專利名稱：基于氣孔感應(yīng)小球藻閉合的免疫蒸騰抑制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于氣孔感應(yīng)小球藻閉合的免疫蒸騰抑制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
淡水稀缺是全球面臨的環(huán)境問(wèn)題。我國(guó)淡水資源極度匱乏，伴隨著全球氣候變化，近年來(lái)更是旱災(zāi)頻發(fā)，大面積作物受災(zāi)，農(nóng)業(yè)損失慘重。因此，開(kāi)發(fā)新型植物抗旱節(jié)水劑，有效控制氣孔的開(kāi)度，降低葉片的過(guò)度蒸騰，提高水分利用效率，是解決中國(guó)水資源危機(jī)和發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)的必由之路。目前市場(chǎng)上的植物蒸騰抑制劑根據(jù)其不同的作用方式和特點(diǎn)，可分為四類①代謝型抗蒸騰劑(Metabolic antitranspirant),常用的有PMA (醋酸苯汞)、ABA、NaHS03、CaCl2、2，4-D、阿特拉津、甲草胺、三唑酮、黃腐酸(FA)，其中除黃腐酸外大都具有嚴(yán)重的環(huán)境毒性(如醋酸苯汞)和生理毒性，危害環(huán)境和人類健康，同時(shí)ABA等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅具有環(huán)境毒性而且價(jià)格昂貴，因此很難推廣使用；②成膜型抗蒸騰劑(Film-forming antitranspirant),常見(jiàn)的成膜型藥劑有 Wilt-Pruf、Vapor Guard、Mobileaf、Folicote、Plant guard 等，大都是國(guó)外昂貴的專利產(chǎn)品，很難自然降解，具有持久污染；③反射型抗蒸騰劑(Reflectingantitranspirant),常用的有:高嶺土 (Kaoline)和高嶺石(Kaolinite),此類制劑的使用量大、效果差并且具有直接降低光合速率的副作用等，目前也較少實(shí)際應(yīng)用；
生物感應(yīng)型抗蒸騰劑(biological induction antitranspirant ),它是王根軒等人發(fā)
明的一種基于釀酒酵母菌的生物型植物抗蒸騰劑，由于釀酒酵母菌可能產(chǎn)生酒精等對(duì)植物有副作用的物質(zhì)，還需要進(jìn)一步的完善才能被實(shí)際應(yīng)用推廣。因此在旱災(zāi)頻發(fā)和水資源危機(jī)日益嚴(yán)重條件下，迫切需要研究開(kāi)發(fā)新型高效無(wú)毒的生物型抗蒸騰制劑和節(jié)水技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于氣孔感應(yīng)小球藻閉合的免疫蒸騰抑制劑的制備方法。本發(fā)明方法包括如下步驟
步驟(I).制備小球藻劑A，方法是
首先將淡水小球藻接種到滅菌后的BGll固體培養(yǎng)基中，置于25°C恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,得到活化后的小球藻；所述的淡水小球藻{Chlorella vulgaris)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)，保藏編號(hào)為FACHB-7 ； 然后將活化后的小球藻接種到滅菌后的BGll液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速150 180 r /min的搖床上振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為20 25°C,培養(yǎng)時(shí)間為7 10個(gè)光照周期；一個(gè)光照周期為24小時(shí)，首先采用光強(qiáng)為2000 3000Lx的白色熒光燈光照14h，再置于黑暗中IOh ；將培養(yǎng)后的小球藻置于離心機(jī)中離心，取沉淀物干燥稱重，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，得到純小球藻液，純小球藻液中純小球藻含量為10 20g/L ;將純小球藻液置于121°C、0. 12 O. 15Mpa壓強(qiáng)下滅活60 80min，制成小球藻劑A ;小球藻劑A于_20°C下凍存；
所述的BGll液體培養(yǎng)基配方及含量為硝酸鈉I. 5 g/L、磷酸氫二鉀O. 04g/L、硫酸鎂0.0758/1、氯化鈣0.036 g/L、檸檬酸O. 006 g/L、檸檬酸鐵銨O. 006 g/L、乙二胺四乙酸二鈉O. 001g/L、碳酸鈉 O. 02 g/L、硼酸 O. 00286 g/L、氯化錳 O. 00186g/L、硫酸鋅 O. 00022g/L、鑰酸鈉O. 00039g/L、硫酸銅O. 00008g/L、硝酸鈷O. 00005g/L，用蒸餾水配制，然后用lmol/L的NaOH 或 HCl 調(diào) pH 至 7. I ;
所述的BGll固體培養(yǎng)基是在上述BGll液體培養(yǎng)基中按照每升15 g添加瓊脂得到； 步驟(2).制備輔劑B，方法是 將CaCl2 · 2H20和羧化殼聚糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻，得到輔劑B;輔劑B中CaCl2 · 2H20的濃度為3g/L，羧化殼聚糖的濃度為O. 01 g/L ；
步驟(3).制備蒸騰抑制劑，方法是
將小球藻劑A加入輔劑B中，攪拌均勻，得到免疫蒸騰抑制劑；小球藻劑A與輔劑B的體積比為O. 01 O. 05 :1。本發(fā)明利用了植物氣孔感應(yīng)微生物而免疫閉合的原理。具體而言，植物氣孔感應(yīng)微生物可主動(dòng)閉合以便防止其進(jìn)入致病的現(xiàn)象被稱為氣孔免疫。其機(jī)制是微生物或源于微生物的分子相關(guān)模式能夠被植物氣孔保衛(wèi)細(xì)胞上的特異性受體所識(shí)別，在外源鈣離子存在的條件下，引發(fā)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生振蕩性變化，進(jìn)而引發(fā)OSTl激酶的活性升高，ROS和NO的產(chǎn)生，異源三聚體G蛋白的活化和K+通道的開(kāi)閉和MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的活化等一系列信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉以防御微生物的入侵。自然界中，植物氣孔又控制著植物的蒸騰和光合作用，由于蒸騰速率與氣孔開(kāi)度接近正相關(guān)，而光合速率隨氣孔開(kāi)度增加則呈飽和曲線(10%氣孔開(kāi)度時(shí)光合速率即已達(dá)90%以上)，所以氣孔感應(yīng)微生物促進(jìn)氣孔開(kāi)度適度變小可以提高植物的水分利用效率。且離體表皮條和活體噴施小球藻試驗(yàn)都一致證明，一定濃度和處理的小球藻可以誘發(fā)植物氣孔相對(duì)開(kāi)度(氣孔開(kāi)度/氣孔長(zhǎng)度)大幅度下降，進(jìn)而增大氣孔阻力，減少蒸騰失水，在一定時(shí)期內(nèi)提高了植物的水分利用效率。本發(fā)明具有的有益效果是
1.基于氣孔免疫閉合機(jī)理的純生物性節(jié)水制劑，比各類已有蒸騰抑制劑更具有節(jié)水、環(huán)保和成本優(yōu)勢(shì)；
2.小球藻為光合培養(yǎng)生產(chǎn)，不僅沒(méi)有碳排放，還可形成新的碳匯，將使相關(guān)生產(chǎn)過(guò)程退向負(fù)碳生產(chǎn)階段；
3.節(jié)水效果明顯，適用范圍廣，是干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)林植物理想的蒸騰抑制節(jié)水劑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.
步驟(I).制備小球藻劑A :
首先將淡水小球藻接種到滅菌后的BGll固體培養(yǎng)基中，置于25°C恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，得到活化后的小球藻；
然后將活化后的小球藻接種到滅菌后的BGll液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速150 r /min的搖床上振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20°C,培養(yǎng)時(shí)間為10個(gè)光照周期；一個(gè)光照周期為24小時(shí)，首先采用光強(qiáng)為2000Lx的白色熒光燈光照14h，再置于黑暗中IOh ；
將培養(yǎng)后的小球藻置于離心機(jī)中離心，取沉淀物干燥稱重，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，得到純小球藻液，純小球藻液中純小球藻含量為10g/L ;純小球藻液置于121°C,0. 12Mpa壓強(qiáng)下滅活60min，制成小球藻劑A ;小球藻劑A于_20°C凍存；
步驟(2).將CaCl2*2H20和羧化殼聚糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻，得到輔劑B;輔劑B中CaCl2 · 2H20的濃度為3g/L，羧化殼聚糖的濃度為O. 01 g/L ；
步驟(3).取50ml小球藻劑A加入IL輔劑B中，攪拌均勻，得到免疫蒸騰抑制劑。實(shí)施例2.
步驟(I).制備小球藻劑A :
首先將淡水小球藻接種到滅菌后的BGll固體培養(yǎng)基中，置于25°C恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，得到活化后的小球藻；
然后將活化后的小球藻接種到滅菌后的BGll液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速160 r /min的搖床上振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23°C，培養(yǎng)時(shí)間為8個(gè)光照周期；一個(gè)光照周期為24小時(shí)，首先采用光強(qiáng)為2500Lx的白色熒光燈光照14h，再置于黑暗中IOh ；
將培養(yǎng)后的小球藻置于離心機(jī)中離心，取沉淀物干燥稱重，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，得到純小球藻液，純小球藻液中純小球藻含量為15g/L ;純小球藻液置于121°C,0. 13Mpa壓強(qiáng)下滅活70min，制成小球藻劑A ;小球藻劑A于_20°C凍存；
步驟(2).將CaCl2*2H20和羧化殼聚糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻，得到輔劑B;輔劑B中CaCl2 · 2H20的濃度為3g/L，羧化殼聚糖的濃度為O. 01 g/L ；
步驟(3).取30ml小球藻劑A加入IL輔劑B中，攪拌均勻，得到免疫蒸騰抑制劑。實(shí)施例3.
步驟(I).制備小球藻劑A :
首先將淡水小球藻接種到滅菌后的BGll固體培養(yǎng)基中，置于25°C恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，得到活化后的小球藻；
然后將活化后的小球藻接種到滅菌后的BGll液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速180 r /min的搖床上振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時(shí)間為7個(gè)光照周期；一個(gè)光照周期為24小時(shí)，首先采用光強(qiáng)為3000Lx的白色熒光燈光照14h，再置于黑暗中IOh ；
將培養(yǎng)后的小球藻置于離心機(jī)中離心，取沉淀物干燥稱重，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，得到純小球藻液，純小球藻液中純小球藻含量為10g/L ;純小球藻液置于121°C,0. 15Mpa壓強(qiáng)下滅活80min，制成小球藻劑A ;小球藻劑A于_20°C凍存；
步驟(2).將CaCl2 · 2H20和羧化殼聚糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻，得到輔劑B ;輔劑B中CaCl2 · 2H20的濃度為3g/L，羧化殼聚糖的濃度為O. 01 g/L ；
步驟(3).取IOml小球藻劑A加入IL輔劑B中，攪拌均勻，得到免疫蒸騰抑制劑。以上實(shí)施例中所用的淡水小球藻(CX7ore77a來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培 養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)，保藏編號(hào)為FACHB-7。所采用的BGll液體培養(yǎng)基配方及含量為硝酸鈉I. 5 g/L、磷酸氫二鉀O. 04g/L、硫酸鎂O. 075g/L、氯化鈣O. 036 g/L、檸檬酸O. 006 g/L、檸檬酸鐵銨O. 006 g/L、乙二胺四乙酸二鈉O. 001g/L、碳酸鈉O. 02 g/L、硼酸O. 00286 g/L、氯化錳O. 00186g/L、硫酸鋅O. 00022g/L、鑰酸鈉O. 00039g/L、硫酸銅O. 00008g/L、硝酸鈷O. 00005g/L，用蒸餾水配制，然后用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)pH至7. I ；BG11固體培養(yǎng)基是在上述BGll液體培養(yǎng)基中按照每升15 g添加瓊脂得到。
將以上三個(gè)實(shí)施例方法配制的蒸騰抑制劑和蒸餾水(做對(duì)照組)分別噴施到植物活體蠶豆的葉片表面，Ih后顯微鏡下活體隨機(jī)測(cè)量50個(gè)氣孔的開(kāi)度和長(zhǎng)度來(lái)計(jì)算氣孔相對(duì)開(kāi)度(氣孔開(kāi)度/氣孔長(zhǎng)度)，同時(shí)用CI-340測(cè)定葉片光合速率和蒸騰速率來(lái)計(jì)算水分利用效率(光合速率/蒸騰速率)，結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，如下表
權(quán)利要求
1.基于氣孔感應(yīng)小球藻閉合的免疫蒸騰抑制劑的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟是 步驟(I).制備小球藻劑A，方法是 首先將淡水小球藻接種到滅菌后的BGll固體培養(yǎng)基中，置于25°C恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，得到活化后的小球藻；所述的淡水小球藻來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)，保藏編號(hào)為FACHB-7 ；然后將活化后的小球藻接種到滅菌后的BGll液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速150 180 r /min的搖床上振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為20 25°C,培養(yǎng)時(shí)間為7 10個(gè)光照周期；一個(gè)光照周期為24小時(shí)，首先采用光強(qiáng)為2000 3000Lx的白色熒光燈光照14h，再置于黑暗中IOh ；將培養(yǎng)后的小球藻置于離心機(jī)中離心，取沉淀物干燥稱重，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，得到純小球藻液，純小球藻液中純小球藻含量為10 20g/L ;將純小球藻液置于121°C、0. 12 .O.15Mpa壓強(qiáng)下滅活60 80min，制成小球藻劑A ;小球藻劑A于_20°C下凍存； 所述的BGll液體培養(yǎng)基配方及含量為硝酸鈉I. 5 g/L、磷酸氫二鉀O. 04g/L、硫酸鎂.0.0758/1、氯化鈣0.036 g/L、檸檬酸O. 006 g/L、檸檬酸鐵銨O. 006 g/L、乙二胺四乙酸二鈉.O.001g/L、碳酸鈉 O. 02 g/L、硼酸 O. 00286 g/L、氯化錳 O. 00186g/L、硫酸鋅 O. 00022g/L、鑰酸鈉O. 00039g/L、硫酸銅O. 00008g/L、硝酸鈷O. 00005g/L，用蒸餾水配制，然后用lmol/L的NaOH 或 HCl 調(diào) pH 至 7. I ; 所述的BGll固體培養(yǎng)基是在上述BGll液體培養(yǎng)基中按照每升15 g添加瓊脂得到； 步驟(2).制備輔劑B，方法是 將CaCl2 · 2H20和羧化殼聚糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻，得到輔劑B;輔劑B中CaCl2 · 2H20的濃度為3g/L，羧化殼聚糖的濃度為O. 01 g/L ； 步驟(3).制備蒸騰抑制劑，方法是 將小球藻劑A加入輔劑B中，攪拌均勻，得到免疫蒸騰抑制劑；小球藻劑A與輔劑B的體積比為O. 01 O. 05 :1。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于氣孔感應(yīng)小球藻閉合的免疫蒸騰抑制劑的制備方法。本發(fā)明方法首先將來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)保藏編號(hào)為FACHB-7的淡水小球藻接種到滅菌后的BG11固體培養(yǎng)基中，恒溫光照下培養(yǎng)得到活化后的小球藻，然后接種到滅菌后的BG11液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心后取沉淀物用蒸餾水進(jìn)行稀釋，滅活后制成小球藻劑A；將CaCl2·2H2O和羧化殼聚糖溶解于蒸餾水中，攪拌得到輔劑B；將小球藻劑A加入輔劑B中，攪拌均勻，得到免疫蒸騰抑制劑。本發(fā)明方法比各類已有蒸騰抑制劑的制備更節(jié)水、環(huán)保、節(jié)約成本。
文檔編號(hào)A01P21/00GK102626111SQ20121008566
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者徐珊珊, 李巖, 王根軒, 高靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)