專利名稱：一種斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性是人類在病菌控制和治療中碰到的一個(gè)棘手問題，對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌正在成為日益嚴(yán)重的威脅，并且變得越來越普遍。而抗生素的過度使用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性，從而使人類面臨“超級(jí)細(xì)菌感染”的危險(xiǎn)[I]。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，2011年5月在德國爆發(fā)的腸出血性大腸桿菌(EHEC)疫情就是由一種名為“huSec41”的腸出血性大腸桿菌(EHEC)變種引起的，這一變種對(duì)很多抗生素具有耐藥性?？股卦谛竽翗I(yè)中的濫用也導(dǎo)致多種動(dòng)物源大腸桿菌具有了一定抗生素耐 藥性[2]，這使得畜牧業(yè)的穩(wěn)定和健康發(fā)展時(shí)刻面臨巨大的威脅。要解決具有多重耐藥性的超級(jí)細(xì)菌對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的威脅，除了加強(qiáng)對(duì)抗生素使用的規(guī)范管理，減少抗生素的濫用外，最根本的辦法還是要加快抗生素的研發(fā)速度，開發(fā)出新的、更為有效的抗生素。只有不斷采用新的研究技術(shù)和工藝，才能加快抗生素的研發(fā)速度。雖然體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以很好地闡明病菌和宿主之間相互作用的關(guān)鍵步驟，但是無法獲得與整體動(dòng)物相關(guān)的一些重要信息。隨著生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和動(dòng)物替代模型的出現(xiàn)，曾經(jīng)阻礙用活體動(dòng)物進(jìn)行病菌毒性研究的技術(shù)障礙和倫理問題都已經(jīng)得到了很好地解決。常用的較為低等的病菌感染替代動(dòng)物模型包括果蠅[3]、線蟲[4，5]和阿米巴蟲[6]等一些發(fā)育生物學(xué)研究已經(jīng)很廣泛的動(dòng)物，對(duì)這些低等動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)的深入研究已經(jīng)為醫(yī)藥學(xué)家提供了大量的實(shí)驗(yàn)工具和實(shí)驗(yàn)材料。但是，果蠅和線蟲等低等動(dòng)物與人類的生物等級(jí)差別太大，基因相似度低，生理結(jié)構(gòu)和生理功能有較大差別，因此，其藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)可靠性與可比性較差。所以，迫切需要開發(fā)新的較為低等的動(dòng)物模型，以便既能替代大小鼠等高等動(dòng)物，又能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)可靠性與可比性較高。斑馬魚是一種硬骨魚，屬于脊椎動(dòng)物，與果蠅、線蟲和阿米巴蟲等低等相比，斑馬魚與人類的基因相似度更高(85%以上)、生理結(jié)構(gòu)和生理功能更為接近；與鼠類等哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時(shí)觀察分析多個(gè)器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低[7]。此外，斑馬魚有著與哺乳動(dòng)物非常相似的發(fā)育良好的免疫系統(tǒng)(包括先天性免疫和獲得性免疫)[8，9]。這些優(yōu)點(diǎn)使得斑馬魚成為了研究病菌感染機(jī)制和篩選抗生素的一種非常有用的動(dòng)物模型。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，發(fā)明人經(jīng)研究，旨在提供一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、高通量的斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的I. 一種斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(I)斑馬魚選取
挑取發(fā)育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)細(xì)菌注射設(shè)置若干個(gè)細(xì)菌注射組、I個(gè)溶劑注射組、I個(gè)空白對(duì)照組，將帶有熒光標(biāo)記的細(xì)菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次，然后用顯微注射的方式將細(xì)菌注入斑馬魚體內(nèi)，注射結(jié)束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔中加入等體積的養(yǎng)殖用水，作為細(xì)菌注射組；溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液；空白對(duì)照組注射等體積的養(yǎng)殖用水；恒溫培養(yǎng)。優(yōu)選的，還包括以下步驟(3)圖像分析和/或微孔板分析；(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
優(yōu)選的，步驟⑴中挑選的斑馬魚為受精后2天的斑馬魚；優(yōu)選的，步驟(2)中每個(gè)斑馬魚細(xì)菌注射量為3000-3500CFU ；優(yōu)選的，步驟(2)中的注射方式為心包注射或卵黃囊注射；優(yōu)選的，步驟⑵中細(xì)菌為大腸桿菌；優(yōu)選的，所述養(yǎng)殖用水其溶解氧濃度為6-8mg/L、水溫為28°C、pH為7. 2-7. 6、總硬度為 200-250mg/L ；優(yōu)選的，步驟⑵中斑馬魚恒溫培養(yǎng)的溫度為34°C ；優(yōu)選的，步驟(2)中斑馬魚恒溫培養(yǎng)的時(shí)間為72h。優(yōu)選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌相對(duì)熒光強(qiáng)度；優(yōu)選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉(zhuǎn)入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測(cè)熒光強(qiáng)度；優(yōu)選的，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析步驟為統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以土SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p < O. 05為差異性顯著。2.前述的構(gòu)建方法得到的斑馬魚細(xì)菌感染模型用于細(xì)菌感染研究的用途。3.前述的構(gòu)建方法得到的斑馬魚細(xì)菌感染模型用于評(píng)價(jià)或篩選抗生素的用途。優(yōu)選的，還包括以下步驟(3)化合物處理移除微孔板中的養(yǎng)殖用水，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組若干個(gè)化合物處理組，I個(gè)模型組，I個(gè)陽性對(duì)照組，化合物處理組中加入相同體積、濃度分別為O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和200 μ M的化合物；模型組加入等體積的養(yǎng)殖用水；于34°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。優(yōu)選的，步驟(3)陽性對(duì)照組加入的溶液為氨芐西林；優(yōu)選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌相對(duì)熒光強(qiáng)度；優(yōu)選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉(zhuǎn)入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測(cè)熒光強(qiáng)度；優(yōu)選的，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析步驟為統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以土SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p < O. 05為差異性顯著。優(yōu)選的，化合物處理后的斑馬魚培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。優(yōu)選的，所述的化合物為卡那霉素、慶大霉素、氯霉素或鏈霉素。本發(fā)明提供了一種斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、成功率高、重復(fù)性好且穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)定性分析與定量分析。將用熒光標(biāo)記的細(xì)菌注射到斑馬魚體內(nèi)之后，只要在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)的熒光強(qiáng)度就可以斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行定性分析；在熒光顯微鏡下拍照并利用圖像分析軟件對(duì)斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行定量分析；也可以用熒光酶標(biāo)儀對(duì)斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行高通量的定量分析。具體地說，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)I)活體內(nèi)——實(shí)驗(yàn)材料為活體斑馬魚，作為一種脊椎動(dòng)物，其篩選模型屬體內(nèi)模型，能夠真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。2)高通量——斑馬魚幼魚很小，只有1-4毫米，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6，12，24，48，96或384孔板內(nèi)進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)周期短使斑馬魚成為一種能進(jìn)行高通量自動(dòng)化體內(nèi)藥物篩選的理想模型。3)經(jīng)濟(jì)一所需費(fèi)用低，以猴子為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于10美元，以老鼠為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于I美元，而以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)小于0.01美元。4)化合物用量少——檢測(cè)化合物用量少，通常只需幾毫克，而傳統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)則需幾毫克以上的化合物。5)簡(jiǎn)便一實(shí)驗(yàn)過程操作簡(jiǎn)單，斑馬魚經(jīng)藥物處理后便可直接觀察并進(jìn)行定量與定性分析，不需要其它實(shí)驗(yàn)操作，而傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。6)快速一實(shí)驗(yàn)周期短，可在2 3天內(nèi)完成；而老鼠常需要數(shù)周到數(shù)月的時(shí)間，猴子常需要數(shù)月至數(shù)年的時(shí)間。斑馬魚在第一個(gè)72小時(shí)(h)以內(nèi)完成胚胎發(fā)育。多數(shù)的內(nèi)部器官，包括心血管系統(tǒng)、腸、肝臟和腎，在24-48h內(nèi)快速成型，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)載體老鼠和猴子則分別需要21天和9個(gè)月方可完成胚胎發(fā)育。7)高效一斑馬魚胚胎及幼魚透明，可同時(shí)觀察多個(gè)器官系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)分析方法簡(jiǎn)單、快速。8)可靠的預(yù)測(cè)性一斑馬魚的基因與人類基因的相似度高達(dá)85%以上，其生物學(xué)功能與哺乳動(dòng)物及人類高度相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)，預(yù)測(cè)性好。9)直觀性強(qiáng)一胚胎及幼魚透明，可直接置于顯微鏡下觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。10)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好一本發(fā)明重復(fù)實(shí)驗(yàn)十幾次，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同?！?br> 本發(fā)明應(yīng)用價(jià)值斑馬魚細(xì)菌感染模型具有可靠、快速、高效、低廉、高性價(jià)比等優(yōu)點(diǎn)，本模型可用于細(xì)菌感染研究以及篩選抗生素。本發(fā)明對(duì)加快降血脂藥物的研發(fā)及改善高脂血癥患者的治療具有意義重大。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的在于提供一種斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)。一、本發(fā)明提供一種建立斑馬魚細(xì)菌感染模型的方法，設(shè)計(jì)方案為I.細(xì)菌的培養(yǎng)將帶有卡那霉素抗性的紅色熒光質(zhì)粒RFP(Kan+)轉(zhuǎn)入氯霉素抗性大腸桿菌BL21(DE3)Plyss (Chl+)中，轉(zhuǎn)化成功后涂LB固體平板(Kan+、Chl+)，篩選能夠產(chǎn)生紅色熒光且具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的大腸桿菌(下文簡(jiǎn)稱BL21RFP)，長(zhǎng)出單菌落后4°C保存平板。每次對(duì)斑馬魚進(jìn)行細(xì)菌注射前一天，挑取BL21RFP單菌落到LB液體培養(yǎng)基中(Kan+、Chl+)，37°C>200rpm 培養(yǎng) 16h,備用。2.斑馬魚選取取4 5對(duì)斑馬魚親本交配,按照Westerfield[10]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常且發(fā)育階段一致的斑馬魚移入
6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚。3.細(xì)菌注射設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)細(xì)菌注射組、I個(gè)溶劑注射組、I個(gè)空白對(duì)照組。將步驟I中培養(yǎng)好的細(xì)菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次；將斑馬魚麻醉后，用顯微注射的方式將細(xì)菌注入斑馬魚體內(nèi)——可采用心包注射或卵黃囊注射。3個(gè)細(xì)菌注射組的細(xì)菌注射量分別為600-700CFU、3，000-3，500CFU和15，000-18，000CFU,溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液。注射結(jié)束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔中加入等體積的養(yǎng)殖用水(溶解氧質(zhì)量濃度為6-8mg/L ;水溫為28°C ；pH為7. 2-7. 6 ;總硬度為200-250mg/L,下同)，按最佳培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)度于34°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚存活率，并在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，拍照并保存。用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，定量分析斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌熒光強(qiáng)度，進(jìn)而定量評(píng)價(jià)斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況。二、本發(fā)明提供了一種利用斑馬魚細(xì)菌感染模型評(píng)價(jià)與篩選抗生素的方法，設(shè)計(jì)方案為I.細(xì)菌的培養(yǎng)每次對(duì)斑馬魚進(jìn)行細(xì)菌注射前一天，挑取BL21RFP單菌落到LB液體培養(yǎng)基中(Kan+、Chl+)，37°C、200rpm 培養(yǎng) 16h，備用。I.細(xì)菌的培養(yǎng)將帶有卡那霉素抗性的紅色突光質(zhì)粒RFP (Kan+)轉(zhuǎn)入氯霉素抗性大腸桿菌BL21(DE3)Plyss (Chl+)中，轉(zhuǎn)化成功后涂LB固體平板(Kan+、Chl+)，篩選能夠產(chǎn)生紅色熒光且具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的大腸桿菌(下文簡(jiǎn)稱BL21RFP)，長(zhǎng)出單菌落后4°C保存平板。每次對(duì)斑馬魚進(jìn)行細(xì)菌注射前一天，挑取BL21RFP單菌落到LB液體培養(yǎng)基中(Kan+、Chl+)，37°C>200rpm 培養(yǎng) 16h,備用。2.斑馬魚選取取4 5對(duì)斑馬魚親本交配,按照Westerfieldtici]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常且發(fā)育階段一致的斑馬魚移入6、 12、24、48、96或384孔微孔板中，根據(jù)微孔板規(guī)格放入不同數(shù)量的斑馬魚。3.細(xì)菌注射設(shè)置9個(gè)實(shí)驗(yàn)組7個(gè)細(xì)菌注射組、I個(gè)溶劑注射組、I個(gè)空白對(duì)照組。將步驟2中培養(yǎng)好的細(xì)菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次；將斑馬魚麻醉后，用顯微注射的方式將細(xì)菌注入斑馬魚體內(nèi)——可采用心包注射或卵黃囊注射。5個(gè)細(xì)菌注射組的細(xì)菌注射量均為3，000-3, 500CFU，溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液。注射結(jié)束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔中加入等體積的養(yǎng)殖用水。4.化合物處理7個(gè)細(xì)菌注射組中，5個(gè)化合物處理組，I個(gè)模型組，I個(gè)陽性對(duì)照組。移除微孔板中的養(yǎng)殖用水，化合物處理組中加入一定體積(根據(jù)微孔板規(guī)格而定)濃度分別為O. ΙμΜ、I μ Μ、10-、100 μ M和200 μ M的慶大霉素；陽性對(duì)照組中加入氨芐西林；模型組加入等體積的養(yǎng)殖用水。按照最佳處理時(shí)間長(zhǎng)度于34°c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.圖像分析移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況并拍照保存，定性評(píng)價(jià)化合物的體內(nèi)抗菌效果?？瞻捉M和溶劑組在熒光顯微鏡下觀察無熒光，細(xì)菌注射模型組的熒光很強(qiáng)，陽性對(duì)照組和化合物處理組的熒光強(qiáng)度減弱(圖I)。用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌相對(duì)熒光強(qiáng)度(S)，定量評(píng)價(jià)化合物的體內(nèi)抗菌效果(圖
2)?；衔锏目咕Чu(píng)價(jià)公式如下
權(quán)利要求
1.一種斑馬魚細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)斑馬魚選取 挑取發(fā)育正常的斑馬魚放入微孔板中； (2)細(xì)菌注射 設(shè)置若干個(gè)細(xì)菌注射組、I個(gè)溶劑注射組、I個(gè)空白對(duì)照組，將帶有熒光標(biāo)記的細(xì)菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次，然后用顯微注射的方式將細(xì)菌注入斑馬魚體內(nèi)，注射結(jié)束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔中加入等體積的養(yǎng)殖用水，作為細(xì)菌注射組；溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液；空白對(duì)照組注射等體積的養(yǎng)殖用水；恒溫培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟 (3)圖像分析和/或微孔板分析； (4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
3.如權(quán)利要求I或2所述的建立方法，其特征在于優(yōu)選的，步驟(I)中挑選的斑馬魚為受精后2天的斑馬魚； 優(yōu)選的，步驟(2)中每個(gè)斑馬魚細(xì)菌注射量為3000-3500CFU ； 優(yōu)選的，步驟(2)中的注射方式為心包注射或卵黃囊注射； 優(yōu)選的，步驟(2)中細(xì)菌為大腸桿菌； 優(yōu)選的，所述養(yǎng)殖用水其溶解氧濃度為6-8mg/L、水溫為28°C、pH為7. 2-7. 6、總硬度為200_250mg/L ； 優(yōu)選的，步驟(2)中斑馬魚恒溫培養(yǎng)的溫度為34°C ； 優(yōu)選的，步驟(2)中斑馬魚恒溫培養(yǎng)的時(shí)間為72h。
4.如權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建方法，其特征在于 優(yōu)選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌相對(duì)熒光強(qiáng)度； 優(yōu)選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉(zhuǎn)入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測(cè)熒光強(qiáng)度； 優(yōu)選的，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析步驟為統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p < O. 05為差異性顯著。
5.權(quán)利要求1-4所述構(gòu)建方法得到的斑馬魚細(xì)菌感染模型用于細(xì)菌感染研究的用途。
6.權(quán)利要求I或3所述構(gòu)建方法得到的斑馬魚細(xì)菌感染模型用于評(píng)價(jià)或篩選抗生素的用途。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于還包括以下步驟 (3)化合物處理 移除微孔板中的養(yǎng)殖用水，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組若干個(gè)化合物處理組，I個(gè)模型組，I個(gè)陽性對(duì)照組，化合物處理組中加入相同體積、濃度分別為O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和·200 μ M的化合物；模型組加入等體積的養(yǎng)殖用水；于34°c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(4)圖像分析和/或微孔板分析； (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于 優(yōu)選的，步驟(3)陽性對(duì)照組加入的溶液為氨芐西林； 優(yōu)選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌相對(duì)熒光強(qiáng)度； 優(yōu)選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉(zhuǎn)入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測(cè)熒光強(qiáng)度； 優(yōu)選的，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析步驟為統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P < O. 05為差異性顯著。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于 化合物處理后的斑馬魚培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于 所述的化合物為卡那霉素、慶大霉素、氣霉素或鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法，并利用該動(dòng)物模型進(jìn)行細(xì)菌感染研究以及篩選抗生素。模型的構(gòu)建方法主要包括斑馬魚選取，細(xì)菌注射，圖像分析和/或微孔板分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析幾個(gè)步驟。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)，本模型可用于細(xì)菌感染研究以及篩選抗生素。本發(fā)明對(duì)加快降抗生素的研發(fā)及改善細(xì)菌感染患者的治療具有意義重大。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102907356SQ201210377599
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者李春?jiǎn)? 張勇, 勞喬聰, 朱鳳, 郭勝亞 申請(qǐng)人:杭州環(huán)特生物科技有限公司