專利名稱：一種蛹蟲草液體菌種的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌液體制種領(lǐng)域，特別是一種有利于促進實現(xiàn)蛹蟲草普及栽培的液體種最簡易的制備方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，與天然人參、鹿茸并列為三大滋補品。它藥性溫和，一年四季均可食用，老弱病虛皆宜，比其它種類的滋補品有更為廣泛的藥用價值。蟲草具有極高的價值，蟲其功能不斷被開發(fā)利用，如制備蟲草酒，提取蟲草菌素、蟲草多糖等。盡管蟲草、蟲草酒、蟲草菌素和蟲草多糖等產(chǎn)品的市場增長潛力巨大，但因受蟲草野生資源限制，單純利用極其有限的天然蟲草資源來生產(chǎn)加工成大量的蟲草酒、蟲草菌素、蟲草多糖等產(chǎn)品來滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需要是不現(xiàn)實的。 蛹蟲草又稱北蟲草，是蟲草屬的模式種，是與冬蟲夏草同為蟲草屬的同屬異種真菌，二者化學成分、營養(yǎng)成分和藥用功能都非常相似，其主要藥用成分蟲草素等含量遠高于野生冬蟲夏草，又由于蛹蟲草較之冬蟲夏草更易于人工栽培，因此自然而然被作為冬蟲夏草的最佳替代品而漸漸走入人們視野并受到極大關(guān)注，蛹蟲草產(chǎn)業(yè)目前已進入工廠化大面積栽培的充分發(fā)展時期。蛹蟲草人工栽培起步相對較晚，栽培技術(shù)一般是借鑒或引用常規(guī)食用菌栽培技術(shù)而改進創(chuàng)新。采用液體種因為具有滅菌時間短、培養(yǎng)周期短、菌齡短且活力強等優(yōu)點而倍受推崇，實踐也證明蛹蟲草栽培采用液體種方式更易獲得成功和高產(chǎn)，明顯優(yōu)于固體種栽培的效果。公開報道的常規(guī)液體種制備需要投資搖床、攪拌器(如電磁攪拌、氣動攪拌或者機械攪拌等)或發(fā)酵罐等設備，在搖床上培養(yǎng)的液體種菌絲體后期濃度高容易形成菌絲團或球不便于肉眼檢查清亮度，為便于噴霧接種使用時還需要使用高速攪拌器等機械方式把菌絲球打散成菌絲小片段，再進行一定倍數(shù)的稀釋，這樣雖能一定程度上提高效率但勢必增加設備投資、加大操作難度、增加污染幾率同時會使菌絲體本身的生物活性受到一定傷害。使用搖床或電磁攪拌器等不間斷振蕩培養(yǎng)方式為避免液體濺到瓶口造成污染，液體盛裝量不宜超過容器容積總量的35%，一般還要求加適量消泡劑來防止形成的泡沫溢到瓶口導致污染。液體種制備是蛹蟲草栽培步驟中最關(guān)鍵技術(shù)之一，由于受技術(shù)和設備條件限制使蛹蟲草栽培發(fā)展還只是局限在小范圍的少數(shù)人群中，這不利于蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的廣泛全面推廣普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蛹蟲草液體菌種的制備方法，該方法基于蛹蟲草菌絲體易于形成分生孢子從而在液體中具有較好的自然分散性的生物特性來簡化生產(chǎn)蛹蟲草液體種的步驟和程序，制備方法極其簡單、易于推廣。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種蛹蟲草液體菌種的制備方法，具體步驟為
將蛹蟲草液體種培養(yǎng)基裝入玻璃瓶中，每瓶裝液量占瓶總?cè)莘e的30-50%，封口滅菌，冷卻后在無菌條件下接入蛹蟲草斜面菌種，21±2°C下先靜置24-36小時再人工間歇搖瓶培養(yǎng)5-10天，待觀察靜置2小時以上的瓶中絮狀菌絲自然堆積體占整個液體體積一半以上，剔除檢驗不合格的樣品，即得到蛹蟲草液體菌種，可直接用于蛹蟲草栽培。所述的蛹蟲草液體種培養(yǎng)基由以重量份計的以下組分組成，硫酸鎂3份、磷酸二氫鉀6份、蛋白胨16份、葡萄糖32份、維生素B1凈含量O. 02份，水2000份。所述的玻璃瓶為廣口瓶、三角瓶或菌種瓶，瓶體的容積< 1000毫升，要便于人工搖瓶和接種操作。所述玻璃瓶要求透明度高，能耐高溫蒸煮，具有便于固定封口薄膜或紙的突出邊線，使用棉塞或硅氟透氣塞時瓶口大小要配套適中。 所述封口步驟采用棉花塞、硅氟透氣塞、耐高溫無毒薄膜或無菌封口膜。采用耐高溫無毒薄膜或無菌封口膜封口時，還需用耐高溫橡皮圈或者細繩扎口密封。采用棉花塞或者硅氟透氣塞進行封口時，用牛皮紙或多層報紙將塞齊瓶口一起包裹起來，然后用耐高溫橡皮筋或棉線索扎緊。所述人工間歇搖瓶方式為白天每2-3個小時搖瓶一次，晚上到第二天早上可間隔6-10小時再搖，搖瓶時用右手或左手持瓶身由慢到快旋轉(zhuǎn)搖動，使瓶內(nèi)液體隨之旋轉(zhuǎn)起來保持30秒以上即可，達到增氧和分散菌絲體的作用。搖瓶時注意不要用手直接抓拿瓶口封口處以免瓶口松動進入雜菌，而且不要使瓶內(nèi)液體濺起到封口膜或塞上。所述檢驗時，需待瓶靜止2小時以上再通過光照肉眼檢查，剔除霧狀渾濁的樣品，同時可輔以顯微鏡觀察微觀狀況和鼻聞、口嘗菌液味道判斷其是否合格。光照檢驗，即在每次搖瓶前先用手電筒等明亮集中光源對著瓶壁透過瓶身從對面用肉眼迎光觀察液體是否清亮透明，如果出現(xiàn)霧狀渾濁表明樣品被細菌污染，則將該樣品剔除；如果觀察菌液表面出現(xiàn)綠色、黑色等真菌孢子時證明受到真菌感染也應該剔除；光照檢驗合格時，有條件的還可進行鏡檢，即通過無菌制片顯微鏡下觀察是否有少量非培養(yǎng)蛹蟲草菌株外的其它真菌孢子或細菌存在，如發(fā)現(xiàn)異常該樣品也需剔除；另外還可通過嗅覺和味覺判斷其氣和味是否正常，遇不正常的樣品，亦剔除。當瓶體靜止2小時以上觀察瓶中菌液自然懸浮堆積的絮狀菌絲量達到液體體積一半以上時，培養(yǎng)即完成，此時菌絲量合適無需稀釋和機械打碎，菌絲生理活性也是最高，萌發(fā)最快。所述蛹蟲草栽培時接種后5-10天的暗光培養(yǎng)期溫度需控制在18±1°C。蛹蟲草液體菌種進行栽培接種時，先用來蘇爾等消毒液對玻璃瓶外表及封口物作表面噴霧消毒，然后搖勻種液稍靜置在無菌條件開啟封口物，用75%的酒精棉球?qū)ζ靠谧鞑潦孟荆僭诰凭珶艋鹧嫔线^火燒燙殺菌，待瓶口冷卻后直接將液體種倒入事先消毒或滅菌好的液體噴霧器中，注意緩慢傾倒，防止老接種塊和表面菌皮進入噴霧器中堵塞噴霧頭；以重量份計，取蠶蛹粉I份、大米35份和營養(yǎng)液50份置于培養(yǎng)瓶或盆中，混和封口后滅菌，冷卻至18±1°C，在無菌條件下噴霧接入蛹蟲草液體菌種；接種后的培養(yǎng)瓶或盆在18土1°C避光培養(yǎng)10天左右，待蛹蟲草菌絲完全封面吃料后再進行光照刺激培養(yǎng)出草，待蛹蟲草子座生長成熟后采收，在殘余培養(yǎng)基表面補噴清水或營養(yǎng)液蓋好薄膜重復前述管理可以收獲第二或三批蛹蟲草子實體。常用方法制備蛹蟲草液體菌種時，需要添置搖床、攪拌機、甚至空氣過濾系統(tǒng)及發(fā)酵等設備設施，培養(yǎng)基需要添加消泡劑，所培養(yǎng)的液體種后期還需要打碎菌絲團或球并稀釋，這都勢必增加投資成本、感染機率和操作難度。本發(fā)明的有益效果為
I)根據(jù)蛹蟲草菌絲體易于形成分生孢子在液體中具有較好自然分散性的生物學特點，從而把蛹蟲草液體菌種的制作方法簡化。2)通過本發(fā)明提供的方法制備的蛹蟲草液體菌種，及時使用能保證菌絲的良好分散性及活性，生產(chǎn)過程中不需要搖床及其它機械攪拌設備，并且人工搖瓶頻率低盛裝液體量可從占瓶總?cè)莘e30%增大到50%左右，無需使用消泡劑，樣品中菌絲濃度適中便于肉眼迎光檢查清亮度，亦無需攪拌打碎、稀釋等繁瑣操作，大大簡化操作步驟。3)本方法直接使用一級種轉(zhuǎn)擴培養(yǎng)栽培用液體種，相比常規(guī)的方法減少了傳代次數(shù)，大大縮短菌種培養(yǎng)時間同時有利于減少菌株變異。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明不受其限制。取硫酸鎂3份、磷酸二氫鉀6份、蛋白胨16份、葡萄糖32份、維生素B1 O. 02份，水2000份，混合均勻，得蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)基。實施例I :蛹蟲草液體菌種的制備方法
將保存在冰箱的引進斜面母種用PDA加富培養(yǎng)基24±2°C活化培養(yǎng)后挑選8支備用。量取250ml蛹蟲草液體種培養(yǎng)基注入750ml廣口瓶中，共計分裝60瓶，用耐高溫無菌封口膜箍耐高溫橡皮圈封口，通過高壓鍋按常規(guī)程序滅菌，冷卻至21 ±2°C，在無菌條件下采用無菌操作接入蛹蟲草斜面菌種，每支斜面菌種接液體種7-8瓶，21±2°C先靜置24小時，然后每天白天間隔2-3小時將廣口瓶旋搖30秒，晚上可隔6-10小時旋搖一次，剔除檢驗不合格的樣品，隨著時間推移液體中菌絲不斷增加，5-10天后絮狀菌絲占整個液體量一半以上時得蛹蟲草液體菌種，可直接用于蛹蟲草栽培，本批培養(yǎng)的液體種可以用于接種3000瓶(500毫升罐頭瓶)以上蛹蟲草，接種后于溫度18 ± I °C的暗室培養(yǎng)，可有效降低污染率。實施例2
將組織分離的蛹蟲草菌株在PDA加富培養(yǎng)基上24±2°C左右活化培養(yǎng)后挑選8支合格斜面菌株備用。量取300ml蛹蟲草液體種培養(yǎng)基裝到750ml三角瓶中，共計分裝50瓶，用耐高溫無菌封口膜箍耐高溫橡皮圈封口通過高壓鍋按常規(guī)程序滅菌，冷卻至21 ±2°C，在無菌條件下采用無菌操作接入蛹蟲草斜面菌種，每支接液體種6-7瓶，21±2°C先靜置30小時，然后每天白天隔2-3小時將廣口瓶旋搖30秒，晚上可間隔6-10小時搖一次，及時剔除檢驗不合格的樣品，隨著時間推移液體中菌絲不斷增加，5-10天后絮狀菌絲占整個液體量一半或以上時得蛹蟲草液體菌種，可直接用于蛹蟲草栽培，本批培養(yǎng)的液體種可以用于接種500毫升罐頭瓶3000瓶左右蛹蟲草，接種后至于溫度18± I°C的暗室培養(yǎng)，可有效減少污染率。
實施例3
將孢子分離純化菌株在PDA加富培養(yǎng)基上24±2°C左右活化后挑選8支優(yōu)質(zhì)合格斜面?zhèn)溆谩Ａ咳?00ml蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)基裝到750ml菌種瓶(或廣口瓶)中，共計分裝50瓶，用裁切好的聚丙烯膜蓋口箍上橡皮圈扎緊，通過高壓鍋按程序滅菌，冷卻至21 ±2°C，在無菌條件下采用無菌操作接入蛹蟲草斜面菌種，每支接液體種6-7瓶21 ±2°C溫度條件下先靜置24小時，然后每天白天隔2-3小時將廣口瓶旋搖30秒，晚上可隔6-10小時搖一次，剔除檢驗不合格的樣品，隨著時間推移液體中菌絲不斷增加，5-10天后絮狀菌絲占整個液體量一半或以上時得蛹蟲草液體菌種，可直接用于蛹蟲草栽培，本批培養(yǎng)的液體種可以用于接種500ml罐頭瓶3000瓶左右的蛹蟲草，接種后至于溫度18± I°C的暗室培養(yǎng)，大大降低污染率。實施例4 將組織分離的蛹蟲草菌株在PDA加富培養(yǎng)基上24±2°C左右活化培養(yǎng)好后挑選8支優(yōu)質(zhì)合格試管斜面?zhèn)溆?。量?00ml蛹蟲草液體種培養(yǎng)基裝到1000毫升三角瓶中，共計分裝50瓶，用耐高溫硅氟透氣塞塞口后蓋4層報紙包住瓶口和瓶塞，橡皮圈扎緊后通過高壓鍋按程序滅菌，冷卻至21 ±2°C在無菌條件下采用無菌操作接入蛹蟲草斜面菌種，每支接液體種6-7瓶，21±2°C靜止36小時，然后每天白天隔2-3小時將三角瓶旋搖30秒，晚上可隔6_10小時搖一次，剔除檢驗不合格的樣品，隨著時間推移液體中菌絲不斷增加，5-10天后絮狀菌絲占整個液體量一半或以上時得蛹蟲草液體菌種，可直接用于蛹蟲草栽培，本批培養(yǎng)的液體種可以用于接種蛹蟲草500ml罐頭瓶3000瓶左右，接種后至于溫度18 ± I °C的暗室培養(yǎng)，可有效降低污染率。蛹蟲草栽培的具體步驟為
1)以重量份計，將蠶蛹粉I份、大米35份和蛹蟲草營養(yǎng)液50份置于培養(yǎng)瓶或盆中，混和后封口，常規(guī)程序滅菌并冷卻至18±1°C備用；
2)事先將手持噴霧器進行消毒液浸泡消毒或整體密封后用高壓鍋滅菌備用，在無菌條件下將蛹蟲草液體菌種旋搖后稍靜置，緩慢將液體菌絲片段倒入噴霧器儲液瓶中，注意將老接種塊和表面菌膜剔除，必要時還需將菌液用15目塑料網(wǎng)無菌過濾以免大菌絲團阻塞噴霧頭，將種瓶中殘留少量液體種迅速進行無菌取樣鏡檢若無可疑雜菌并且鼻聞口嘗菌絲氣味正常進一步印證菌種合格可用，舍棄不合格的菌種，然后將菌液振搖均勻后噴霧接入步驟I)中的栽培瓶或盆中；
3)接種后的培養(yǎng)瓶或盆在18±1°C左右避光培養(yǎng)10天左右，再進行增氧和光照刺激培養(yǎng)出草，待蛹蟲草生長成熟第一批采收完畢后可補水或營養(yǎng)液再出第二批甚至第三批。本發(fā)明對普及蛹蟲草大面積栽培具有極大的意義，對蛹蟲草栽培過程中的液體種關(guān)鍵制作技術(shù)極大簡化，一方面減少生產(chǎn)設施投入降低能耗和起步點，一方面簡化操作步驟提高實用性并有效降低污染率，使蛹蟲草大面積栽培技術(shù)廣泛推廣更加容易。
權(quán)利要求
1.一種蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于具體步驟為 將蛹蟲草液體種培養(yǎng)基裝入玻璃瓶中，每瓶裝液量占瓶總?cè)莘e的30-50%，封口滅菌，冷卻后在無菌條件下接入蛹蟲草斜面菌種，21±2°C下先靜置24-36小時再人工間歇搖瓶培養(yǎng)5-10天，待觀察靜置2小時以上的瓶中絮狀菌絲自然堆積體占整個液體體積一半以上，剔除檢驗不合格的樣品，即得到蛹蟲草液體菌種，可直接用于蛹蟲草栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于所述的蛹蟲草液體種培養(yǎng)基由以重量份計的以下組分組成，硫酸鎂3份、磷酸二氫鉀6份、蛋白胨16份、葡萄糖32份、維生素B1凈含量O. 02份，水2000份。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于所述的玻璃瓶為廣口瓶、三角瓶或菌種瓶，瓶體的容積< 1000毫升，便于人工搖瓶和接種操作。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于所述封口步驟采用棉花塞、硅氟透氣塞、耐高溫無毒薄膜或無菌封口膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于采用耐高溫無毒薄膜或無菌封口膜封口時，還需用耐高溫橡皮圈或者細繩扎口密封。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于采用棉花塞或者硅氟透氣塞進行封口時，用牛皮紙或多層報紙將塞齊瓶口一起包裹起來，然后用耐高溫橡皮筋或棉線索扎緊。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于所述人工間歇搖瓶方式為白天每2-3個小時搖瓶一次，晚上到第二天早上可間隔6-10小時再搖，搖瓶時用右手或左手持瓶身由慢到快旋轉(zhuǎn)搖動，使瓶內(nèi)液體隨之旋轉(zhuǎn)起來保持30秒以上即可，達到增氧和分散菌絲體的作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于所述檢驗時，通過迎光肉眼觀測靜止2小時以上的菌瓶內(nèi)菌液柱的上層液清亮度及菌液表面狀況，菌柱霧狀渾濁或表面有雜菌孢子的的樣品為不合格需剔除，同時可輔以顯微鏡觀察菌液微觀狀況和鼻聞、口嘗菌液的氣味來判斷其是否合格。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛹蟲草液體菌種的制備方法，其特征在于所述蛹蟲草栽培時接種后5-10天的暗光培養(yǎng)期溫度需控制在18±1°C。
全文摘要
一種蛹蟲草液體菌種的制備方法，具體步驟為將蛹蟲草液體種培養(yǎng)基裝入玻璃瓶中，每瓶裝入的液量占瓶總?cè)莘e30-50%，封口滅菌，冷卻后在無菌條件下接入蛹蟲草斜面菌種，21±2℃下先靜置24-36小時再人工間歇搖瓶培養(yǎng)5-10天，待靜置2小時以上觀察絮狀菌絲自然堆積體占整個液體體積一半以上時，經(jīng)剔除檢驗不合格的樣品即得到蛹蟲草液體菌種可直接用于蛹蟲草栽培。本發(fā)明提供的方法不需要傳統(tǒng)方法中所用的搖床等設備，液體種配制成份不需添加消泡劑，液體種使用前菌絲無需打碎，無需稀釋；并且提供了一種實用的液體菌種簡易檢測方法以及接種后有效降低污染率的暗光培養(yǎng)條件；本發(fā)明設施簡易，操作方便易于普及推廣。
文檔編號A01G1/04GK102893809SQ20121042527
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者金梅, 彭興南, 鄭大斌 申請人:長陽金梅生物科技有限公司