專利名稱：一種油棕組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，具體地涉及ー種油棕組織培養(yǎng)的方法，利用培養(yǎng)基對(duì)油棕組織進(jìn)行培養(yǎng)與快速繁殖，為油棕良種的大面積推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
油棕原產(chǎn)地在南緯10° 北緯15°、海拔150米以下的非洲潮濕森林邊緣地區(qū)，主要產(chǎn)地分布在亞洲的馬來西亞、印度尼西亞、非洲的西部和中部、南美洲的北部和中美洲。我國引種油棕已有80多年的歷史，主要分布于海南、云南、廣東等地。油棕屬熱帶木本油料作物，其單產(chǎn)是其它油料作物的幾倍至數(shù)十倍，有“世界植物油王”之稱。目前棕櫚油的產(chǎn)量已經(jīng)超過大豆油躍居為世界第一大油料作物，廣泛應(yīng)用于食品和エ業(yè)產(chǎn)品中。油棕目前是通過雜交種子進(jìn)行繁殖，由于油棕的高度雜合性，后代性狀分離嚴(yán)重，通過雜交育種方法繁殖油棕良種需要25 30年的時(shí)間。油棕只有一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，因此常規(guī)的無性繁殖手段如扦插、嫁接都不能進(jìn)行繁殖，因此油棕組織培養(yǎng)技術(shù)是在較短時(shí)間內(nèi)繁殖油棕優(yōu)良單株的有效途徑。目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過油棕組織培養(yǎng)技術(shù)培育的油棕高產(chǎn)無性系，可比現(xiàn)有的主栽品種產(chǎn)量提高25 30%，因此有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景和很高的商業(yè)化價(jià)值。以油棕種胚和以非油棕種胚為外植體材料進(jìn)行繁殖的主要區(qū)別在于，以油棕種胚為材料繁殖相當(dāng)于無性繁殖油棕種子，而以非油棕種胚為外植體材料繁殖相當(dāng)于無性繁殖油棕母樹。目前，國內(nèi)尚未有相關(guān)油棕組織培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法的報(bào)道，特別是應(yīng)用非油棕種胚為外植體材料進(jìn)行繁殖的方法。由于油棕后代的高度雜合性，以非油棕種胚為外植體材料繁殖具有商業(yè)化種植的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種油棕組織培養(yǎng)的方法，以油棕嫩葉作為外植體材料，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)油棕進(jìn)行快速繁殖，可有效地大量繁殖油棕后代，且后代遺傳性狀與親本高度一致，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀，為油棕良種的大面積推廣應(yīng)用提供一條有效途徑。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案ー種油棕組織培養(yǎng)的方法，其步驟如下I、外植體的選取選取樹齡8 10年的油棕母株，切取莖干生長(zhǎng)點(diǎn)上15cm至95cm處的油棕莖段，經(jīng)表面除雜、清洗后進(jìn)行消毒處理，然后將晾干后的外植體轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，剝除外層的老葉片，得到無菌的油棕嫩葉。油棕母株的切面在外植體采集后，對(duì)切面進(jìn)行防護(hù)處理，待恢復(fù)生長(zhǎng)后可以重新取樣。2、愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將油棕嫩葉修剪至大小為lcmX2cm的片樣，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到愈傷組織；將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下暗培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織。3、體細(xì)胞胚的培養(yǎng)將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚狀體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%，每2個(gè)月繼代一次，培養(yǎng)6 12個(gè)月后在胚性愈傷組織表面會(huì)出現(xiàn)白色的胚狀體組織即為體細(xì)胞胚。4、試管芽苗培養(yǎng)將體細(xì)胞胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%，培養(yǎng)60 90天獲得油棕試管芽苗。所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA 0. 01 0. 05mg/L、活性炭1000 5000mg/L、鹿糖30g/L、瓊脂粉7g/L。所述改良MS培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其它成分不變的條件下調(diào)整大量元素的含量為原量的1/4至全量，調(diào)整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為
0.I 5mg/L、0. I 5mg/L、0. I 5mg/L、0. I 5mg/L,并添加精氛酸 50 300mg/L、天冬氛酸50 300mg/L、谷氛酸50 300mg/L。5、生根培養(yǎng)將油棕試管芽苗切分成單株，接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65% ;培養(yǎng)3個(gè)月后再將油棕芽苗轉(zhuǎn)接至液體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為14小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%，培養(yǎng)60天后獲得油棕試管苗。所述生根培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA 10 30mg/L、活性炭1000 5000mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂粉7g/L。所述液體生根培養(yǎng)基以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA 5 30mg/L、活性炭1000 5000mg/L、瓊脂粉7g/し本發(fā)明以油棕嫩葉作為外植體材料，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)油棕進(jìn)行快速繁殖，不受季節(jié)與氣候的限制，可有效地大量繁殖油棕后代，極大的縮短了常規(guī)育種的繁殖周期，且后代遺傳性狀與親本高度一致，為油棕良種的大面積推廣應(yīng)用提供一條有效途徑。


圖I從油棕胚狀體中誘導(dǎo)出的油棕試管芽苗。圖2誘導(dǎo)出的油棕叢芽苗。圖3油棕叢芽進(jìn)行分株。圖4油棕生根培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一I、外植體的選取
選取樹齡8年的油棕高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)母株5株,切取莖干生長(zhǎng)點(diǎn)上15cm至95cm處的油棕莖段，將得到的油棕莖干除去表面雜質(zhì)后，在油棕莖干表面噴涂75%的酒精進(jìn)行殺菌，晾干，然后將晾干的油棕莖干轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，剝除外層的老葉片，得到無菌的油棕嫩葉。2、愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將油棕嫩葉修剪至大小為lcmX2cm的片樣，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50% 65%的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)100天后得到愈傷組織；將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50% 65%的條件下暗培養(yǎng)，培養(yǎng)90天后獲得胚性愈傷組織。3、體細(xì)胞胚的培養(yǎng) 將胚性愈傷組織在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，轉(zhuǎn)接到胚狀體培養(yǎng)基中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強(qiáng)度為1500 20001X，毎日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下，進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)180天培養(yǎng)，獲得油棕體細(xì)胞胚。4、試管芽苗培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，將體細(xì)胞胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 0. 01mg/L +活性炭2000mg/L +蔗糖30g/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量是原量的1/3)中培養(yǎng),培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x,姆日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)60天后獲得油棕試管芽苗，結(jié)果見表I。5、生根培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，將油棕試管芽苗按照芽苗數(shù)量切分成單株，切掉基部組織和部分葉片，然后接種到生根培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 10mg/L +活性炭2000mg/L +蔗糖30g/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量是原量的1/3)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)3個(gè)月后再將油棕芽苗轉(zhuǎn)接至液體生根培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+NAA 5mg/L +活性炭2000mg/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量是原量的1/3)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為14小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)60天后獲得油棕試管苗，結(jié)果見表I。實(shí)施例ニ選取樹齡9年的油棕高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)母株5株，切取莖干生長(zhǎng)點(diǎn)上15cm至95cm處的油棕莖段，將得到的油棕莖干除去表面雜質(zhì)后，在油棕莖干表面噴涂75%的酒精進(jìn)行殺菌，晾干，然后將晾干的油棕莖干轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，剝除外層的老葉片，得到無菌的油棕嫩葉。2、愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將油棕嫩葉修剪至大小為lcmX2cm的片樣，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50% 65%的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)100天后得到愈傷組織；將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50% 65%的條件下暗培養(yǎng)，培養(yǎng)90天后獲得胚性愈傷組織。3、體細(xì)胞胚的培養(yǎng)將胚性愈傷組織在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，轉(zhuǎn)接到胚狀體培養(yǎng)基中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強(qiáng)度為1500 20001X，毎日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下，進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)180天培養(yǎng)，獲得油棕體細(xì)胞胚。4、試管芽苗培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，將體細(xì)胞胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 0. 03mg/L +活性炭3000mg/L +蔗糖30g/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量是原量的1/2)中培養(yǎng),培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x,姆日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)60天后獲得油棕試管芽苗，結(jié)果見表I。5、生根培養(yǎng)
在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，將油棕試管芽苗按照芽苗數(shù)量切分成單株，切掉基部組織和部分葉片，然后接種到生根培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 20mg/L +活性炭3000mg/L +蔗糖30g/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量是原量的1/2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)3個(gè)月后再將油棕芽苗轉(zhuǎn)接至液體生根培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+NAA 20mg/L +活性炭3000mg/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量是原量的1/2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為14小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)60天后獲得油棕試管苗，結(jié)果見表I。實(shí)施例三選取樹齡10年的油棕高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)母株5株,切取莖干生長(zhǎng)點(diǎn)上15cm至95cm處的油棕莖段，將得到的油棕莖干除去表面雜質(zhì)后，在油棕莖干表面噴涂75%的酒精進(jìn)行殺菌，晾干，然后將晾干的油棕莖干轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，剝除外層的老葉片，得到無菌的油棕嫩葉。2、愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將油棕嫩葉修剪至大小為lcmX2cm的片樣，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50% 65%的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)100天后得到愈傷組織；將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50% 65%的條件下暗培養(yǎng)，培養(yǎng)90天后獲得胚性愈傷組織。3、體細(xì)胞胚的培養(yǎng)將胚性愈傷組織在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，轉(zhuǎn)接到含有胚狀體培養(yǎng)基中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強(qiáng)度為1500 20001X，毎日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下，進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)180天培養(yǎng)，獲得油棕體細(xì)胞胚。4、試管芽苗培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，將體細(xì)胞胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 0. 04mg/L +活性炭4500mg/L +蔗糖30g/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量不變)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001X，毎日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)60天后獲得油棕試管芽苗，結(jié)果見表I。5、生根培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上及無菌條件下，將油棕試管芽苗按照芽苗數(shù)量切分成單株，切掉基部組織和部分葉片，然后接種到生根培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 25mg/L +活性炭4000mg/L +蔗糖30g/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量不變)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)3個(gè)月后再將油棕芽苗轉(zhuǎn)接至液體生根培養(yǎng)基(改良MS培養(yǎng)基+ NAA 25mg/L +活性炭4000mg/L +瓊脂粉7g/L，其中MS培養(yǎng)基中大量元素的含量不變)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為14小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%。培養(yǎng)60天后獲得油棕試管苗，結(jié)果見表I。表I油棕組織的誘導(dǎo)率
權(quán)利要求
1. 一種油棕組織培養(yǎng)的方法，其特征在于，其步驟如下 1)、外植體的選取 選取樹齡8 10年的油棕母株，切取莖干生長(zhǎng)點(diǎn)上15cm至95cm處的油棕莖段，經(jīng)表面除雜、清洗后進(jìn)行消毒處理，然后將晾干后的外植體轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，剝除外層的老葉片，得到無菌的油棕嫩葉； 2)、愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將油棕嫩葉修剪至大小為IcmX 2cm的片樣，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到愈傷組織；將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度為25 28°C，濕度為50 65%的條件下暗培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織； 3)、體細(xì)胞胚的培養(yǎng) 將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚狀體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí),溫度為25 28°C,濕度為50 65%,每2個(gè)月繼代一次,培養(yǎng)6 12個(gè)月后在胚性愈傷組織表面會(huì)出現(xiàn)白色的胚狀體組織即為體細(xì)胞胚； 4)、試管芽苗培養(yǎng) 將體細(xì)胞胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001χ，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%，培養(yǎng)60 90天獲得油棕試管芽苗；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA O. 01 O. 05mg/L、活性炭1000 5000mg/L、鹿糖30g/L、瓊脂粉7g/L ； 所述改良MS培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其它成分不變的條件下調(diào)整大量元素的·含量為原量的1/4至全量，調(diào)整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為0. I ·5mg/L、0. I 5mg/L、0. I 5mg/L、0. I 5mg/L,并添加精氨酸 50 300mg/L、天冬氨酸·50 300mg/L、谷氛酸 50 300mg/L ； 5)、生根培養(yǎng) 將油棕試管芽苗切分成單株，接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為·1500 20001x，每日光照時(shí)間為12小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65% ;培養(yǎng)3個(gè)月后再將油棕芽苗轉(zhuǎn)接至液體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度為1500 20001x，每日光照時(shí)間為14小時(shí)，溫度為25 28°C，濕度為50 65%，培養(yǎng)60天后獲得油棕試管苗；所述生根培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA 10 30mg/L、活性炭·1000 5000mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂粉7g/L ;所述液體生根培養(yǎng)基以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加NAA 5 30mg/L、活性炭1000 5000mg/L、瓊脂粉7g/L。
全文摘要
本發(fā)明屬植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，具體地涉及一種油棕組織培養(yǎng)的方法，是切取油棕母株莖干生長(zhǎng)點(diǎn)上的油棕莖段，然后取油棕嫩葉修剪成片樣，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胚性愈傷組織培養(yǎng)基、胚狀體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得油棕體細(xì)胞胚；將體細(xì)胞胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基、液體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得油棕試管苗。本發(fā)明以油棕嫩葉作為外植體材料，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)油棕進(jìn)行快速繁殖，不受季節(jié)與氣候的限制，可有效地大量繁殖油棕后代，極大的縮短了常規(guī)育種的繁殖周期，且后代遺傳性狀與親本高度一致，為油棕良種的大面積推廣應(yīng)用提供一條有效途徑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102860256SQ20121024323
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者鄒積鑫, 林位夫, 潘登浪, 尤麗莉, 張朝陽, 曾憲海, 張希財(cái), 周立軍, 姚行成, 曹建華 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所