專利名稱：一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因原核表達產物抗病效果的檢驗方法，具體涉及一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病效果的簡易方法，屬于基因功能鑒定技術領域。
背景技術：
一般認為單細胞生物的細菌不存在信息交流的現(xiàn)象，多細胞生物間才有信息交 流。Nealson等在1970年首次報道了一種海洋費氏弧菌(Vibrio fischeri)菌體密度與生物發(fā)光呈正相關，該種菌的發(fā)光行為受細菌本身的群體感應調節(jié)系統(tǒng)所控制。1994年，F(xiàn)uqua首先提出群體感應(quorum sensing,QS)的概念,其定義是指隨著細菌個體密度的增大，細菌產生并向環(huán)境中釋放一種特殊的類似信號分子的物質，當這種信號分子積累到一定量時，調控細菌產生統(tǒng)一的群體行為，如病菌基因的表達等，這種通過細菌信號分子調控自身群體行為的現(xiàn)象就稱為細菌的群體感應。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細菌利用群體感應系統(tǒng)調控體內特定的功能。到目前為止的研究都表明，革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌都是通過信號分子調控群體某一特定功能的發(fā)揮，存在群體感應調控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)充當細菌信號分子的物質是一種有機化學分子，他是由細菌自身產生并能通過一定的途徑進入到環(huán)境中。革蘭氏陰性菌利用具有不同?；鶄孺湹母呓z氨酸內酯(acyl-homoserine lactone, AHL)作為信號分子。此外，脂肪酸衍生物如3_輕基棕櫚酸甲酯(3-hydroxypalmitic acid methyl ester)以及一些順式不飽和脂肪酸(cis-unsaturated fatty acids)也可作為信號分子。例如青枯菌(Ralstoniasolanacearum)除了產生AHL作為信號分子外，還可產生的3-羥基棕櫚酸甲酯，來充當信號分子調控青枯菌的密度效應及增殖。革蘭氏陽性菌利用一些寡肽類(AutoinducingP印tide，簡稱AIP)作為信號分子感知種內自身種群數(shù)量，協(xié)調多種基因的表達。還有一類信號分子是一種呋喃硼酸二聚酯(自體誘導子-2，autoinducer-2，簡稱AI-2)，這種信號分子屬于吲哚及其衍生物的高級結構物。此外，也有報導稱對苯二酚和
(S)-3-hydroxytridecan-4-one也是群體感應的信號分子。許多植物病原細菌通過群體感應信號分子AHL調控毒性基因的表達和毒性因子的產生。病原細菌對宿主植物的侵襲主要包括以下3個階段一是病菌對植物的侵襲和定殖，其次病原菌致病因子的產生和作用于宿主，最后就是產生對宿主的免疫抵抗。已有研究發(fā)現(xiàn)致病菌一旦失去了產生群體感應信號分子的能力，則致病性也隨之失去，如果通過外加信號分子則又可恢復其致病性，從而說明信號分子是病菌的致病性關健。在動植物病原菌中表達異源的AHL內酯酶和AHL酰胺酶均能顯著減輕致病菌的致病力，瓦解細胞密度依賴型細菌的侵染能力。許多能夠合成AHL內酯酶的細菌如蘇云金芽孢桿菌、熒光假單胞菌等或攜帶外源AHL內酯酶基因的工程菌，與致病菌歐文氏胡蘿卜軟腐病菌混合接種馬鈴薯，發(fā)病程度遠比單獨接種病原菌的減弱。因此，以病原細菌QS系統(tǒng)及其信號分子為靶標，干擾和破壞病原細菌的群體感應系統(tǒng)，能有效地減弱或解除病原細菌的致病力。這種通過破壞AHL信號分子，以干擾細菌的群體感應的方法被稱為群體粹滅(quorum quenching)。根據(jù)植物對細菌QS系統(tǒng)的反應，培育產生AHL降解酶的轉基因植物，進而猝滅病菌的群體感應，提高植物抗病性。實驗研究已表明該方法可有效地減弱病原細菌的致病力，提高寄主植物的抗病性。Dong等從Bacillus 240B1菌株中克隆到了世界上第一個AHL內酷酶(acyl-homoserine lactonase, AHL-Iactonase)基因aii兒該基因的編碼產物為一種可以水解AHL內酯鍵的酶，當植物中表達AHL內酯酶時，可水解信號分子AHL的內酯鍵，從而鈍化AHL的活性，破壞病原細菌群體感應的信號傳導系統(tǒng)，降低其致病能力。接著Lin等又在雷爾氏屬細菌也發(fā)現(xiàn)了存在這種類似基因，該基因編碼產物為?；D移酶，這種酶通過水解AHL酰胺鍵后鈍化AHL信號分子的活性。Park等從鏈霉菌中成功克隆了能產生降解AHL酶的基因ahlM,當AhlM蛋白與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時，能夠顯著抑制銅綠假單胞菌毒性因子的產生。Chen等從青枯菌GMI1000菌株中成功克隆了一個?；D移酶基因，并對其功能的研究表明，基因原核表達產物能顯著降低混合接種菌株的致病力。邱健等發(fā)現(xiàn)AiiA蛋白可以顯著降低胡蘿卜軟腐病菌胞外蛋白的產量，也能夠降解8種AHL信號分子。張霞等將aid基因轉入到一種熒光假單胞菌P303中，構建一種工程菌，該工程菌還對馬鈴薯軟 腐病和大白菜軟腐病都有一定的抑制作用。張爭等用PCR擴增獲得青枯菌GMI1000菌株的aac基因，構建原核表達載體后，經在大腸桿菌中表達得到AAC融合蛋白，將AAC融合蛋白與胡蘿卜軟腐歐氏桿菌混合后，接種于馬鈴薯塊莖，結果發(fā)現(xiàn)AAC融合蛋白能顯著降低病菌的致病力。綜上所述，關于病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病功能的檢測，未見直接與致病的青枯菌混合接種植株來檢量其抗病效果的報導。本發(fā)明操作簡便，結果準確，實用性強。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目前是提供一種病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病功能的簡易檢測方法，以篩選有效的病原菌群體猝滅基因，應用于抗病轉基因育種研究。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為
一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病效果的簡易方法，包括以下步驟
1、取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉速搖菌12 h，然后再取5 μ L菌液接種到含100 yg* mL—1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min,將離心管中沉淀菌體重懸于預冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,取上清液備用；
2、將青枯菌畫線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落，挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進行灌根接種，24 h后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹苗做對照，對照植株接種青枯菌24 h后，表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫、葉片下垂，澆水不能減輕缺水癥狀，而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無明顯的感病癥狀，說明病原菌群體猝滅基因原核表達產物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。由于采用了上述的方法，本發(fā)明具有下述的有益效果本發(fā)明所采用的方法操作簡便，結果準確，實用性強，容易實施。
具體實施例方式實施例I 一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法，具體包括以下步
驟
1、取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉速搖菌12 h。然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g -πιΓ1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min。將離心管中沉淀菌體重懸于預冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,用上清液備用；
2、將青枯菌畫線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落。挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進行灌根接種，24 h后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹苗做對照，對照植株接種青枯菌24h后，表現(xiàn)出輕微的缺水跡象，頂端葉片萎蔫、葉片下垂，燒水不能減輕缺水癥狀。而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無異常癥狀出現(xiàn)，說明病原菌群體猝滅基因原核表達產物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。實施例2
一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法，具體包括以下步
驟
1、取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉速搖菌12 h。然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g -πιΓ1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min。將離心管中沉淀菌體重懸于預冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,用上清液備用；
2、將青枯菌畫線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落，挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進行灌根接種，72 h后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹苗做對照，對照植株接種青枯菌72h后，表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫、枝條下垂，幼葉卷曲，燒水不能減輕缺水癥狀。而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無明顯的感病癥狀，說明病原菌群體猝滅基因原核表達產物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。實施例3
一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法，具體包括以下步
驟
1、取50μ L含病原菌 群體猝滅基因的陽性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉速搖菌12 h。然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g -πιΓ1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min。將離心管中沉淀菌體重懸于預冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,用上清液備用；
2、將青枯菌畫線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落。挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進行灌根接種，7天后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹苗做對照，對照植株接種青枯菌7天后，大部分幼葉枯黃，整個植株萎蔫。而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，僅有頂端幼葉表現(xiàn)輕微失水癥狀；說明病原菌群體猝滅基因原核表達產物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。總之，本發(fā)明雖然例舉了上述優(yōu)選實施方式，但是應該說明，雖然本領域的技術人員可以進行各種變化和改型，除非這樣的變化和改型偏離了本發(fā)明的范圍，否則都應該包括在本發(fā)明的保護范圍內。
權利要求
1.一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法，其特征在于包括以下步驟(1)原核表達重組蛋白液的制備取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽性重組菌接種至到5 mL含100 μ g *mL_1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉速搖菌12 h;然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g · mL-1 Amp 5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉速搖至菌液0D600為O. 6 I. O 時，加入終濃度為O. 4 mmol · Γ1的IPTG，誘導培養(yǎng)9 h，室溫下8，000 rpm離心5 min ;將離心管中沉淀菌體重懸于預冷的PBS溶液中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min，取上清液備用；(2)青枯菌液的制備將青枯菌畫線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落；挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8 cfu · mL-1的菌懸液備用；(3)灌根接種分別取上述步驟I中的原核表達重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進行灌根接種，24 h后觀察植株病癥情況；(4)對照試驗以只接種等量青枯菌的桉樹苗做對照，對照植株接種青枯菌24h后，表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫、葉片下垂，澆水不能減輕缺水癥狀；而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無明顯的感病癥狀，說明病原菌群體猝滅基因原核表達產物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法，其特征在于所述的PBS溶液中NaCl含量為150 Him0LNa2HPO4的含量為16 mmol, NaH2PO4 的含量為 4 mmol。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病能力的簡易方法，其特征在于所述的PBS溶液的pH值為7. 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢驗病原菌群體猝滅基因原核表達產物抗病效果的簡易方法，屬于基因功能鑒定技術領域，包括原核表達重組蛋白液的制備、青枯菌液的制備、灌根接種、對照試驗等步驟含病原菌群體猝滅基因的陽性重組菌經過接種、培育、破碎、離心等過程處理后得到原核表達重組蛋白上清液；將青枯菌分離出白色致病菌落，培養(yǎng)后稀釋成含菌量108cfu·mL-1的菌懸液；取上述原核表達重組蛋白液青枯菌液混合后，進行灌根接種；以只接種等量青枯菌的桉樹苗做對照，混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無明顯的感病癥狀，說明病原菌群體猝滅基因原核表達產物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生；該檢驗方法簡便，結果準確，實用性強，容易實施。
文檔編號A01G7/06GK102972220SQ201210528570
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權日2012年12月11日
發(fā)明者歐陽樂軍, 黃真池, 曾富華, 李莉梅, 李恒 申請人:湛江師范學院