專利名稱：蛋白質(zhì)類泛素化修飾(sumo)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立 方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)類泛素化修飾(Small Ubiquitin-Related Modifier, SUMO)是一種與泛 素化修飾過程極其相似的小分子蛋白質(zhì)翻譯后修飾。越來越多的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)存在SUMO 化修飾，它們涉及細(xì)胞生命活動的各個方面，如蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)定位、信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色體分離、細(xì)胞周期調(diào)控和病毒感染應(yīng)答等(Gill，G. (2005) Somethingabout SUMO inhibits transcription. Current opinion in genetics &development 15 :536-541)。 在許多人類疾病如癌癥和神經(jīng)退化性疾病中，SUMO化修飾作用對疾病的發(fā)生與發(fā)展起著極 為重要的作用。因此闡明SUMO化修飾的功能，將為疾病的治療開辟一條嶄新的思路。
蛋白質(zhì)SUMO化修飾是一個多步驟酶促反應(yīng)，El， E2， E3三類酶相繼參與此反應(yīng)過 程，最終將SUMO分子共價結(jié)合于底物。SUMO激活酶(El)為Aos 1/Uba2， SUMO結(jié)合酶(E2)為 Ubc9，SUM0連接酶(E3)有PIAS，Pc2，RanBP2三類(Melchior，F(xiàn). (2000) SUMO—nonclassical ubiquitin. Annual review of cell and developmentalbiology 16:591-626)。
SUMO化修飾途徑非常保守。哺乳動物體內(nèi)存在四種亞型的SUMO :SUMOl、 SUM02、 SUM03和SUM04。 SUM01由101個氨基酸殘基組成，與SUM02、 SUM03和SUM04的同源性大 約為50%，與泛素分子有18%的同源性。SUM02、 SUM03和SUM04之間同源性更高(Guo，
D. ， Li， M. ， Zhang， Y. ， Yang， P. (2004)A f皿ctionalvariant of SUM04， a new I kappa B alpha modifier, is associated withtype 1 diabetes. Nature genetics 36:837-841)。 不同亞型的SUMO蛋白有各自的特異性，表現(xiàn)在亞細(xì)胞定位，底物選擇性等方面(Saitoh, H. &Hinchey， J. (2000)Functional heterogeneity of small ubiquitin-relatedprotein modifiers SUM0-1 versus SUM0-2/3.The Journal of biologicalchemistry 275 : 6252-6258)。 SUMO化修飾途徑中惟一的E2酶Ubc9的功能缺失可引起多種模式生物體發(fā)育缺 陷和致死。但不同亞型的SUMO蛋白在體內(nèi)各自的生物功能尚不清楚。在較為低等的且僅 有一種類型SUM0表達(dá)的生物體中，SUM0對胚胎的正常發(fā)育是必需的(Jones， D. ， Crowe，
E. ， Stevens, T.A. ， & Candido， E. P. (2002)Functional and phylogeneticanalysis of the ubiquitylation system in Caenorhabditis elegans :ubiquitin_conjugating enzymes,ubiquitin—activating enzymes,andubiquitin—like proteins. Genome biology 3 :RESEARCH0002)。而最近的基因敲除(knockout)結(jié)果顯示SUM01不是小鼠胚胎發(fā)育所 必需的(Zhang， F. P. ， Mikko體，L. ， Toppari， J. ， Palvimo， J.J. (2008) S翻-lf皿ction is dispensable in normal mouse development. Molecular andcellular biology 28: 5381-5390)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了研究不同SUM0亞型各自的功能，本發(fā)明運用Morpholino技術(shù)在模式生 物體斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中單獨/聯(lián)合沉默(knockdown)各SUMO亞型基因的表達(dá)，以 提供蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型，以作為蛋白質(zhì)翻譯后修 飾相關(guān)藥物篩選的動物模型。 本發(fā)明的一個目的是提供蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚 模型以及建立該模型的方法。 本發(fā)明的蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型利用 Morpholino技術(shù)在模式生物體斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中將SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3 所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯(lián)合顯微注射入單細(xì)胞期的斑馬魚卵中以單獨或 聯(lián)合沉默各SUMO亞型基因的表達(dá)而建立。 本發(fā)明的蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型的建立方法 包括將SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯(lián)合顯微注 射入單細(xì)胞期的斑馬魚卵中的步驟以及持續(xù)培養(yǎng)并在倒置解剖顯微鏡下觀察整體表型的 步驟。 在模式生物體斑馬魚中存在SUM01、SUM02和SUM03三種亞型的SUM0蛋白表達(dá)。本 研究發(fā)現(xiàn)Morpholino基因沉默結(jié)果顯示，與Ubc9缺失的表型相似，三種亞型SUMO聯(lián)合缺 失的胚胎表現(xiàn)出最為嚴(yán)重的發(fā)育缺陷；而基因沉默單一亞型SUMO或聯(lián)合基因沉默SUM01/ SUM02的胚胎無明顯異常表型；SUM01/SUM03或SUM02/SUM03聯(lián)合基因沉默的胚胎發(fā)育缺陷 率較低。斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷主要包括頭部發(fā)育異常，出現(xiàn)小頭、小眼和頜部畸型，并且胚 胎致死。 因此，本發(fā)明還提供所述蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚 模型作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾相關(guān)藥物篩選的動物模型的用途。


圖1A為斑馬魚胚胎發(fā)育各時相UBC9表達(dá)譜，
其中，Hpf :受精后小時；lateral :側(cè)向；dorsal :背向；
圖IB為斑馬魚胚胎發(fā)育各時相SUMO各亞型表達(dá)譜，
其中，Hpf :受精后小時；lateral :側(cè)向；dorsal :背向；
圖2顯示Morpholino寡核苷酸測效結(jié)果， 其中，Con :對照;Mis :錯配對照;actin :肌動蛋白，A為Morpholino寡核苷酸測 效實驗結(jié)果(a， b， c， d， e， f， g， h， i為熒光顯微鏡下視野，a'至i'為光學(xué)顯微鏡下同一視 野)，B和C均為蛋白印跡(Western blot)結(jié)果；
圖3顯示表型分析， 其中，a， b， c表示倒置光學(xué)解剖顯微鏡下分別注射錯配Morpholino寡核苷酸 (Mis) ;SUMOl， SUM02, SUM03 Morpholino寡核苷酸聯(lián)合注射(MO s翻l-s翻2-s翻3);注 射UBC9 Morpholino寡核苷酸(MO ubc9)的胚胎的表型。d， e， f為同一胚胎Alcian blue 染色顯示軟骨組織結(jié)構(gòu)。g， h分別為注射錯配Morpholino寡核苷酸(Mis) ;SUMOl， SUM02,
4SUM03 Morpholino寡核苷酸聯(lián)合注射(M0sumol-sumo2-sumo3)進(jìn)行HE染色顯示胚胎眼部 結(jié)構(gòu)； 圖4顯示TUNEL實驗及pH3 (antiphosphorylated histone H3)免疫熒光實驗結(jié) 果， 其中，a， b分別表示注射錯配Morpholino寡核苷酸(Mis) ;SUMOl， SUM02, SUM03 Morpholino寡核苷酸聯(lián)合注射(M0s咖ol-s咖o2-s咖o3)的胚胎頭部TUNEL實驗顯示凋亡 細(xì)胞。c，d分別表示這兩種胚胎PH3實驗結(jié)果。e，f為c，d的局部放大細(xì)節(jié)圖。g，h顯示 注射錯配Morpholino寡核苷酸(Mis) ;SUM01， SUM02， SUM03Morpholino寡核苷酸聯(lián)合注射 (M0 s咖ol-s咖o2-s咖o3)的胚胎頭部細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。i和j顯示這兩種胚胎 軀干細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果；
圖5為PCS2+表達(dá)載體圖譜。
具體實施例方式
結(jié)合附圖，本發(fā)明將參照以下實施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但這不應(yīng)成為對本發(fā)明的限 制。 實施例1 1、斑馬魚的養(yǎng)殖 斑馬魚的飼養(yǎng)、繁殖與分齡依照經(jīng)典方法進(jìn)行(Kimmel， C. B. ， Ballard, W. W.， Kimmel， S. R. ， Ullma皿，B. (1995)Stages of embryonicdevelopment of the zebrafish. Dev Dyn 203 :253-310)。 2、 Morpholino (M0)寡核苷酸片段的合成與顯微注射 Morpholino (M0)寡核苷酸片段由Gene Tools公司合成。斑馬魚各基因
Morpholino寡核苷酸片段序列如下 SUM01 M0 GTCTCCGTGTCTGACATGATATTCC (SEQ ID NO. 1) SUM02 M0 CATGGTTATTGTATTTGCGCTTCTC (SEQ ID NO. 2) SUM03 M0 TAGGCTTGTCTTCGGACATTTTTGC (SEQ ID NO. 3)Ubc9M0 TCAGAGCAATGCCAGACATGACCAC (SEQ ID NO. 4)錯配MO (Mismatch MO) GTGTCCCTGTCTCACATCATATACC (SEQ ID NO. 5) 其中，Ubc9M0作為陽性對照MO ;錯配MO作為錯配陰性對照M0。 將各Morpholino (MO)寡核苷酸片段溶于超純水中，以如下顯微注射劑量，注射入
單細(xì)胞期的斑馬魚卵中 單一注射劑量錯配MO，SUMOl M0，SUM02 M0， SUM03M0， Ubc9 MO均為12. 46ng/卵。
聯(lián)合注射劑量SUM01/SUM02 M0， SUM01/SUM03 M0， SUM02/SUM03， SUM01/SUM02/ SUM03M0，各4. 15ng/卵。
顯微注射后即將胚胎培養(yǎng)于egg溶液(egg solution)中(配方純水9升，海鹽 0. 54克，100微升0. 2%亞甲基藍(lán))并置于28. 5。C恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)，在附圖中所示時
相于倒置解剖顯微鏡下觀察表型并進(jìn)行相關(guān)實驗，具體相關(guān)實驗見下文。
3、質(zhì)粒構(gòu)建與體外轉(zhuǎn)錄 斑馬魚Ubc9和各SUMO基因由RT-PCR (按常規(guī)方法抽提斑馬魚總RNA，總RNA提取 應(yīng)用Trizol試劑(Gibco公司)。取1 y g RNA用M-MLV (Promega公司)300U進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 引物使用試劑盒中提供的oligo dT引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為100 iU，內(nèi)含1Xbuffer， 3. 75mmol/L MgC12、0. 2mmol/L dNTP、正反向引物各0. 35 ii mol/L、1 ii 1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0. 05U/ ii 1高保真Taq DNA聚合酶(Takara公司)。反應(yīng)程序95。C 2min， 1個循環(huán)；95。C 60s、 50°C 60s、72°C 2min，30個循環(huán)；72。C延伸7min，4t:保存。)獲得，并克隆入PCS2+表達(dá)載 體中(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PCS2+表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)平板篩選單克隆， 擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA，然后酶切鑒定。用末端熒光標(biāo)記法進(jìn)行DNA序列分析。所獲測序結(jié)果 通過Blast軟件與GenBank收錄序列進(jìn)行同源性比較得到正確克隆。)，其中表達(dá)載體的結(jié) 構(gòu)如圖5中所示。 斑馬魚Ubc9和各SUM0基因全長基因的各克隆引物序列如下(其中"For"表示正 ;"Rev"表示反向引物)
向引物
















SUM01 For
Rev
SUM02 For
Rev
SUM03 For
CCGGAATTCATGTCAGACACGGAGACCAAGCCCTC
(SEQ ID NO. 6) CCGCTCGAGGCGAGGCTCTCGTGAAGGCAGGTATG
(SEQ ID NO. 7) CCGGAATTCCTTTGTGTGGCGGCGTAGAGAAGCGC
(SEQ ID NO. 8) CCGCTCGAGGTATCTGAAGCAGAACAAACCCTGAAC
(SEQ ID NO. 9) CCGGAATTCGCGCGTCTTGTGTTCTAATC
(SEQ ID NO. 10) CCGCTCGAGCTACACCCTCCCTCGATGTTTGCTCTC
(SEQ ID NO. 11) CCGGAATTCATGTCTGGCATTGCTCTGAGTCGAC
(SEQ ID NO. 12) CCGCTCGAGCTGATCGAGAAGGGGAACAGAGCG
(SEQ ID NO. 13)
將各全長基因克隆進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄用限制酶Kpnl消化質(zhì)粒制備線性模板DNA ;用
酚氯仿抽提及乙醇沉淀純化模板DNA ;將DNA溶解于水；在一微量離心管中，室溫下以下
列順序混合模板DNA lug， 2 ill 10 X轉(zhuǎn)錄緩沖液，2 ii 1噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶
(約10單位)，補(bǔ)無RNA酶的水加至20 iU。 37t:下溫育反應(yīng)物2小時。 RNA轉(zhuǎn)錄本用于原位雜交實驗。 斑馬魚Morpholino測效質(zhì)粒克隆序列如下 測效質(zhì)粒是指在正式實驗前將所要沉默的基因啟始密碼子ATG左右各約50bp
Ubc9
Rev
For
Rev序列與EGFP熒光基因融合入同一質(zhì)粒中，體外轉(zhuǎn)錄出mRNA，將此融合轉(zhuǎn)錄本單獨或與相 應(yīng)的Morpholino寡核苷酸共注射入單細(xì)胞期的斑馬魚卵中，在熒光顯微鏡下觀察共注射 Morpholino寡核苷酸的胚胎中EGFP的表達(dá)是否消失，以此判斷各Morpholino寡核苷酸沉 默外源性SUMO分子表達(dá)的有效性，判斷出各Morpholino寡核苷酸片段的有效性之后即開 展正式實驗。 采用如下引物將各所需沉默基因用PCR方法擴(kuò)增出(條件同上)，該克隆包含各基 因啟始密碼子ATG左右各約50bp序列(其中"For"表示正向引物；"Rev"表示反向引物) SUM01 For CCGGAATTCCTGCTGGTAGCACTAGCAAAACCTCTC (SEQ ID NO. 14) Rev CCGCTCGAGGGTCAGGTTGTCTGTGATTCTCTGTCC (SEQ ID NO. 15) SUM02 For CCGGAATTCGTGTGGCGGCGTAGAGAAG (SEQ ID NO. 16) Rev CCGCTCGAGCTTCAGGTTGATGTGGTCG (SEQ ID NO. 17) SUM03 For CCGGAATTCGCGCGTCTTGTGTTCTAATC (SEQ ID NO. 10) Rev CCGCTCGAGCGCCACCTTCAGATTGATGTG (SEQ ID NO. 18) 將上述SUMOl， SUM02, SUM03擴(kuò)增片段分別按閱讀框架插入PCS2-EGFP載體(即在
附圖中PCS2載體多克隆位點中已插入一個EGFP熒光基因)的多克隆位點中，體外轉(zhuǎn)錄出 含目的基因與EGFP的融合轉(zhuǎn)錄本。將此融合轉(zhuǎn)錄本單獨或與相應(yīng)的Morpholino寡核苷酸 共注射入單細(xì)胞期的斑馬魚卵中，在熒光顯微鏡下觀察共注射Morpholino寡核苷酸的胚 胎中EGFP的表達(dá)是否消失，以此判斷各Morpholino寡核苷酸沉默外源性SUMO分子表達(dá)的 有效性，單獨注射融合轉(zhuǎn)錄本的胚胎由于EGFP的表達(dá)，會在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光； 而融合轉(zhuǎn)錄本與相應(yīng)的Morpholino寡核苷酸共注射的胚胎，如果Morpholino能夠特異性 沉默融合轉(zhuǎn)錄本的翻譯，那綠色熒光的表達(dá)也會隨之消失，如果該綠色熒光的表達(dá)仍然存 在，說明Morpholino不能特異性地沉默目的基因的表達(dá)。
4、原位雜交 SUMOl， SUM02, SUM03和UBC9各反義RNA探針(用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述已克 隆的各全長基因轉(zhuǎn)錄成反義RNA探針)體外合成(Roche)，原位雜交與檢測按已報道方 法進(jìn)行(Be騰tt， C. M. ， Kanki， J. P. ， Rhodes, J. ， Liu， T. X. (2001)Myelopoiesis in the zebrafish， Daniorerio. Blood 98 :643-651)。
5、蛋白印跡(Western blot): 顯微注射3天后，提取胚胎細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜 (Invitrogen)，封閉，用肌動蛋白(actin)抗體做為上樣量參考(Sigma公司)；SUMOl抗 體和SUM02/3抗體(均為Zymed公司)雜交，SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光法試劑盒 (Pierce公司)檢測，觀察各Morpholino寡核苷酸沉默內(nèi)源性SUMO分子表達(dá)的有效性。
6、組織和細(xì)胞化學(xué)染色
HE和Alcian blue染色均按已報道方法進(jìn)行(Robu， M. E. ， Larson, J. D.， Nasevicius, A. ， Beiraghi， S. (2007)p53 activation by knockdowntechnologies. PLoS genetics 3 :e78)。 7、細(xì)胞凋亡原位檢測(TUNEL)實驗，pH3免疫熒光實驗和流式細(xì)胞儀(FACS)檢測 TUNEL試劑盒購自Roche公司，按推薦方法進(jìn)行。 pH3免疫熒光實驗試劑盒購自Invitrogen公司，按推薦方法進(jìn)行。FACS檢測按已報道方法進(jìn)行(Nowak， M. & Hammerschmidt， M. (2006) Ubc9
regulates mitosis and cell survival during zebrafishdevelopment. Mol Biol Cell
17 :5324-5336)。 實驗結(jié)果 1. SUMO和Ubc9在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的時空表達(dá)譜 斑馬魚中存在三種SUMO亞型，這三種SUMO分別和人的相應(yīng)亞型具有高度的同源 保守性。本發(fā)明利用全胚胎原位雜交的方法檢測了三種亞型的SUMO及Ubc9在斑馬魚胚胎 發(fā)育早期的時空表達(dá)情況(如圖1中所示)。在受精后24小時左右，SUMO及Ubc9全身廣 泛表達(dá)，24小時到48小時，表達(dá)主要集中在細(xì)胞高增殖區(qū)，包括神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、神經(jīng)嵴細(xì) 胞(neural crest cell)、胸鰭芽細(xì)胞(pectoral f inbud)，到72小時左右，表達(dá)則主要集 中在鰓弓和消化系統(tǒng)。 2.基因沉默SUMO蛋白的表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚早期胚胎發(fā)育異常 為了研究SUMO在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的生物學(xué)功能，本發(fā)明采用了 morpholino 基因沉默技術(shù)。預(yù)初實驗顯示SUM0 M0及Ubc9M0能夠有效地沉默相應(yīng)的耙基因表達(dá)(如 圖2中所示)，驗證了 M0引物的有效性。圖2中，A為Morpholino寡核苷酸測效實驗結(jié)果。 結(jié)果顯示單獨注射融合轉(zhuǎn)錄本的胚胎和共注射錯配Morpholino寡核苷酸的胚胎由于EGFP 的表達(dá)，會在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光；而融合轉(zhuǎn)錄本與相應(yīng)的Morpholino寡核苷酸共 注射的胚胎，由于Morpholino能夠特異性沉默融合轉(zhuǎn)錄本的翻譯，綠色熒光的表達(dá)也隨之 消失，說明了我們所用的Morpholino寡核苷酸針對目的基因的有效性。A說明免疫熒光實 驗顯示各亞型特異性Morpholino寡核苷酸有效地阻止了相應(yīng)SUMO 1，2，3(c，f， i)蛋白質(zhì) 的翻譯；B和C均為蛋白印跡(Western blot)結(jié)果。胚胎顯微注射3天后，提取細(xì)胞總蛋 白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示未注射胚胎和注射錯配Morpholino寡核苷酸的胚胎 中SUMO和UBC9的表達(dá)不變，而注射相應(yīng)的Morpholino寡核苷酸的胚胎中，SUMO和UBC9的 蛋白質(zhì)表達(dá)大大減弱，也說明了我們所用的Morpholino寡核苷酸針對目的基因的有效性。 B和C說明蛋白印跡實驗同樣顯示Morpholino寡核苷酸有效地阻止了 SUM0(B)和ubc9 (C) 蛋白質(zhì)的翻譯。當(dāng)聯(lián)合基因沉默三種亞型的SUMO后，發(fā)育72小時后，胚胎出現(xiàn)表型異常， 具體表現(xiàn)為頭部及眼睛變小，鰓弓出現(xiàn)異常，而耳部及軀干發(fā)育正常。Ubc9基因沉默實驗也 出現(xiàn)類似表型(如圖3中所示)。圖3中，當(dāng)聯(lián)合基因沉默三種亞型的SUM0后(b)，胚胎出 現(xiàn)頭部及眼睛變小，鰓弓出現(xiàn)異常，而耳部及軀干發(fā)育正常。Ubc9基因沉默實驗也出現(xiàn)類似 表型(c)。 Alcian blue染色結(jié)果顯示斑馬魚頭部第一到第四鰓弓(gillarch)縮短或缺 失，而第五鰓弓仍然存在，鰓弓軟骨細(xì)胞形態(tài)變圓，體積增大(e)。組織化學(xué)染色眼部切片顯 示眼部細(xì)胞各層都存在，僅出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少(h)。 Alcian blue染色結(jié)果顯示斑馬魚 頭部第一到第四鰓弓(gill arch)縮短或缺失，而第五鰓弓仍然存在，鰓弓軟骨細(xì)胞形態(tài)變
8圓，體積增大。 3. SUMO各亞型的缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步闡述上述表型是由細(xì)胞增殖減少或是細(xì)胞凋亡增多所引起，我們進(jìn)行 了 TUNEL實驗及pH3(antiphosphorylated histoneH3)免疫熒光實驗(如圖4中所示)。 TUNEL實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合基因沉默SUMO 48小時后，在中后腦邊界及眼部出現(xiàn)大量的凋亡 細(xì)胞(b)， pH3免疫熒光實驗結(jié)果顯示，這些區(qū)域同時出現(xiàn)了大量pH3陽性細(xì)胞(d， f)。為 了進(jìn)一步檢測細(xì)胞周期是否受到影響，流式細(xì)胞儀分析顯示，頭部細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞 周期G2/M期阻滯(g，h)，而軀干細(xì)胞則沒有受到影響(i， j)。 通過上述實驗結(jié)果證實本發(fā)明成功建立了蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUM0)缺失型模 式生物體斑馬魚模型，從而為蛋白質(zhì)翻譯后修飾相關(guān)藥物的篩選提供了很好的動物模型。
討論 1.三種亞型的SUMO是斑馬魚胚胎早期發(fā)育所必需的 SUM0化修飾在許多細(xì)胞生命活動中發(fā)揮重要功能。雖然已經(jīng)有報道證實Ubc9在 斑馬魚胚胎早期發(fā)育有重要作用，但各SUMO亞型相應(yīng)的生物學(xué)功能仍然未知。這里我們證 實了類似于基因沉默Ubc9，聯(lián)合基因沉默各SUM0亞型導(dǎo)致胚胎早期發(fā)育異常并致死。值得 注意的是，基因沉默Ubc9后異常胚胎的比率更高于基因沉默SUM0(97. 5% vs 84. 9% )。提 示基因沉默Ubc9的效率更高于聯(lián)合基因沉默SUM0各亞型，可能是Ubc9除了作為SUM0化 途徑的E2連接酶外，還具有其他功能。 2.三種亞型的SUM0在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中存在冗余性
與Ubc9基因沉默的表型相似，三種亞型的SUMO聯(lián)合基因沉默的胚胎表現(xiàn)出最為 嚴(yán)重的發(fā)育缺陷；而基因沉默單一亞型的SUMO或聯(lián)合基因沉默SUM01/SUM02的胚胎無明 顯異常表型；SUM01/SUM03或SUM02/SUM03兩兩聯(lián)合基因沉默的胚胎發(fā)育缺陷率較低。這 與在小鼠與擬南芥菜中沉默某種亞型的SUMO得到的結(jié)果相類似(Zhang， F. P. ， Mikkonen， L. ， Toppari， J. ， Palvimo， J. J. (2008)S咖o-1 function is dispensable in normal mouse development. Molecularand cellular biology 28 :5381-5390禾口 Saracco， S. A.， Miller, M.J. ， Kur印a， J. ， & Vierstra， R. D. (2007) Genetic analysis of SUMOylation inArabidopsis -conjugation of SUM01 and SUM02 to nuclear proteins isessential. Plant physiology 145 :119-134)。提示三種亞型的SUMO在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中存 在一定的冗余性。 3. SUMO缺失后造成特異性的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡 最近有報道證實SUMO參與了哺乳動物細(xì)胞的有絲分裂過程，SUMO缺失后， 可能阻止了姐妹染色單體的正常分離，從而導(dǎo)致了細(xì)胞周期阻滯，最終引起細(xì)胞凋亡 (Zhang， X. D. ， Goeres， J. ， Zhang， H. ， Yen, T.J. (2008) SUM0-2/3 modification and binding regulate theassociation of CENP—E with kinetochores and progression throughmitosis. Molecular cell 29:729-741)。
序列表 〈110〉上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 〈120〉蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法
〈130>DI08-205HC37
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〈160>18〈170>PatentIn version3. 3〈210〉1〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gtctccgtgt ctgacatgatattcc〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2catggttatt gtatttgcgcttctc〈210>3〈211>25<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3taggcttgtc ttcggacatttttgc〈210>4〈211>25〈212>DNA<213>人工序列〈400>4tC3g3gC朋t gCC3g3C3tg〈210>5<211>25〈212>腿〈213〉人工序列〈400〉5gtgtccctgt ctcacatcatatacc〈210>6〈211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ccggaattca tgtcagacacgg3g3CC33g ccctc〈210>7
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1權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)類泛素化修飾缺失型模式生物體斑馬魚模型，其中，該模型利用Morpholino技術(shù)在模式生物體斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中將SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯(lián)合顯微注射入單細(xì)胞期的斑馬魚卵中以單獨或聯(lián)合沉默各SUMO亞型基因的表達(dá)而建立。
2. —種建立蛋白質(zhì)類泛素化修飾缺失型模式生物體斑馬魚模型的方法，其包括將SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯(lián)合顯微注射入單細(xì)胞期 的斑馬魚卵中的步驟以及持續(xù)培養(yǎng)并在倒置解剖顯微鏡下觀察整體表型的步驟。
3. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)類泛素化修飾缺失型模式生物體斑馬魚模型作為蛋白質(zhì) 翻譯后修飾相關(guān)藥物篩選的動物模型的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法，該模型利用Morpholino技術(shù)在模式生物體斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中將SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯(lián)合顯微注射入單細(xì)胞期的斑馬魚卵中以單獨或聯(lián)合沉默各SUMO亞型基因的表達(dá)而建立。
文檔編號C12N15/87GK101748121SQ20081020412
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者周雋, 朱軍 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院