專利名稱：具有益生作用的枯草芽孢桿菌b27及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗生素自20世紀(jì)50年代以來(lái)廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，保證動(dòng)物健康，節(jié)約飼料成本，提高經(jīng)濟(jì)效益等方面做出了巨大貢獻(xiàn)。由于抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的長(zhǎng)期使用，近些年來(lái)，由其所致的毒副作用和藥物殘留問(wèn)題已引起人們的關(guān)注。2006年，歐盟已經(jīng)全面禁止了飼料中抗生素的使用，美國(guó)和日本等國(guó)家也對(duì)其做出了嚴(yán)格的限制。2011年，韓國(guó)全國(guó)禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素。隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，益生菌作為抗生素的替代品倍受關(guān)注，越來(lái)越多的應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料中。益生菌是一類(lèi)能改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡，有益于動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能發(fā)揮的微生物添加劑。其主要作用效果體現(xiàn)在改善動(dòng)物新陳代謝，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用，提高免疫力，減少環(huán)境污染等方面發(fā)揮重要作用。由于芽孢桿菌對(duì)干燥、高溫、高壓、氧化等不良環(huán)境抵抗力很強(qiáng)，這種穩(wěn)定性增加了它作為益生菌的潛力。因此，獲得新型具有益生特性的芽孢桿菌的研究具有重大意義。分離和篩選抗病原菌且具有益生效果的枯草芽孢桿菌，可以更好的應(yīng)用于飼料添加劑，以代替抗生素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明 的目的，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B27，是從北京市大興養(yǎng)豬場(chǎng)附近土壤中篩選到的一株芽孢桿菌。經(jīng)16S rRNA基因序列分析和體外益生效果評(píng)價(jià)，該菌株為能夠抑制病原菌且具有益生效果的枯草芽孢桿菌，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。該菌株現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCCNO. 6538，保藏日期2012年9月7日?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)B27的微生物學(xué)特性為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)莢膜。菌體表明粗糙，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉。本發(fā)明還提供含有該具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的菌劑。本發(fā)明還提供所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27或上述菌劑在廣譜抗菌中的應(yīng)用。其中，具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的抑菌譜包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌；所述革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌，如Staphylococcus aureus IVDC C56005 (中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)；所述革蘭氏陰性菌為致病性大腸桿菌，如K88(Escherichia coli IVDC C83901),鼠傷寒沙門(mén)氏菌，如Salmonella typhimurium IVDCC79-13 (中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)。本發(fā)明還提供所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27在制備動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種含有該具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的動(dòng)物飼料添加劑。本發(fā)明還提供一種含有該具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的動(dòng)物飼料。其中，所述動(dòng)物飼料中枯草芽孢桿菌B27的活菌數(shù)為1.0X108 3.0X108CFU/g基礎(chǔ)日糧，優(yōu)選
2.0X108CFU/g 基礎(chǔ)日糧。本發(fā)明通過(guò)體外法鑒定了枯草芽孢桿菌B27的益生效果，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌B27能夠耐酸、酸膽鹽，能抵抗胃腸道的內(nèi)環(huán)境，具備益生菌的潛力。本發(fā)明還提供了一種體外法鑒定菌株耐酸、耐膽鹽和模擬胃腸道環(huán)境中生長(zhǎng)的益生潛力，包括以下步驟 I)配制不同pH值的培養(yǎng)基，檢測(cè)枯草芽孢桿菌B27的生長(zhǎng)情況；2)配制不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基，檢測(cè)枯草芽孢桿菌B27的生長(zhǎng)情況；3)模擬人工胃腸液，檢測(cè)枯草芽孢桿菌B27的生長(zhǎng)情況。本發(fā)明進(jìn)一步驗(yàn)證了枯草芽孢桿菌B27在斷奶仔豬飼料添加中的應(yīng)用效果。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B27，最適pH 7. 2 7. 4，最適溫度37°C，能夠耐受體內(nèi)環(huán)境，具有良好的益生效果。它是一株能夠抑制腸道內(nèi)病原菌的益生菌，它能夠耐酸耐鹽耐人工胃腸液的環(huán)境，表明其具備益生菌的潛質(zhì)。通過(guò)在斷奶仔豬飼料添加中應(yīng)用效果的研究，表明枯草芽孢桿菌B27可作為一種新型的益生菌添加劑，廣泛應(yīng)用于飼料中。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中枯草芽孢桿菌B27抑制病原菌的生長(zhǎng)情況；其中，A為對(duì)照組，B為試驗(yàn)組。圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中枯草芽孢桿菌B27在不同pH值下的生長(zhǎng)情況。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。以下實(shí)施例中涉及的試驗(yàn)材料和試劑1、菌株病原菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大腸桿菌K88(Escherichia coli IVDCC83901)由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供。2、生化試劑DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司，膽鹽、胃蛋白酶、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，其它均為國(guó)產(chǎn)試劑。3、培養(yǎng)基(I)肉湯培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水lOOOmL，pH值
7.2 7. 4，121。。滅菌 20min。(2)肉湯固體培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水lOOOmL，瓊脂20g, pH 值 7. 2 7. 4，121°C滅菌 20min。以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書(shū)中描述的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌的分離采集北京市大興養(yǎng)豬場(chǎng)附近的土壤，按1:10倍比稀釋于生理鹽水中。取IOOiiL稀釋液涂布于營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。挑起菌落表面形成皺醭的單菌落在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃線分離，重復(fù)劃線分離過(guò)程3輪，使菌株純化。通過(guò)此方法分離到36株菌種，分別命名為B1-B36。實(shí)施例2抗病原菌的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B27的篩選應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散的牛津杯法篩選具有抑菌活力的枯草芽孢桿菌。向肉湯培養(yǎng)基中加入瓊脂后，溶解均勻，高壓滅菌，冷卻到50°C左右，每20mL培養(yǎng)基加入20 y L新鮮培養(yǎng)的指示菌(108CFU/mL)，混勻倒入培養(yǎng)皿冷卻。用滅菌的鑷子將無(wú)菌的牛津杯輕輕的放入培養(yǎng)皿中，在牛津杯中分別加入B1-B36各80 ii L單株菌液，向另一個(gè)牛津杯中加入80 ii L無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作對(duì)照，37°C培養(yǎng)24h。篩選出能形成抑菌圈的菌液(圖1)，其菌株編號(hào)為B27。以上使用的指示菌分別為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDCC56005)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大腸桿菌 K88(Escherichia coli IVDC C83901)。實(shí)施例3枯草芽孢桿菌B27的菌種鑒定取IOmL GF103培養(yǎng)液，低`速離心獲得菌體。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN, DP302)提取細(xì)菌總 DNA。以IOng純化的細(xì)菌總DNA作為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因。所用引物為原核生物16S rRNA基因的通用引物27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '和1492R:5/ -TACCTTGTTACGACTT-3/。引物由北京博邁德生物有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為 50ii L，包括 0. L Taq 酶(0. 5U/mL)、5. 0 ii L10XPCR 反應(yīng)緩沖液、4. Oii L dNTP Mixture、L Oii L模板DNA、1. Oii L正向引物27F(25iimol/L)、1. Oii L反向引物 1492R(25iimol/L)和 37. 5 u L ddH20。擴(kuò)增條件95°C5min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min,
4V終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物序列測(cè)定由北京博邁德生物有限公司完成?？莶菅挎邨U菌B27經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序，提交到GenBank，獲得序列登錄號(hào)為JQ673431 o 測(cè)得序列經(jīng) Blast 比對(duì)，結(jié)果該菌株與 GenBank 中 Bacillus subtilis strainA2 16S ribosomal RNA gene (GenBank accession number:EU567068)序列相似性為 99%。初步確定B27為枯草芽孢桿菌。其微生物學(xué)特性為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)莢膜。菌體表明粗糙，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉。實(shí)施例4枯草芽孢桿菌B27耐酸耐膽鹽特性測(cè)定測(cè)定枯草芽孢桿菌B27在低pH中的生長(zhǎng)狀態(tài)，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為不同PH值梯度，分別為2. O、3. O、4. O、5. O、6. 0和6. 4。枯草芽孢桿菌B27培養(yǎng)液按1%(v/v)分別接種于不同pH值營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，測(cè)OD6tltol值。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，枯草芽孢桿菌B27在pH=2. 0的培養(yǎng)基中存活率為34%，在pH=3的培養(yǎng)基中存活率為72%，說(shuō)明枯草芽孢桿菌B27在低酸的環(huán)境能夠保持一定的活菌數(shù)。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其濃度分別為0%(對(duì)照)、0. 15%、0. 3%和0. 6%。枯草芽孢桿菌B27接種于上述不同濃度的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1，枯草芽孢桿菌能夠耐受0.3%膽鹽濃度。由于動(dòng)物體內(nèi)膽鹽濃度在0. 3%左右，所以枯草芽孢桿菌B27能夠體內(nèi)的膽鹽環(huán)境。表I枯草芽孢桿菌B27在不同濃度膽鹽中培養(yǎng)24h的活菌數(shù)
權(quán)利要求
1.具有益生作用的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B27，其保藏號(hào)為CGMCCNO. 6538。
2.含有權(quán)利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的菌劑。
3.權(quán)利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27或權(quán)利要求2所述菌劑在廣譜抗菌中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的抑菌譜包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌； 所述革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌；所述革蘭氏陰性菌為致病性大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌。
5.權(quán)利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27在制備動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。
6.一種含有權(quán)利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的動(dòng)物飼料添加劑。
7.一種含有權(quán)利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢桿菌B27的動(dòng)物飼料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的動(dòng)物飼料，其特征在于，動(dòng)物飼料中枯草芽孢桿菌B27的活菌數(shù)為1.0\108 3.0父10*^^/^基礎(chǔ)日糧。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的動(dòng)物飼料，其特征在于，動(dòng)物飼料中枯草芽孢桿菌B27的活菌數(shù)為2.0X108CFU/g基礎(chǔ)日糧。
全文摘要
本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCC No.6538的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B27及其應(yīng)用。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌B27，最適pH7.2~7.4，最適溫度37℃，能夠耐受體內(nèi)環(huán)境，具有良好的益生效果，作為一種新型的益生菌添加劑，可廣泛應(yīng)用于飼料中。
文檔編號(hào)A23K1/16GK103060222SQ20121035104
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者刁其玉, 張乃鋒, 屠焰, 董曉麗, 周盟 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所