專利名稱：一種交替單胞菌及其在抑制赤潮藻生長中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種交替單胞菌及其在抑制赤潮藻生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
赤潮是一種嚴(yán)重的全球性海洋自然災(zāi)害，近年來赤潮發(fā)生次數(shù)增多、發(fā)生區(qū)域擴大、危害日益加劇。對赤潮(或赤潮藻)的發(fā)生進(jìn)行有效防控是保護海洋環(huán)境的首要前提。 以往的研究中雖已開發(fā)出一些赤潮的控制技術(shù)，如物理方法、化學(xué)方法和一些生物治理方法，但這些方法都各自存在一定的缺陷，治理水華的效果不甚理想。例如物理方法中的黃泥漿絮凝法需要較大的劑量才能起到抑制的效果，這在一定程度上增加了操作的難度和成本的投入；一些化學(xué)方法如殺藻劑，在殺滅藻類的同時，也給其他生物帶來了直接或間接的危害，不能體現(xiàn)環(huán)境友好型特性；一些生物學(xué)方法如投放攝食藻類的大型生物(魚類)，也存在打破食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)，破壞種群穩(wěn)定的生態(tài)風(fēng)險。海洋環(huán)境的復(fù)雜性造就了其豐富的微生物多樣性，其獨特的遺傳特性和特殊的適應(yīng)機制，成為基因庫和生物活性物質(zhì)的重要來源。海洋微生物通過微食物環(huán)在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著極其重要的作用，并同藻類存在著錯綜復(fù)雜的關(guān)系。值得一提的是，細(xì)菌、放線菌、病毒等各種微生物可以通過直接或間接的作用專一性地抑制藻類的生長甚至裂解藻細(xì)胞，因此微生物是調(diào)節(jié)赤潮生消的重要因子之一?；跀?shù)量龐大、分布廣泛、多樣性豐富的海洋微生物及其重要作用，以微食物環(huán)為核心，探究有效調(diào)控赤潮生消的重要微生物因子，充分利用其與赤潮生物的互作特點與規(guī)律，開發(fā)和利用源自赤潮頻發(fā)海域的特殊功效微生物并以宏基因組技術(shù)獲得海洋環(huán)保功能菌與工程菌，進(jìn)行赤潮的有效防治，將可能成為解決赤潮災(zāi)害這一復(fù)雜而嚴(yán)峻的海洋問題的金鑰匙。近年來,溶藻細(xì)菌(algicidal bacteria)的發(fā)現(xiàn)給赤潮的治理帶來了新的曙光。 它作為水生生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，對維持藻類生物量平衡具有非常重要的作用。不少國外研究者認(rèn)為赤潮的突然消亡可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)。溶藻細(xì)菌作為水華防治的可能微生物，已引起越來越多的關(guān)注。多數(shù)溶藻細(xì)菌能夠分泌細(xì)胞外物質(zhì)，對宿主藻類起抑制或殺滅作用。因此，目前將赤潮的防治方法轉(zhuǎn)向微生物治理，且這一類方法已日益得到關(guān)注和認(rèn)可。在這一領(lǐng)域中已篩選和培養(yǎng)了多種殺藻、溶藻的微生物，包括放線菌、變形桿菌、假單胞菌、粘細(xì)菌等。以往的研究中對溶藻細(xì)菌的篩選是沒有嚴(yán)格區(qū)分赤潮發(fā)生期和非發(fā)生期， 使得篩選的菌株缺乏針對性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株交替單胞菌(Alteromonas sp. ) 18#。本發(fā)明提供的交替單胞菌(Alteromonassp. ) 18#，其保藏號為CGMCC NO. 5804。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述交替單胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCC NO. 5804胞外提取物的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟I)發(fā)酵交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804,離心收集上清液；2)用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有機相，即得到胞外提取物。上述方法中，步驟I)中，所述發(fā)酵的溫度為30°C，所述發(fā)酵的時間為24_36h ;所述離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min,所述離心的時間為20min,所述離心半徑為13. 5cm ；步驟2)中，所述上清液和乙酸乙酯萃取體積比為I : 2，所述萃取的時間為 2h-3h。上述方法中，所述發(fā)酵的溫度為30°C，所述發(fā)酵的時間為24小時-36小時，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為2216E海水液體培養(yǎng)基(配方蛋白胨5. 0g，酵母膏I. 0g，磷酸鐵O. Olg,陳海水 1000mL,iI pH 至 7. 8)；上述方法中，在步驟2)中，在所述收集有機相后還依次包括去除所述有機相中的乙酸乙酯和溶解的步驟；上述去除所述有機相中的乙酸乙酯具體為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所述有機相，收集產(chǎn)物I ;上述溶解具體為用甲醇溶解所述產(chǎn)物I ;在所述步驟I)和步驟2)之間還包括過濾所述上清液的步驟；上述過濾具體采用的濾膜孔徑為O. 22 μ m。由上述方法制備的所述交替單胞菌(Alteromonas sp. ) 18#CGMCC NO. 5804胞外提取物也是本發(fā)明保護的范圍。上述的交替單胞菌(Alteromonas sp. ) 18#CGMCC NO. 5804或上述的胞外提取物在防治赤潮中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應(yīng)用中，所述防治赤潮通過抑制赤潮藻生長實現(xiàn)。上述抑制赤潮藻生長體現(xiàn)在如下I) -4)中4種或者其中任意一種I)降低赤潮藻密度；2)降低赤潮藻的葉綠素含量；3)降低赤潮藻的光合效率；4)改變了赤潮藻中蛋白表達(dá)譜。上述蛋白具體為功能蛋白上述應(yīng)用為向赤潮藻的生長體系中加入上述的交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804或上述的胞外提取物，以抑制赤潮藻生長；所述赤潮藻具體為亞歷山大藻。在本發(fā)明的實施例中，具體抑制赤潮藻生長的方法為向赤潮藻的生長體系中加入上述的交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804的胞外提取物，以抑制赤潮藻生長。上述赤潮藻的生長體系為人工培育體系；上述人工培育體系為將赤潮藻在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到人工培育體系；上述人工培育體系中的培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)液；上述胞外提取物在所述人工培育體系中的終濃度具體為10ppb-100ppb。上述方法中，所述赤潮藻為亞歷山大藻。本發(fā)明的第三個目的是提供一種赤潮藻抑制劑。
本發(fā)明提供的赤潮藻抑制劑，其活性成分為上述的交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804或其胞外產(chǎn)物；所述赤潮藻具體為亞歷山大藻。上述菌株18#為Y -變形桿菌綱(Gammaproeobacterium),交替單胞菌目 (Alteromonadales),交替單胞菌科(Alteromonadaceae),交替單胞菌屬(Alteromonas)菌株，已于2012年2月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC NO. 5804，其分類命名為交替單胞菌(Alteromonas sp.)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種交替單胞菌(Alteromonas sp.)18#,該細(xì)菌及其胞外產(chǎn)物具有抑藻的功能，可以用來抑制赤潮；該細(xì)菌其胞外產(chǎn)物具體具有如下優(yōu)點1)篩選的抑藻細(xì)菌來自赤潮發(fā)生的海域，利于重新投放到自然環(huán)境中使用；2)胞外產(chǎn)物的殺藻效果明顯且該物質(zhì)可規(guī)模化發(fā)酵制備，具有很強的可操作性；3)藻類抑制赤潮的方法，遵循了生物“生生相克”的原理，不會產(chǎn)生二次污染，是一種環(huán)境友好型方法。


圖I 為彎角藻(Eucampia zoodiacus Ehrenberg)的形態(tài)特征圖2為編號為18#細(xì)菌對藻類抑制的結(jié)果其中，*表不差異顯著(P < O. 05) 表不差異極顯著(P < O. 01)圖3為編號為18#細(xì)菌16S_rRNA的編碼基因的PCR電泳圖譜圖4為胞外產(chǎn)物的提取示意5為6天時不同劑量胞外產(chǎn)物對藻細(xì)胞的生存狀態(tài)的影響圖6為不同劑量胞外產(chǎn)物對藻密度影響的效果曲線圖7為胞外產(chǎn)物對亞歷山大藻葉綠素含量的影響圖8為胞外產(chǎn)物對亞歷山大藻光合效率的影響圖9為胞外產(chǎn)物對藻細(xì)胞功能蛋白的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。f/2培養(yǎng)液具體配方如下(每升海水中含無機鹽質(zhì)量)=NaNO3 37. 5mg, NaH2PO4 2. 5mg, Fe-EDTA 2. 5mg (FeCl3 I. 6g+EDTA 0. 9g)，鹽酸硫銨素 5 μ g, Biotin VH O. 025 μ g, VB12 O. 025 μ g, CuSO4. 5Η20 O. 0098 μ g, ZnSO4. 7Η20 O. 022 μ g, CaCl2. 6Η20 O. 01 μ g, MgCl2. 4Η20 O. 180 μ g，Na2MoO4. 2Η20，O. 0063 μ g。亞歷山大藻(Alexandrium catenella)(香港株，中國科學(xué)院海洋研究所提供，產(chǎn)品目錄號Algae20060309)實施例I、交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#的篩選及鑒定一、交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18# 的篩選2011年4月21日，南中國海近岸(深圳蛇口港)發(fā)生局域赤潮(深圳蛇口港赤潮發(fā)生區(qū)表層)，此次赤潮的原因藻為彎角藻(Eucampia zoodiacus Ehrenberg)(圖I)，屬于娃藻門 BaciIIariophyceae，脆桿藻科Fragilariaceae Schroder,海線藻屬 ThalassionemaGrunow。從該區(qū)域取回水樣,水樣帶回實驗室后經(jīng)紗布過濾,除掉水中雜質(zhì)和大型顆粒物； 隨后經(jīng)100 μ m金屬網(wǎng)格過濾，除掉水中的有機碎屑；最后經(jīng)10 μ m濾膜過濾除取藻細(xì)胞，濾液進(jìn)行涂布和篩菌。將上述準(zhǔn)備好的濾液進(jìn)行倍比稀釋，取30 μ L涂布于2216Ε海水固體培養(yǎng)基上 (配方:蛋白胨5. 0g，酵母膏1.(^，磷酸鐵0.018，陳海水1000ml，瓊脂20g，調(diào)pH至7. 8)， 過夜培養(yǎng)，直至長出清晰的單克隆。共挑選出100株可培養(yǎng)細(xì)菌。隨后挑取單克隆在2216E液體培養(yǎng)基中(ImL)，搖床上30°C培養(yǎng)12小時，備用。將挑選的單克隆菌株以IX IO6個/mL的量加入亞歷山大藻培養(yǎng)液(將亞歷山大藻在f/2培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液)中作為實驗組，連續(xù)監(jiān)測I周內(nèi)對藻類生長的抑制情況，以不加入單克隆菌株為對照組，在雙筒顯微鏡下計數(shù)(4X10倍)檢測藻密度，每個樣品計數(shù)3次， 結(jié)果取平均值。其中編號為18#細(xì)菌對藻類抑制的結(jié)果如圖2所示，可以看出，添加菌液一天后即能抑制藻類的生長，兩天后實驗組的藻細(xì)胞密度下降為對照組的52. 6%，至三天時， 實驗組的藻類基本停止生長與分裂，90%的藻類生長被抑制，藻類生物量與對照組相比顯示極顯著差異(P <0.01)。因此，認(rèn)為初步篩選得到菌株18#。二、18#菌株的鑒定I、生理生化特征鑒定I. I形態(tài)觀察采用2216E固體培養(yǎng)基，將純化后的18#單克隆菌株于30°C下培養(yǎng)24h，并進(jìn)行革蘭氏染色及菌體形態(tài)的顯微鏡觀察(油鏡，放大倍數(shù)1000倍)。染色方法參照《微生物學(xué)檢驗實驗指導(dǎo)》的方法進(jìn)行(作者桂芳，出版社中國醫(yī)藥科技出版社，出版時間2009年 8月，ISBN =9787506742238)。實驗結(jié)果表明菌株為革蘭氏陰性菌；形態(tài)為兩端鈍圓的小桿菌，具鞭毛，菌體大小為(O. 4 O. 5) X (I. O 2. O) μ m。I. 2生理生化特征生理生化特征的檢測采用變形桿菌套裝生化鑒定試劑盒進(jìn)行(上海麗臣ELISA試劑盒廠，產(chǎn)品編號20214)。實驗結(jié)果顯示硫化氫陽性，苯丙氨酸脫氫酶陽性，脲酶陽性。2、分子鑒定提取菌株18#的DNA，利用16SrRNA通用引物(正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ； 反向引物CTGAGCCAGGATCAAACTCT) PCR擴增出PCR產(chǎn)物即為16S_rRNA的編碼基因，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，1-8泳道為8個平行，將得到條帶大小為1300bp的產(chǎn)物送去測序，結(jié)果該PCR產(chǎn)物(16S-rRNA的編碼基因)具有序列表中序列I所示的核苷酸。經(jīng)序列比對后證明，菌株18#的16S_rRNA的編碼基因與Y -變形桿菌綱(Gammaproteobacterium),交替單胞菌目(Alteromonadales),交替單胞菌科 (Alteromonadaceae),交替單胞菌(Alteromonas sp.)的 16S_rRNA 的編碼基因有 98% 的相似性(Genbank AF529061)。因此上述菌株18#為Y-變形桿菌綱(Gammaproteobacterium),交替單胞菌目 (Alteromonadales),交替單胞菌科(Alteromonadaceae),交替單胞菌屬(Alteromonas)菌株，已于2012年2月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 06110，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC NO. 5804，其分類命名為交替單胞菌(Alteromonas sp.)。實施例2、交替單胞菌(Alteromonas sp. ) 18#在抑藻中的應(yīng)用一、交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#抑藻的方法I、交替單胞菌(Alteromonas sp. ) 18#的發(fā)酵培養(yǎng)及胞外產(chǎn)物的獲得將由實施例I 得到的交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804 在 200mL 三角瓶中進(jìn)行一級培養(yǎng)(2216E液體培養(yǎng)基，配方蛋白胨5.0g，酵母膏l(xiāng).Og，磷酸鐵 0. Olg,陳海水IOOOmL,調(diào)ph至7. 8)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速200r/min,時間14h，待菌株密度接近OD6tltl = 2時，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入2000mL的三角瓶中進(jìn)行二級培養(yǎng)(2216E液體培養(yǎng)基， 配方:蛋白胨5. 0g，酵母膏1.(^，磷酸鐵0.018，陳海水IOOOmL,調(diào)pH至7. 8)，培養(yǎng)條件為 30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，時間36小時，直至培養(yǎng)基基本耗盡，細(xì)胞密度不在增加為止。收集發(fā)酵培養(yǎng)液，離心(4°C，8000r/min, 20min,離心半徑13. 5cm)，取上清液。將上清液進(jìn)一步用0. 22 μ m的濾膜進(jìn)行過濾，以除掉期間未能離心去除的菌液和少量雜質(zhì)。 將濾液收集到干凈的玻璃容器中，按照I : 2的體積比例加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，用磁力攪拌器充分混勻，持續(xù)混合萃取3h。之后用分液漏斗將水相和有機相分開，收集水相進(jìn)行第二次萃取。將兩次萃取的有機相合并，裝入IL容量的蒸餾燒瓶中，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(55°C)，待液體蒸發(fā)完畢用甲醇將蒸餾物進(jìn)行溶解，所得溶液即為胞外產(chǎn)物(圖4)。2、實驗用藻細(xì)胞的培養(yǎng)實驗所用藻種為亞歷山大藻(Alexandrium catenella)(香港株)。取實驗室傳代培養(yǎng)的藻種(初始密度為0. 3X IO4個/mL)，分裝于15個IOOOmL的三角瓶中(每瓶裝液500mL)，分裝后培養(yǎng)連續(xù)監(jiān)測，待藻處于對數(shù)生長期的前期時，即藻密度在0. 6 X IO4個/ mL(藻在藻培養(yǎng)液中的密度)時，進(jìn)行如下分組試驗，試驗設(shè)五個實驗組，每組3個平行。藻的培養(yǎng)條件如下溫度為21±1°C，光照時間L D = 12h 12h，光照強度 3000Lxo五個實驗組分別如下空白組(不含甲醇溶劑，不含細(xì)菌胞外產(chǎn)物)，繼續(xù)培養(yǎng)；對照組(含甲醇溶劑，不含細(xì)菌胞外產(chǎn)物)，再向三角瓶中加入無水甲醇，甲醇的終濃度為0. 05% (v/v)，繼續(xù)培養(yǎng)；胞外產(chǎn)物Ippb (含甲醇溶劑，含細(xì)菌胞外產(chǎn)物)再向三角瓶中加由上述I得到的胞外產(chǎn)物，使胞外產(chǎn)物的終濃度為lppb (m/v)，繼續(xù)培養(yǎng)；胞外產(chǎn)物IOppb (含甲醇溶劑，含細(xì)菌胞外產(chǎn)物)再向三角瓶中加由上述I得到的胞外產(chǎn)物，使胞外產(chǎn)物的終濃度為IOppb (m/v)，繼續(xù)培養(yǎng)；胞外產(chǎn)物IOOppb (含甲醇溶劑，含細(xì)菌胞外產(chǎn)物)再向三角瓶中加由上述I得到的胞外產(chǎn)物，使胞外產(chǎn)物的終濃度為IOOppb (m/v)，繼續(xù)培養(yǎng)。將上述各組加入各種物質(zhì)記作繼續(xù)培養(yǎng)的第O天。二、檢測I、胞外產(chǎn)物對藻的殺滅效果將上述5組的培養(yǎng)產(chǎn)物在雙筒顯微鏡下(4X 10倍)進(jìn)行藻細(xì)胞計數(shù)，每個樣品計數(shù)3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖5和圖6所示，圖5為6天時不同劑量胞外產(chǎn)物對藻細(xì)胞的生存狀態(tài)的影響，可以看出Ippb時，藻細(xì)胞均勻分布，藻培養(yǎng)液呈淺黃色；100ppb時，藻細(xì)胞碎裂、溶解， 部分細(xì)胞沉底，藻培養(yǎng)呈白色。圖6為不同劑量胞外產(chǎn)物對藻密度影響的效果曲線，可以看出，空白組在0、2、4、6、8、10 天的藻密度(個/mL)分別為 6000、6100、6300、6800、 8600、12000。對照組在0、2、4、6、8、10 天的藻密度(個/mL)分別為 6100、6150、6200、6700、 8300、11000。胞外產(chǎn)物Ippb在0、2、4、6、8、10天的藻密度(個/mL)分別為6050、6160、6300、 6800、7200、8900。胞外產(chǎn)物IOppb 在 0、2、4、6、8、10 天的藻密度(個/mL)分別為 6200、6200、5400、 4200、3000、2500。胞外產(chǎn)物IOOppb 在 0、2、4、6、8、10 天的藻密度(個/mL)分別為 6250、5200、3000、 1200、1002、1002?？梢钥闯?，從O天顯微鏡檢開始,交替單胞菌(Alteromonas sp. ) 18#胞外產(chǎn)物對藻細(xì)胞的殺滅作用呈現(xiàn)劑量關(guān)系，隨著濃度的提高殺滅效果更顯著，至6天左右殺滅率達(dá) 80%以上，抑藻效果達(dá)到峰值。2、胞外產(chǎn)物對亞歷山大藻葉綠素和光合效率的影響檢測上述5組繼續(xù)培養(yǎng)的藻的葉綠素、光合效率，具體方法如下各組赤潮藻的葉綠素和光合效率測量采用浮游植物分類熒光儀(ΡΗΥΤ0-ΡΑΜ)進(jìn)行，具體操作如下，取3mL 藻液(連續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)產(chǎn)物)裝入測量杯置于暗盒內(nèi)，對藻體進(jìn)行20min暗適應(yīng)，打開 Phyto-PAM調(diào)制脈沖熒光儀波長為520nm強度為O. I μ mol/(m2 · s)的綠色檢測光。測量過程由Phytowin軟件控制，開啟測量光(ML)，待光信號穩(wěn)定后打開飽和脈沖鍵，記下Fv/Fm 值，即為光合效率yield值。葉綠素水平的(ChI)測定也使用該儀器進(jìn)行。結(jié)果如圖7和圖8所示，其中，圖7為胞外產(chǎn)物對亞歷山大藻葉綠素含量的影響， 圖8為胞外產(chǎn)物對亞歷山大藻光合效率的影響；從圖7中可以看出，空白組在0、2、4、6、8、10 天的葉綠素含量(μ g/L)分別為 21. 3、26· 3、39· 4、45· 7、 47. 7,54. 5。對照組在0、2、4、6、8、10 天的葉綠素含量(μ g/L)分別為 23. 2、27· 2、38· 7、47· 8、 49. 7,55. I。胞外產(chǎn)物Ippb在0、2、4、6、8、10天的葉綠素含量(μ g/L)分別為22. 2,26. 7、 38. 5、45· 6、45· 3、53· 2。胞外產(chǎn)物IOppb在0、2、4、6、8、10天的葉綠素含量(μ g/L)分別為21. 9、23· 4、 16. 8,15. 3,15. 9,15. 8。胞外產(chǎn)物IOOppb在0、2、4、6、8、10天葉綠素含量(μ g/L)分別為23. 0、22. I、
11.3,10. 6,10. 4、9· 8?？梢钥闯?，高劑量胞外產(chǎn)物(10和IOOppb)相比于對照組，其葉綠素水平明顯低于對照組，其值只有對照組的25-30% (P < O. 05)。從圖8中可以看出，空白組在0、2、4、6、8、10天的光合效率(Fv/Fm)分別為O. 45、O. 47,0. 46,0. 57,0. 6,0. 61。對照組在0、2、4、6、8、10 天的光合效率(Fv/Fm)分別為 O. 46、0· 48、0· 47、0· 56、 O. 63、0· 64。胞外產(chǎn)物Ippb 在 0、2、4、6、8、10 天的光合效率(Fv/Fm)分別為 O. 45,0. 46,0. 5、
O.58、0· 63、0· 64。胞外產(chǎn)物IOppb 在 0、2、4、6、8、10 天的光合效率(Fv/Fm)分別為 O. 47、0· 47、0· 48、
O.35、0· 35、0· 38。胞外產(chǎn)物IOOppb 在 0、2、4、6、8、10 天光合效率(Fv/Fm)分別為 O. 46、0· 4、0· 4、
O.3、0· 31、0· 31。可以看出，外源添加高劑量的胞外產(chǎn)物(10和IOOppb)，藻細(xì)胞光合效率水平較低，而對照組則有一個明顯的上升過程。這表明，胞外產(chǎn)物的存在，給藻的生理帶來了應(yīng)激壓力，藻類自身的能量被用于應(yīng)對環(huán)境脅迫，從而減少了其獲取光能的捕獲。3、胞外產(chǎn)物對藻細(xì)胞功能蛋白的影響為了進(jìn)一步探討胞外產(chǎn)物的抑藻機理，分析了胞外產(chǎn)物對藻功能性蛋白的影響。取對照組和胞外產(chǎn)物IOOppb組的繼續(xù)培養(yǎng)10天后的產(chǎn)物，離心(4°C，8000r/min, 20min,離心半徑13. 5cm)后收集沉淀,將沉淀在液氮下進(jìn)行低溫研磨。研磨產(chǎn)物用O. IM的 Tris-Cl緩沖液(Tris堿，12. Ilg ;蒸餾水，800mL ;HC1，49mL，三者混勻充分溶解后，滴加濃鹽酸調(diào)pH至7. 8,定溶至IOOOmL)溶解,得到研磨液,再將研磨液進(jìn)行硫酸銨沉淀(20%濃度鹽溶，65%濃度鹽析沉淀)、除鹽(4°C，0. IM的Tris-Cl緩沖液，透析過夜)、除雜處理后 (10000r/min,4°C,離心30min,離心半徑13. 5cm,去除不溶顆粒)，得到蛋白提取物。將蛋白提取物進(jìn)行二維電泳(蛋白上樣量，400μ g ;膠條，pH 3-10線性梯度膠條；膠條上限電流， 50A/根；等電聚焦溫度，20°C ；SDS-PAGE膠濃度，12. 5% ;儀器，Bio-Rad 二維電泳儀)，所得圖譜用F1DQuest軟件進(jìn)行分析。結(jié)果如圖9所示，可以看出，胞外產(chǎn)物IOOppb組和對照組的全蛋白圖譜存在明顯差異，其中差異蛋白點有40個以上，占到整個功能蛋白的32% (發(fā)生差異表達(dá)的蛋白點占整個圖譜中蛋白點的百分比)。這表明胞外產(chǎn)物對藻細(xì)胞有明顯的生理影響。
權(quán)利要求
1.交替單胞菌(Alteromonassp.) 18#，其保藏號為 CGMCC NO. 5804。
2.一種制備權(quán)利要求I所述交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804胞外提取物的方法，包括如下步驟1)發(fā)酵交替單胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCC NO. 5804，離心收集上清液；2)用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有機相，即得到胞外提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟I)中，所述發(fā)酵的溫度為30°C，所述發(fā)酵的時間為24-36h ;所述離心的轉(zhuǎn)速為 8000r/min,所述離心的時間為20min,所述離心半徑為13. 5cm ；步驟2)中，所述上清液和乙酸乙酯萃取體積比為I : 2，所述萃取的時間為2h-3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于在步驟2)中，在所述收集有機相后還依次包括去除所述有機相中的乙酸乙酯和溶解的步驟；在所述步驟I)和步驟2)之間還包括過濾所述上清液的步驟。
5.由權(quán)利要求2_4的方法制備的所述交替單胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCCN0. 5804 胞外提取物。
6.權(quán)利要求I所述的交替單胞菌(Alteromonassp.) 18#CGMCC NO. 5804或權(quán)利要求5 所述的胞外提取物在防治赤潮中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述防治赤潮通過抑制赤潮藻生長實現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制赤潮藻生長體現(xiàn)在如下 I)-4)中4種或者其中任意一種1)降低赤潮藻密度；2)降低赤潮藻的葉綠素含量；3)降低赤潮藻的光合效率；4)改變了赤潮藻中蛋白表達(dá)譜。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為向赤潮藻的生長體系中加入權(quán)利要求I所述的交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804或權(quán)利要求5 所述的胞外提取物，以抑制赤潮藻生長；所述赤潮藻具體為亞歷山大藻。
10.一種赤潮藻抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求I所述的交替單胞菌(Alteromonas sp.) 18#CGMCC NO. 5804或其胞外產(chǎn)物；所述赤潮藻具體為亞歷山大藻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種交替單胞菌及其在抑制赤潮藻生長中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的交替單胞菌(Alteromonas sp.)18#，其保藏號為CGMCC NO.5804。本發(fā)明還提供了一種制備上述交替單胞菌(Alteromonas sp.)18#CGMCC NO.5804胞外提取物的方法。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種交替單胞菌(Alteromonas sp.)18#，該細(xì)菌及其胞外產(chǎn)物具有抑藻的功能，可以用來抑制赤潮。
文檔編號A01N63/02GK102604868SQ201210075599
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者周進(jìn), 蔡中華, 詹五根, 陳璐 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院