shí)施方案中，該部分水解和發(fā)酵可以同時(shí)進(jìn)行。這種方法可以被稱為同時(shí)糖化發(fā)酵法(SSF)。在一些實(shí)施方案中，也可以進(jìn)行化學(xué)方法和酶促水解的組合。
[0030]可以在任何合適的條件下進(jìn)行化學(xué)部分水解。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)部分水解使用酸。在具體的實(shí)施方案中，該酸包括或基本上由或由硫酸、硝酸或鹽酸組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地確定采用適量的濃酸來達(dá)到期望的水解水平。在具體的實(shí)施方案中，采用濃度為大約1-10%的酸，或更具體地，0.5-5%的酸。本文描述了適宜的酸水解條件。
[0031]也可以在適宜的溫度下進(jìn)行部分水解。高于室溫(或環(huán)境溫度)的溫度可以促進(jìn)該水解過程。因此，在具體的實(shí)施方案中，在大約50到200攝氏度之間的溫度下進(jìn)行(化學(xué))部分水解，更具體地，在大約100到150攝氏度之間，或甚至更具體地，在大約120-140攝氏度之間。因此，酸可以用于在這些溫度的任一溫度下水解該發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物。
[0032]同樣地，該部分水解進(jìn)行適當(dāng)?shù)臅r(shí)間以確保達(dá)到非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體的期望的水平。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)部分水解進(jìn)行大約10分鐘到5小時(shí)之間的時(shí)間，更具體地，大約20分鐘到3小時(shí)之間，或甚至更具體地，大約30分鐘到120分鐘之間。因此，酸可以用來在這些時(shí)間段中的任一時(shí)間段水解該發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物。
[0033]酶水解可以代替化學(xué)水解或與化學(xué)水解一起進(jìn)行。如果結(jié)合使用這兩種方法，則它們可以同時(shí)地、順序地或單獨(dú)地進(jìn)行。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，根據(jù)使用的方法需要相應(yīng)地調(diào)整溫度、時(shí)間和濃度條件。例如，酶在低溫下可能不能有效地進(jìn)行，在高溫下可能(不可逆地)變性。使用的酶的類型將取決于該發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物的性質(zhì)。通常采用糖苷酶。在具體的實(shí)施方案中，使用半纖維素酶和/或纖維素酶進(jìn)行酶水解。這樣的酶的具體實(shí)例包括多糖水解酶、E.C.3.2.1和/或纖維素酶例如內(nèi)切葡聚糖酶和葡糖苷酶。[0034]與源發(fā)酵原料一致，該非淀粉多糖可以包括、基本上由或由半纖維素組成。在具體的實(shí)施方案中，該非淀粉多糖包括至少大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的半纖維素。同樣地，在具體的實(shí)施方案中，該非淀粉多糖包括至少大約10%、20%、30%，、40%、50%、60%、70%、80%或90%的纖維素。在一些實(shí)施方案中，纖維素和半纖維素可以組成非淀粉多糖的全部。取決于原料的來源例如果膠、葡聚糖、樹膠和菊粉，可以存在其它多糖。
[0035]如本文進(jìn)一步的詳細(xì)描述，本發(fā)明的方法可以特別地適合于允許戊糖的發(fā)酵。因此，在一些實(shí)施方案中，部分水解生成可溶性低聚物和單體，其包括、基本上由或由戊糖組成。本發(fā)明優(yōu)選的微生物能夠發(fā)酵戊糖和己糖兩者，且可溶性低聚物和單體通常包括戊糖和己糖兩者。在具體的實(shí)施方案中，該戊糖包括、基本上由或由木糖和/或阿拉伯糖組成?？扇苄缘途畚锟梢园ǘ抢缋w維二糖。
[0036]如上所述，發(fā)酵原料的發(fā)酵生成乙醇和非乙醇副產(chǎn)物。圖1示意性地示出。因此該方法提供了可以進(jìn)行該部分水解以釋放多余的糖的多種情況，多余的糖包括降低動(dòng)物飼料副產(chǎn)品的質(zhì)量的還原糖，且其可以通過發(fā)酵或其他方式除去。如上所述，可以在合適的階段對(duì)該發(fā)酵原料進(jìn)行該方法，如制粉前或制粉后、或與水混合前、與水混合后或與水混合時(shí)，或甚至在發(fā)酵期間。當(dāng)對(duì)發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物進(jìn)行該方法時(shí)，部分水解可以在發(fā)酵發(fā)生后的任何階段進(jìn)行。因此，在具體的實(shí)施方案中，步驟a)中對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物是或來源于乙醇生產(chǎn)的蒸餾殘?jiān)蚋s物。在具體的實(shí)施方案中，可以對(duì)該釜餾物進(jìn)行部分水解，其可以包括、基本上由或由稀釜餾物和/或稠釜餾物組成。
[0037]如上所述，在部分水解該發(fā)酵原料或?qū)Πl(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物之后，部分水解的原料或(發(fā)酵的)非乙醇副產(chǎn)物中的可溶性低聚物或單體被發(fā)酵生成乙醇。合適的發(fā)酵步驟在本領(lǐng)域技術(shù)中是熟知的，且可以容易地應(yīng)用以優(yōu)化乙醇生產(chǎn)。如本文所探討的，發(fā)酵通常是厭氧的，但在一些實(shí)施方案中可以在部分有氧條件下進(jìn)行。如上所述，該發(fā)酵可以包括戊糖的發(fā)酵。因此，在具體的實(shí)施方案中，使用能夠發(fā)酵戊糖的微生物來進(jìn)行發(fā)酵，該微生物可以是例如細(xì)菌或酵母。在更具體的實(shí)施方案中，使用嗜熱微生物來進(jìn)行發(fā)酵，具體為能夠發(fā)酵戊糖的嗜熱細(xì)菌。該嗜熱細(xì)菌可以缺乏乳酸脫氫酶活性。以前已證明乳酸缺陷突變體能夠生產(chǎn)增長的乙醇產(chǎn)量。滅活I(lǐng)dh基因在例如W02007/110608、W002/29030和W02006/117536中描述了用于使Idh基因(編碼乳酸脫氫酶)失活的合適的方法，其每一個(gè)的相關(guān)公開的全部內(nèi)容結(jié)合于本文中。因此，可以通過插入、缺失或置換突變來使該Idh基因失活。乳酸鹽生產(chǎn)停止，并且過量的丙酮酸鹽主要轉(zhuǎn)移到生長關(guān)聯(lián)的丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)途徑。因此，該嗜熱細(xì)菌通常表達(dá)丙酮酸甲酸裂解酶。然而，在非常高的糖濃度和/或酸PH時(shí)，該P(yáng)FL途徑流量減小，然后過量的丙酮酸鹽流向基本上只產(chǎn)生乙醇和二氧化碳的厭氧丙酮酸脫氫酶(PDH)途徑。因此，獲得高乙醇產(chǎn)量的優(yōu)選條件可以是那些通過該P(yáng)FL途徑降低流量和通過該P(yáng)DH途徑增加流量的條件(Hartley，B.S.andShama, G.Proc.Roy.Soc.Lond.321，555-568(1987))?？上В谶@樣的條件下細(xì)胞可能經(jīng)歷代謝應(yīng)激，伴隨有ATP生產(chǎn)的降低與NAD/NADHT和CoA/乙酰Cok比例的潛在的不平衡。
[0038]為了解決這個(gè)可能的氧化還原狀態(tài)失衡的問題，尤其是在(部分水解產(chǎn)生的)高糖水平的條件下，在一些實(shí)施方案中，該嗜熱細(xì)菌表達(dá)異源NAD連接(或NAD依賴)甲酸脫氫酶(FDH)。許多編碼NAD連接FDH的基因在本領(lǐng)域技術(shù)中(參見實(shí)例Nanba et al (Biosc1.Biotechnol.Biochem.67 (10)，2145-2153 (2003))是已知的，并且其可以被用來轉(zhuǎn)化合適的嗜熱細(xì)菌。因此，可以用fdh基因具體為fdhl基因來轉(zhuǎn)化該嗜熱細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，該嗜熱細(xì)菌可以包含編碼耐熱NAD連接甲酸脫氫酶的基因。在其它的實(shí)施方案中，該嗜熱細(xì)菌可以用一種基因轉(zhuǎn)化，該基因的核苷酸序列已被密碼子優(yōu)化以促進(jìn)通過該嗜熱細(xì)菌的表達(dá)。在W02007/110608中對(duì)這樣的嗜熱NAD連接甲酸脫氫酶的生產(chǎn)進(jìn)行了詳細(xì)地描述，其相關(guān)公開的全部內(nèi)容結(jié)合于本文中。在具體的實(shí)施方案中，編碼NAD連接甲酸脫氫酶的基因包括、基本上由或由SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列組成。在又一實(shí)施方案中，該嗜熱細(xì)菌包含了一種密碼子優(yōu)化(用于(芽孢)桿菌中的表達(dá))且編碼耐熱NAD連接甲酸脫氫酶的基因，其包括、基本上由或由SEQ ID NO:2示出的核苷酸序列組成。除了基本的耐熱NAD連接甲酸脫氫酶序列之外，這個(gè)序列還包括啟動(dòng)子和終止子以及促進(jìn)基因克隆為合適的DNA構(gòu)建體的合適的限制性位點(diǎn)例如Xbal位點(diǎn)。
[0039]在另一實(shí)施方案中，編碼NAD連接甲酸脫氫酶的基因是fdhl基因。該fdhl基因可以源自任一合適的來源，且優(yōu)選地是用于在相關(guān)的嗜熱細(xì)菌中表達(dá)的優(yōu)化的密碼子。
[0040]因此該發(fā)酵可以利用合成的NAD連接甲酸脫氫酶，由于使用了合適的嗜熱細(xì)菌的密碼子偏好，其被設(shè)計(jì)用于最佳基因表達(dá)。該合成基因可以包含設(shè)計(jì)的限制性位點(diǎn)以幫助插入到該乳酸脫氫酶基中。因此，在單個(gè)操作中實(shí)現(xiàn)Idh基因的滅活和fdh基因的表達(dá)。在具體的實(shí)施方案中，該耐熱NAD連接甲酸脫氫酶在60°C或以上保持功能性。該耐熱酶可以通過一個(gè)核苷酸序列來編碼，該序列已被密碼子優(yōu)化以用于嗜熱細(xì)菌中的表達(dá)。該甲酸脫氫酶可以包括、基本上由或由SEQID N0:3示出的氨基酸序列組成，如W02007/110608中所描述的，其相關(guān)公開的全部內(nèi)容結(jié)合在本文中。此處，在假單孢菌屬101甲酸脫氫酶(SEQID N0:3)的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過使用用于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌的優(yōu)化的密碼子，設(shè)計(jì)了一種特定的耐熱NAD連接甲酸脫氫酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這種基本序列的衍生物將保持功能性。例如，保守的和半保守的替換可以得到耐熱NAD連接甲酸脫氫酶，并且假如這些衍生物保持有效的催化活性和熱穩(wěn)定性，使得它們?cè)谑褂檬葻峒?xì)菌的乙醇生產(chǎn)中很有用處，那么這些衍生物打算包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣地，較小的氨基酸缺失和/或添加可以產(chǎn)生保持合適的功能性的衍生物。
[0041]在一些實(shí)施方案中，為了解決這個(gè)可能的氧化還原狀態(tài)的失衡問題，可以在部分有氧條件下進(jìn)行該發(fā)酵工藝。由于也在有氧條件下進(jìn)行該P(yáng)DH途徑，該進(jìn)行主要導(dǎo)致細(xì)胞大量生產(chǎn)，因此可以通過部分曝氣(air sparging)緩解上述代謝應(yīng)激，通常以最適宜的曝氣速率進(jìn)行。適宜的曝氣速率指的是通過允許低水平流量經(jīng)過該厭氧PDH途徑(正好)足以緩解該代謝應(yīng)激的鼓泡速率。然而，低水平流量并不容許厭氧中且進(jìn)而在該工藝的厭氧PDH流量中的任何顯著下降。這意味著乙醇生產(chǎn)水平應(yīng)該沒有顯著下降。此外，由于該P(yáng)FL途徑對(duì)空氣極為敏感，該曝氣可以有另外的好處，即通過該P(yáng)FL途徑降低流量且通過該厭氧PDH途徑進(jìn)一步增加流量，但沒有使微生物置于代謝應(yīng)激下。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過在研究任何具體的發(fā)酵工藝的背景下，可以很容易確定合適的曝氣速率，該速率導(dǎo)致最佳的乙醇生產(chǎn)水平和/或使甲酸鹽和乙酸鹽的生產(chǎn)最少。曝氣可以是周期性的或連續(xù)性的，且可以相應(yīng)地調(diào)節(jié)該速率。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能認(rèn)識(shí)到，可以使用與鼓泡等同的技術(shù)使發(fā)酵暴露于有限量的空氣，從而實(shí)現(xiàn)期望的效果。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，若需要的話可以通過氧氣源來替代空氣，且相應(yīng)地改變(降低)速率。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及在最適宜的曝氣水平下從戊糖和己糖的乙醇生產(chǎn)。通過監(jiān)測(cè)氧化還原水平來實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化，在該水平下由發(fā)酵造成的甲酸鹽和乙酸鹽的水平最低，而在該工藝中實(shí)現(xiàn)相對(duì)最高的乙醇濃度水平。
[0042]在本發(fā)明的方法中可以使用任何合適的嗜熱細(xì)菌。在具體的實(shí)施方案中，該嗜熱細(xì)菌屬地芽孢桿菌，更具體地該嗜熱細(xì)菌可以屬于地芽孢桿菌(Geobaci 11 Ius)屬。在具體的實(shí)施方案中，該地芽孢桿菌包括熱葡糖苷酶地芽孢桿菌或嗜熱脂肪地芽孢桿菌，更具體地為用編碼NAD連接甲酸脫氫酶的基因轉(zhuǎn)化的熱葡糖苷酶地芽孢桿菌或嗜熱脂肪地芽孢桿菌的菌株。
[0043]同時(shí)，嗜熱細(xì)菌對(duì)乙醇耐受性低，這可以通過在發(fā)酵中定期地或連續(xù)地除去乙醇來方便地克服。這保證了發(fā)酵中的乙醇濃度維持在嗜熱細(xì)菌的乙醇耐受性以下?？梢酝ㄟ^蒸發(fā)或蒸餾從(高溫)發(fā)酵中連續(xù)地或方便地除去乙醇，例如通過薄膜和/或溫和的真空蒸發(fā)。在一些實(shí)施方案中，可以在大約40°C到80°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，例如大約50°C到70°C之間。
[0044]在本發(fā)明的方法中，通過發(fā)酵部分水解的產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明以特征的組合為基礎(chǔ)，得到來源于該發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物的改進(jìn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。在具體的實(shí)施方案中，在部分水解后或部分水解時(shí)發(fā)生的發(fā)酵步驟之后，回收該發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物，其包括:
[0045]從該蒸餾殘?jiān)虺砀s物離心分離稀釜餾物和濕濾餅(wet cake)；
[0046]蒸發(fā)該稀釜餾物；
[0047]重新結(jié)合蒸發(fā)得到的糖漿和該濕濾餅；
[0048]干燥該重新結(jié)合的材料以生產(chǎn)干制品。
[0049]在可選的實(shí)施方案中，該發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物的回收包括干燥蒸餾殘?jiān)统砀s物以生廣干制品。
[0050]通過本發(fā)明的方法中使用的發(fā)酵原料和發(fā)酵后進(jìn)行的步驟確定該動(dòng)物飼料產(chǎn)品的性質(zhì)。因此，在一些實(shí)施方案中，該動(dòng)物飼料產(chǎn)品包括酒糟(distillers grain, DG)、干酒糟(distillers dried grain, DDG)、酒糟可溶物(distillers solubles DS)、含可溶物干酒糟(distillers dried grains with solubles, DDGS)和 / 或酒柏(vinasse)。該酒柏可以是甜菜酒柏。
[0051]如本文所探討的，本發(fā)明的方法生產(chǎn)由于抗?fàn)I養(yǎng)水平的降低而具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。更具體地，通過部分水解釋放還原糖和/或戊糖，然后把這些糖發(fā)酵為乙醇，改進(jìn)了來源于該發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物的動(dòng)物飼料產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，在具體的實(shí)施方案中，(該動(dòng)物飼料產(chǎn)品的)改進(jìn)的營養(yǎng)成分包括降低的戊糖水平、相對(duì)增加的蛋白質(zhì)濃度、相對(duì)降低的纖維濃度、降低的可溶性低聚物和單體水平以及降低的還原糖水平中的一種或多種。
[0052]因此本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。同樣地，本方法還提供了作為對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的副產(chǎn)物生產(chǎn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品，其包括低于或不超過大約10%、9%、8%、7%、6%或5%重量的半纖維素，或5%、4%、3%、2%或者1%重量的戊糖例如木糖。這種動(dòng)物飼料產(chǎn)品同樣可以根據(jù)本文闡述的本發(fā)明的方法來生產(chǎn)。
[0053]參考以下非限制性實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0054]附圖簡(jiǎn)要說明
[0055]圖1是谷類生物乙醇設(shè)備后段的流程圖。
[0056]圖2是未經(jīng)處理的稀釜餾物的色譜圖。
[0057]圖3是用硝酸水解的稀釜餾物的色譜圖。[0058]圖4是未經(jīng)處理的(虛線)和硝酸處理的(實(shí)線)稀釜餾物的色譜疊加圖。
[0059]圖5是pH5.0、50°C下酶處理24小時(shí)的稀釜餾物的色譜圖。
[0060]圖6是未經(jīng)處理的(虛線)和酶處理的(實(shí)線)稀釜餾物的色譜疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0061]實(shí)施例1稀釜餾物的酸水解和酶水解
[0062]介紹
[0063]稀釜餾物通過生物乙醇工藝(Ensus)獲得。圖1示出Ensus和該工藝中生產(chǎn)稀釜餾物的點(diǎn)。示出用于該工藝的每一步驟的水分百分比含量(wt/wt)。稀釜餾物是乙醇工藝的半固體殘?jiān)?，且它是在從該殘?jiān)駷V餅后獲得。預(yù)期該稀釜餾物不含淀粉和葡萄糖，且碳水化 合物將主要是纖維素和半纖維素的殘?jiān)?。也預(yù)期在最佳條件下它的水解將從這些材料中釋放大部分的糖。
[0064]材料和方法
[0065]稀釜餾物
[0066]稀釜餾物通過Ensus從它們的乙醇工廠獲得(參見介紹部分和圖1)。
_7] 稀釜餾物的酸水解
[0068]將0.125ml的濃硝酸或0.136ml的硫酸加入到100mL含大約12.5ml稀釜餾物的Duran瓶中，在121°C水解(高壓蒸汽滅菌)30分鐘。
[0069]稀釜餾物的酶水解
[0070]按照下表1將不同水平的酶加入250ml含大約50_100ml稀釜餾物(pH調(diào)整為4或5)的錐形燒瓶中。然后將這些燒瓶在60-60C°C培養(yǎng)不同的時(shí)間。從這些燒瓶取出樣品并通過HPLC分析。
[0071]表1稀釜餾物水解中用的酶。根據(jù)稀釜餾物(TS)固體含量
[0072]8%w/v計(jì)算酶濃度。
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，所述方法是現(xiàn)有的生物乙醇生產(chǎn)工藝的一部分，包括: a)部分水解對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的非乙醇副產(chǎn)物，其中部分水解將非淀粉多糖轉(zhuǎn)化為可溶性低聚物和單體； b)發(fā)酵所述部分水解的非乙醇副產(chǎn)物中的可溶性低聚物和單體，以產(chǎn)生與現(xiàn)有的生物乙醇生產(chǎn)工藝產(chǎn)生的乙醇相比額外的乙醇； c)回收從步驟b)中所述發(fā)酵得到的非乙醇副產(chǎn)物來生產(chǎn)具有改進(jìn)的營養(yǎng)成分的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵原料包括含半纖維素的植物材料。
3.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述部分水解包括對(duì)所述非淀粉多糖進(jìn)行高達(dá)大約75%的水解。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述非淀粉多糖包括至少50%的半纖維素。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述可溶性低聚物和單體包括戊糖。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述戊糖包括木糖和/或阿拉伯糖。
7.如前述任一權(quán) 利要求所述的方法，其中步驟a)中對(duì)所述發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理得到的非乙醇副產(chǎn)物是，或來源于，乙醇生產(chǎn)的蒸餾殘?jiān)蚋s物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述釜餾物是稀釜餾物或稠釜餾物。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述動(dòng)物飼料產(chǎn)品包括酒糟、干酒糟、酒糟可溶物、含可溶物的干酒糟，或酒柏。
10.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述部分水解通過化學(xué)方法和/或酶促方法進(jìn)行。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述化學(xué)部分水解使用酸。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述酸是硫酸、硝酸或鹽酸。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中使用的所述酸的濃度為大約0.5-5%。
14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中在大約100°C到150°C之間的溫度下使用所述酸。
15.如權(quán)利要求12至14中任一所述的方法，其中使用所述酸的時(shí)間為大約20到120分鐘之間。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述酶或酶類包括半纖維素酶和/或纖維素酶。
17.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)中所述可溶性低聚物和單體的發(fā)酵在部分有氧條件下進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述部分有氧條件通過曝氣實(shí)現(xiàn)。
19.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)中所述可溶性低聚物和單體的發(fā)酵通過嗜熱細(xì)菌進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述嗜熱細(xì)菌缺乏乳酸脫氫酶活性。
21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述嗜熱細(xì)菌表達(dá)異源NAD連接甲酸脫氫酶。
22.如權(quán)利要求19至21中任一所述的方法，其中所述嗜熱細(xì)菌屬于地芽孢桿菌屬。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述地芽胞桿菌包括熱葡糖苷酶地芽孢桿菌或嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
24.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)中產(chǎn)生的所述乙醇通過蒸發(fā)或蒸餾除去。
25.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟c)中回收所述發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物包括: Ca)從所述蒸餾殘?jiān)虺砀s物中離心分離稀釜餾物和濕濾餅； (b)蒸發(fā)所述稀釜餾物； (c)重新結(jié)合蒸發(fā)得到的糖漿和所述濕濾餅； Cd)干燥所述重新結(jié)合的材料以產(chǎn)生干制品。
26.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟c)中回收所述發(fā)酵的非乙醇副產(chǎn)物包括干燥蒸餾殘?jiān)虺砀s物以產(chǎn)生干制品。
27.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述改進(jìn)的營養(yǎng)成分包括降低的戊糖水平、增加的蛋白質(zhì)濃度、降低的纖維濃度、降低的可溶性低聚物和單體水平以及降低的還原糖水平中的一種或多種。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一所述的方法生產(chǎn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品。
29.作為對(duì)所述發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵處理的副產(chǎn)物生產(chǎn)的動(dòng)物飼料產(chǎn)品，其包括低于10%重量的半纖維素或5%重量的戊糖。
30.如權(quán)利要求29所述的動(dòng)物飼料產(chǎn)品，其根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一所述的方法生產(chǎn)。
31.一種生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，其基本上如本文附圖所述。
32.—種動(dòng)物飼料產(chǎn)品，其基本上如本文附圖所述。
【文檔編號(hào)】A23K1/06GK103957726SQ201280027939
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月13日
【發(fā)明者】沃里克·理伍德, 約翰·平克尼, 穆罕默德·杰韋德, 詹姆斯·愛德華茲 申請(qǐng)人:Ensus有限公司