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假交替單胞菌、所產(chǎn)的κ-卡拉膠水解酶及其制備和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):583581閱讀:245來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:假交替單胞菌、所產(chǎn)的κ-卡拉膠水解酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種假交替單胞菌、所產(chǎn)的K -卡拉膠水解酶及其制備和應(yīng)用,屬于 微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
海藻寡糖硫酸酯具有抗病毒、抗發(fā)炎、抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等多種生物和生理 功能,其功能決定于結(jié)構(gòu)特征,譬如糖單元結(jié)構(gòu)、分子量、硫酸酯化程度和硫酸酯化位置等 (Liu J M, et al. Anticancer Res,2000,20 :3265_3271)。卡拉膠(又稱角叉菜膠、鹿角菜膠)是許多海洋紅藻細(xì)胞壁的主要組分,這類含有 硫酸酯基團(tuán)的線性多糖由交叉連接的(1 — 3)-3-D-半乳吡喃糖與(1 —4)-a_D-半乳吡 喃糖(或3,6-脫水-a-D-半乳吡喃糖)構(gòu)成其骨架結(jié)構(gòu)。商業(yè)上應(yīng)用廣泛的主要是k-卡 拉膠、I-卡拉膠和卡拉膠,它們?cè)诿總€(gè)二糖單元上分別有1、2和3個(gè)硫酸酯。因此, 卡拉膠的降解產(chǎn)物引起人們廣泛的興趣(MouH,et al. J Appl Phycol, 2003,15 =297-303) 0 現(xiàn)行的酸法水解條件過(guò)于強(qiáng)烈,往往造成卡拉膠易變但富有價(jià)值的骨架結(jié)構(gòu)遭受破壞 (Barbeyron T, et al. Mol BiolEvol,1998,15 :528_537)。酶法水解很受期待(Knutsen S H, et al. Carbohydr Ploym,1992,19 :199-210),并且已經(jīng)從噬纖維菌(Cytophaga,Potin P, et al. Eur J Biochem,1991,201 :241_247)、假單胞菌(Pseudomonas, 0stgaard K, et al. Enzyme MicrobTechnol, 1993,15 :326_333)、弧菌(Vibrio, Araki T, et al. Fish Sci, 1999,65 :937-942)、交替單胞菌(Alteromonas,Michel G, et al. Acta Crystallogr D, 2000,56 766-768)和假交替單胞菌(Pseudoalteromonas,Michel G, et al. Structure, 2001,9:513-525)等海洋細(xì)菌中分離得到卡拉膠水解酶。但是,其應(yīng)用因卡拉膠水解 酶生產(chǎn)率過(guò)低而受到很大的限制(Dyrset N, et al. Enzyme Microb Technol, 1997,20 418-423)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供一種假交替單胞菌所產(chǎn)的K -卡拉膠水解酶 及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供的假交替單胞菌WZU4771菌株,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC N0. 3407。上述的假交替單胞菌菌株用于發(fā)酵得到K -卡拉膠水解酶的方法,其特征在于, 包括如下步驟1)發(fā)酵將所述假交替單胞菌WZU4771接入含K -卡拉膠的培養(yǎng)基中,溫度20 35°C,優(yōu)選25°C,培養(yǎng)24 48h,離心,取上清液。2)分離0 4°C下,將步驟1)所述上清液經(jīng)(NH4) 2S04鹽析和DEAE-纖維素層析, 冷凍干燥后,得到所述的K-卡拉膠水解酶。具體步驟為(1)向所述上清液中加入固體 (NH4)2S04至56%的飽和度,攪拌,離心,得上清液II,向上清液II中加入固體(NH4)2S04至65%的飽和度,攪拌,離心,收集沉淀物;(2)將步驟1)所述沉淀物溶于濃度為0. 05mM、pH 7. 1的Tris-HCl緩沖溶液,所述緩沖溶液中還含有0. OlM的2-巰基乙醇,在相同的緩沖溶 液中透析后,裝載到DEAE-纖維素DE52層析柱上,用濃度為0. IM的KCl溶液洗脫,收集具 有κ-卡拉膠水解酶活性的餾分;(3)向步驟⑵所述的餾分中加入固體(NH4)2SO4至65% 的飽和度,攪拌,離心,收集沉淀物,將沉淀物溶于濃度為0. 05mM、pH 7. 1的Tris-HCl緩沖 溶液,所述緩沖溶液中還含有0. OlM的2-巰基乙醇,在相同的緩沖溶液中透析,冷凍干燥, 得到κ -卡拉膠水解酶。作為優(yōu)選,步驟1)將假交替單胞菌WZU4771以占含κ-卡拉膠的培養(yǎng)基體積 3% 10%的接種量接入含κ-卡拉膠的培養(yǎng)基中。
作為優(yōu)選,步驟1)所述培養(yǎng)基為含質(zhì)量濃度6% 10%碳源、0.3% 0.7%氮源、 0.3% κ-卡拉膠和1.5% NaCl的水溶液。所述碳源為葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖 或乳糖中的一種,優(yōu)選葡萄糖。所述氮源為玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨或 硝酸鈉中的一種,優(yōu)選玉米漿。上述方法制備的K “卡拉膠水解酶,分子量為45000,能夠水解K “卡拉膠中的 β-α —3)-鍵,最終得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。本發(fā)明還提供一種上述κ-卡拉膠水解酶用于制備κ-新卡拉四糖硫酸酯的方 法,包括如下步驟1)向κ _卡拉膠水溶液中加入所述的κ _卡拉膠水解酶,混合液經(jīng)攪拌,離心去除 不溶物,真空蒸發(fā),冷凍干燥,得凍干粉;2)將步驟1)所述凍干粉溶解于乙醇水溶液中,離心去除不溶物,取上清液、蒸發(fā) 去除乙醇后,用蒸餾水稀釋,然后裝載到聚丙烯胺凝膠Bio-Gel P-6 DG層析柱上,以濃度為 0. IM的NaNO3水溶液洗脫,收集含κ -新卡拉四糖硫酸酯的餾分,在蒸餾水中透析,真空蒸 發(fā),冷凍干燥,得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。本發(fā)明能夠達(dá)到以下技術(shù)效果1、假交替單胞菌WZU4771在κ -卡拉膠的誘導(dǎo)下合成并向胞外分泌κ -卡拉膠水 解酶,葡萄糖和玉米漿分別是其最佳碳源和最佳氮源。采用間歇發(fā)酵,通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和 培養(yǎng)條件,可以獲得50U/mL所述的κ-卡拉膠水解酶。與迄今已見報(bào)道的、間歇發(fā)酵產(chǎn)生 33U/mL 的 κ -卡拉膠水解酶的假單胞菌 Pseudomonas carrageenovora NCIMB 302 (Dyrset N, et al. Enzyme MicrobTechnol, 1997, 20 418-423)比較,所述假交替單胞菌 WZU4771 的 κ -卡拉膠水解酶生產(chǎn)能力大為提高,極具開發(fā)前景。2、本發(fā)明提供的κ -卡拉膠水解酶的分子量為45000,不能水解t -卡拉膠、λ -卡 拉膠、瓊脂、海藻酸、幾丁質(zhì)、淀粉和纖維素,能夠水解κ-卡拉膠中的β-α —3)-鍵,最終 得到K -新卡拉四糖硫酸酯,具有很高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。。3、本發(fā)明提供的κ -卡拉膠水解酶,40°C熱處理2hr能夠保持90%的酶活性,而 70°C熱處理7.5min則完全失活。與迄今已見報(bào)道、來(lái)源于噬纖維菌(Cytophaga)、40°C熱 處理Ihr保持90%的酶活性的κ-卡拉膠水解酶(BarbeyronT,et al.Mol Biol Evo 1, 1998,15:528-537)比較,更具熱穩(wěn)定性。最適溫度30°C,最適pH值7. 5。在所述的最適溫 度和最適PH值下,酶促反應(yīng)服從米氏方程,轉(zhuǎn)換數(shù)為125s、米氏常數(shù)為0. 015mM(0. 56mg/ mL)。迄今已見報(bào)道的κ-卡拉膠水解酶的米氏常數(shù)為3. 3mg/mL(來(lái)源于弧菌Vibriosp. CA-1004, Araki Τ, etal. Fish Sci,1999,65 :937_942)和 6. 66mg/mL[來(lái)源于假單胞 菌 Pseudomonaselongta(MTCC 5261)syn. Microbulbifer elongates, Khambhaty Y, et al. BiotechnolBioprocess Eng,2007,12 :668_675]。米氏常數(shù)小,表明酶對(duì)底物的親和力強(qiáng)。


圖1是κ _新卡拉四糖硫酸酯的洗脫曲線;圖2是假交替單胞菌WZU4771生物量和κ -卡拉膠水解酶活性的時(shí)間曲線;圖3是κ _新卡拉四糖硫酸酯的核磁共振圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明,以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以 更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施,但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。( 一 )假交替單胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771 的篩選假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771從浙江省溫州市甌江口洞頭海域收 集的紅藻活體葉片上采用平板劃線法分離得到,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心,其保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO. 3407,保藏起始日期為2009年11 月5日。具體的篩選步驟如下1.初篩取從浙江省溫州市甌江口洞頭海域收集的紅藻活體葉片,用無(wú)菌海水洗 凈,浸沒在所述的初篩培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)數(shù)日。將培養(yǎng)液在含有所述的初篩培養(yǎng)基的瓊脂 平板上平行劃線,培養(yǎng)數(shù)日。將在瓊脂平板上形成透明圈的菌落轉(zhuǎn)接到新的瓊脂平板上,培 養(yǎng)數(shù)日。重復(fù)以上步驟,直至得到純培養(yǎng)物。初篩培養(yǎng)基為含有以下濃度成分的水溶液(g/L) κ -卡拉膠2、NaCl 15,NaNO3 2、KH2PO4 1. 3、MgS04 · 7H20 0.5、CaCl2 (XliPFeCl3 0· 01,pH 值 7.5。2.復(fù)篩將純培養(yǎng)物接種到所述的復(fù)篩培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)。離心分離得到上清 液,測(cè)定上清液的κ-卡拉膠水解酶活性。復(fù)篩培養(yǎng)基為含有以下濃度成分的水溶液(g/L) : κ-卡拉膠2、酵母膏1、NaCl 15、NaNO3 2、KH2PO4 1. 3、MgSO4 · 7H20 0.5、CaCl2 (XliPFeCl3 0. 01, pH {t 7. 503.酶活性測(cè)定方法取1. OmL上清液與2. OmL底物[以濃度為20mM的Tris-HCl 緩沖溶液(PH 7. 5)配制的、質(zhì)量濃度為0. 25%的κ-卡拉膠水溶液]混合,置于(37 士 2)°C 保溫2hr,然后將混合液置于沸水浴中熱處理15min以終止酶反應(yīng)。采用3,5-二硝基水楊 酸(DNS)比色法測(cè)定還原糖,定義每分鐘從κ-卡拉膠中水解出Iymol還原糖所需要的酶 量為1個(gè)酶活性單位(U)。4.篩選指標(biāo)以上清液的κ -卡拉膠水解酶活性濃度(U/mL)為指標(biāo),篩選得到 κ-卡拉膠水解酶生產(chǎn)率高的菌株。5.得到的假交替單胞菌WZU4771具有如下特征菌株的形態(tài)學(xué)特征為細(xì)胞分散,短桿狀,長(zhǎng)(1. O 2.5) μ m、寬(0. 5 0. 7) μ m, 革蘭氏陰性,不形成孢子,端生鞭毛,能夠運(yùn)動(dòng)。菌落呈葉狀邊緣的不規(guī)則圓形,直徑 (3 7) mm,中間稍突起,粘性,不透明,黃色。
菌株的生理學(xué)特征為化能異養(yǎng),專性好氧,觸酶和氧化酶陽(yáng)性。生長(zhǎng)需要NaCl, 無(wú)NaCl時(shí)幾乎不能生長(zhǎng),高濃度的NaCl抑制其生長(zhǎng),而濃度在(10 60) g/L時(shí)NaCl對(duì)生 長(zhǎng)基本沒有影響。最適生長(zhǎng)溫度為(23 27)°C。根據(jù)16S rRNA序列分析結(jié)果,結(jié)合其形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征,所述的菌株鑒定為假 交替單胞菌(Pseudoalteromonas),命名為 WZU4771。所述的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771在k -卡拉膠的誘導(dǎo)下合成 并向胞外分泌K-卡拉膠水解酶,葡萄糖和玉米漿分別是其最佳碳源和最佳氮源。采用間 歇發(fā)酵,通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,可以獲得50U/mL所述的k -卡拉膠水解酶。與迄今 已見報(bào)道的、間歇發(fā)酵產(chǎn)生33U/mL、流加發(fā)酵產(chǎn)生84U/mL的k -卡拉膠水解酶的假單胞菌 Pseudomonas carrageenovora NCIMB302(Dyrset N,et al. Enzyme Microb Technol, 1997, 20 418-423)比較,所述的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771極具開發(fā)前景。(二)K -卡拉膠水解酶的生產(chǎn)1.發(fā)酵所述的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的優(yōu)化培養(yǎng)基為含 有質(zhì)量濃度6% 10%的碳源、0.3% 0.7%的氮源、0.3%的k-卡拉膠和1.5%的NaCl 的水溶液;優(yōu)化培養(yǎng)條件是以占優(yōu)化培養(yǎng)基體積3% 10%的接種量接入所述的優(yōu)化培養(yǎng) 基,采用間歇發(fā)酵以(20 35)°C、(100 400)rpm培養(yǎng)(24 48)hr。發(fā)酵液以(8000 15000) g離心(20 40)min,得到上清液。上清液的k -卡拉膠水解酶活性濃度為(40 50)U/mL。2.分離所有步驟在(0 4) !下操作。向上清液中加入固體(NH4)2S04至56% 的飽和度,攪拌6hr,以15000g離心分離20min。向上清液中加入固體(NH4)2S04至65%的 飽和度,攪拌6hr,以15000g離心分離20min,收集沉淀物。將沉淀物溶于濃度為0. 05mM的 Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 1)中,上述緩沖溶液中還含有濃度為0. 01M的2-巰基乙醇,在 相同的緩沖溶液中透析6hr,裝載到DEAE-纖維素DE52層析柱上,用濃度為0. 1M的KC1溶 液以90mL/hr的速率洗脫。收集具有k -卡拉膠水解酶活性的餾分,加入固體^扎)#04至 65%的飽和度,攪拌6hr,以15000g離心分離20min,收集沉淀物。將沉淀物溶于以濃度為 0. 05mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 1)中,上述緩沖溶液中還含有濃度為0. 01M的2-巰基 乙醇,在相同的緩沖溶液中透析6hr,冷凍干燥,得到所述的k -卡拉膠水解酶。3. k-卡拉膠水解酶的特性所述的K -卡拉膠水解酶的分子量為45000,不能水解t _卡拉膠、\ _卡拉膠、 瓊脂、海藻酸、幾丁質(zhì)、淀粉和纖維素,能夠水解k-卡拉膠中的0-(1 — 3)-鍵,最終得到 k -新卡拉四糖硫酸酯。40°C熱處理2hr能夠保持90%的酶活性,而70°C熱處理7. 5min則 完全失活。與迄今已見報(bào)道、來(lái)源于噬纖維菌(CytOphaga)、40°C熱處理lhr保持90%的酶 活性的 k -卡拉膠水解酶(Barbeyron T,et al.MolBiol Evol,1998,15 :528_537)比較,更 具熱穩(wěn)定性。最適溫度301,最適?11值7.5。在所述的最適溫度和最適pH值下,酶促反應(yīng) 服從米氏方程,轉(zhuǎn)換數(shù)為125s—1,米氏常數(shù)為0. 015mM(0. 56mg/mL)。迄今已見報(bào)道的K -卡 拉膠水解酶的米氏常數(shù)為3. 3mg/mL (來(lái)源于弧菌Vibrio sp. CA_1004,Araki T,et al. Fish Sci, 1999,65 :937_942)和 6. 66mg/mL[來(lái)源于假單胞菌 Pseudomonas elongta(MTCC5261) syn. Microbulbifer elongates, Khambhaty Y,et al. Biotechnol Bioprocess Eng,2007, 12 668-675] 0米氏常數(shù)小,表明酶對(duì)底物的親和力強(qiáng)。
(三)κ_新卡拉四糖硫酸酯的制備配制濃度為15g/L的κ -卡拉膠水溶液,加入200U/L所述的κ -卡拉膠水解酶。 混合液在所述的最適溫度30°C和最適pH值7. 5下,以200rpm攪拌6hr。以15000g離心分 離20min,去除不溶物,真空蒸發(fā),冷凍干燥。凍干粉溶解于體積比為5 1的乙醇水溶液 中,以15000g離心分離20min,去除不溶物。上清液真空蒸發(fā)去除乙醇后,用蒸餾水稀釋,然 后裝載到聚丙烯胺凝膠Bio-GelP-6DG層析柱上,用濃度為0. IM的NaNO3溶液以4mL/hr的 速率洗脫,洗脫曲線見圖1。收集第67-77號(hào)餾分,在蒸餾水中透析6hr,真空蒸發(fā),冷凍干
燥O凍干粉經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜和核磁共振(圖譜見附圖3) 測(cè)定,其化學(xué)位移和不同Cl信號(hào)的強(qiáng)度與文獻(xiàn)報(bào)道一致(Rochas C, et al. Int JBiol Macromol,1983,5 :111-115),結(jié)構(gòu)為κ-新卡拉四糖硫酸酯4_硫酸酯-β-D-半乳吡 喃糖-(1 — 4)-3,6-脫水1-0-半乳吡喃糖-(1 — 3)-4_硫酸酯-β-D-半乳吡喃 糖-(1 — 4) -3,6-脫水-α -D-半乳吡喃糖?;|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在m/z 850-910顯示4個(gè)主要的峰,分別對(duì) 應(yīng)于4種寡糖的鈉和/或鉀鹽(表1)。表1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜
m/z_離子_
~ 855.5AnGal^+Galp4sNa+AnGalj! +Galp4sNa+Na873.4AnGal/7+Gal/74sNa+AnGalp+Galp4SNa+K
891.8AnGalp+Gal/ 4sNa+AnGal/7+Galp4sK+K
909.3AnGalp+Galp4SK+AnGal/ +Galp4sK+K注=AnGalp代表3,6_脫水-α -D-半乳吡喃糖;Galp4sK代表硫酸酯被鉀離子取代的4_硫酸酯-β-D-半乳吡喃糖;Galp4sNa代表硫酸酯被鈉離子取代的4_硫酸酯-β-D-半乳吡喃糖
實(shí)施例實(shí)施例1取從浙江省溫州市甌江口洞頭海域收集的紅藻海頭紅(Plocamium telfairiae) 活體葉片,剪成直徑約為1. 5cm的小圓片,用無(wú)菌海水清洗3次,浸沒在裝有50mL初篩培 養(yǎng)基的500mL三角瓶中,在200rpm的搖床上于25°C培養(yǎng)72hr。將5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝有 50mL新鮮的初篩培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,在相同的條件下培養(yǎng)。重復(fù)以上步驟,直至培養(yǎng) 液明顯渾濁。將渾濁培養(yǎng)液用無(wú)菌海水稀釋10倍,在含有初篩培養(yǎng)基的瓊脂平板上平行劃 線,置于25°C培養(yǎng)48hr。將在瓊脂平板上形成透明圈的菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的含有初篩培養(yǎng)基 的瓊脂平板上,置于25°C培養(yǎng)48hr。重復(fù)以上步驟,直至得到純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物接種到裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,在200rpm的搖床上 于25°C培養(yǎng)24hr。將5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝有50mL新鮮的復(fù)篩培養(yǎng)基的500mL三角瓶中, 在相同的條件下培養(yǎng)48hr。培養(yǎng)液以15000g離心分離20min,按所述的酶活性測(cè)定方法測(cè)定上清液的K-卡拉膠水解酶活性。以上清液的K -卡拉膠水解酶活性濃度(U/L)為指標(biāo),篩選得到K -卡拉膠水解 酶生產(chǎn)率高的菌株。根據(jù)所述的菌株的16S rRNA序列分析結(jié)果,結(jié)合其形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征,鑒定為 假交替單胞菌(Pseudoalteromonas),命名為 WZU4771。上述初篩培養(yǎng)基為含有以下濃度成分的水溶液(g/L) 卡拉膠2、NaCl 15, NaN03 2、KH2P04 1. 3、MgS04 7H20 0.5、CaCl2 0. 1 禾口 FeCl3 0. 01, pH {t 7. 50上述復(fù)篩培養(yǎng)基為含有以下濃度成分的水溶液(g/L) 卡拉膠2、酵母膏1、 NaCl 15、NaN03 2、KH2P04 1. 3、MgS04 7H20 0.5、CaCl2 0. 1 禾口 FeCl3 0. 01, pH {t 7. 50酶活性測(cè)定方法取l.OmL所述的上清液與2.0mL底物[以濃度為20mM的 Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 5)配制、濃度為0. 25%的k _卡拉膠溶液]混合,置于(37士2) V 保溫2hr,然后將所述的混合液置于沸水浴中熱處理15min以終止酶反應(yīng)。采用3,5- 二硝 基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定還原糖含量,定義每分鐘從k -卡拉膠水解出1 P mol還原糖所 需要的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。實(shí)施例2分別選取幾種不同的碳源,濃度均為1%,以0. 的酵母膏為氮源,另加0.2% 的k-卡拉膠和1.5%的NaCl,配制培養(yǎng)基,接種量為10%,培養(yǎng)溫度為25°C,搖床轉(zhuǎn)速為 200rpm,進(jìn)行假交替單胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771的k-卡拉膠水解酶發(fā)酵。培養(yǎng) 48hr,結(jié)果如表1所示,葡萄糖為最佳碳源。表1碳源對(duì)K -卡拉膠水解酶發(fā)酵的影響 實(shí)施例3分別選取幾種不同的氮源,有機(jī)氮源濃度均為0. 1%,無(wú)機(jī)氮源濃度折合相當(dāng)于 0. 5g/L的(NH4)2S04的氮含量,以的葡萄糖為碳源,另加0. 2%的k -卡拉膠和1. 5%的 NaCl,配制培養(yǎng)基,接種量為10%,培養(yǎng)溫度為25°C,搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,進(jìn)行假交替單胞 菌(Pseudoalteromonas) WZU4771的k -卡拉膠水解酶發(fā)酵。培養(yǎng)48hr,結(jié)果如表2所示, 玉米漿為最佳氮源。表2氮源對(duì)K -卡拉膠水解酶發(fā)酵的影響
8 實(shí)施例4培養(yǎng)基含有的葡萄糖、0. 的玉米漿和1. 5%的NaCl,另外分別添加0. 2%的 K -卡拉膠、半乳糖和乳糖,接種量為10%,培養(yǎng)溫度為25°C,搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,進(jìn)行假交 替單胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771的κ -卡拉膠水解酶發(fā)酵。培養(yǎng)48hr,結(jié)果如表 3所示,κ -卡拉膠誘導(dǎo)假交替單胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771合成κ -卡拉膠水解 酶,而半乳糖和乳糖不能誘導(dǎo)假交替單胞菌(Pseud0alter0m0nas)WZU4771合成κ-卡拉膠 水解酶。表3誘導(dǎo)物對(duì)κ -卡拉膠水解酶發(fā)酵的影響 實(shí)施例5培養(yǎng)基含有的葡萄糖、0. 的玉米漿和1.5%的NaCl,另加0.2%的κ-卡 拉膠,接種量為10%,搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,在不同的培養(yǎng)溫度下,進(jìn)行假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas) WZU4771的κ -卡拉膠水解酶發(fā)酵。培養(yǎng)48hr,結(jié)果如表4所示,最 佳溫度為(25-30) V。表4溫度對(duì)κ -卡拉膠水解酶發(fā)酵的影響
實(shí)施例6培養(yǎng)基含有8%的葡萄糖、0.5%的玉米漿和1.5%的NaCl,另加0. 3 %的 K-卡拉膠,接種量為10%,培養(yǎng)溫度為25 °C,搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,進(jìn)行假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas) WZU4771的κ -卡拉膠水解酶發(fā)酵。其生物量和κ -卡拉膠水解酶活 性的時(shí)間曲線如圖2所示,發(fā)酵液的酶活性在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期快速增加,并在穩(wěn)定期達(dá)到50U/ 以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例,本發(fā)明的保護(hù)范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換,均在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一株假交替單胞菌,其特征在于,所述菌株為假交替單胞菌WZU4771,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCCNO.3407。
2.權(quán)利要求1所述的假交替單胞菌得到K-卡拉膠水解酶的方法,其特征在于,包括如 下步驟1)發(fā)酵將所述假交替單胞菌WZU4771接入含K-卡拉膠的培養(yǎng)基中,溫度20 35°C 下,培養(yǎng)24 48h,離心,取上清液;2)分離0 4°C下,將步驟1)所述上清液經(jīng)(NH4)2S04鹽析和DEAE-纖維素層析,冷凍 干燥,得到所述的k-卡拉膠水解酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,步驟1)將假交替單胞菌WZU4771以占所 述含k -卡拉膠的培養(yǎng)基體積3% 10%的接種量接入所述培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,步驟1)所述培養(yǎng)基為含質(zhì)量濃度6% 10%碳源、0. 3% 0. 7%氮源、0. 3% k-卡拉膠和1. 5% NaCl的水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述碳源為葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽 糖、蔗糖或乳糖中的一種,所述氮源為玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨或硝酸 鈉中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述碳源為葡萄糖,所述氮源為玉米漿。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,步驟1)所述溫度為25°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,步驟2)所述上清液經(jīng)(NH4)2S04鹽析和 DEAE-纖維素層析的具體步驟為(1)向所述上清液中加入固體(冊(cè)4)諷4至56%的飽和度,攪拌,離心,得上清液II,向 上清液II中加入固體(冊(cè)4)#04至65%的飽和度,攪拌,離心,收集沉淀物;(2)將步驟(1)所述沉淀物溶于濃度為0.05mM、pH 7. 1的Tris_HCl緩沖溶液,所述緩 沖溶液中還含有0. 01M的2-巰基乙醇,在相同的緩沖溶液中透析后,裝載到DEAE-纖維素 DE52層析柱上,用濃度為0. 1M的KC1溶液洗脫,收集具有k -卡拉膠水解酶活性的餾分;(3)向步驟⑵所述的餾分中加入固體(NH4)2S04至65%的飽和度,攪拌,離心,收集沉 淀物,將沉淀物溶于濃度為0. 05mM、pH 7. 1的Tris_HCl緩沖溶液,所述緩沖溶液中還含有 0. 01M的2-巰基乙醇,在相同的緩沖溶液中透析,冷凍干燥,得到k -卡拉膠水解酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求2 8中任一項(xiàng)所述方法得到的k-卡拉膠水解酶,其特征在于,所 述k-卡拉膠水解酶的分子量為45000,能夠水解卡拉膠中的(1 — 3)-鍵,最終得 到k-新卡拉四糖硫酸酯。
10.權(quán)利要求9所述的K-卡拉膠水解酶用于制備K-新卡拉四糖硫酸酯的方法,其特 征在于,包括如下步驟1)向K-卡拉膠水溶液中加入所述的K-卡拉膠水解酶,混合液經(jīng)攪拌,離心去除不溶 物,真空蒸發(fā),冷凍干燥,得凍干粉;2)將步驟1)所述凍干粉溶解于乙醇水溶液中,離心去除不溶物,取上清液,蒸發(fā)去除 乙醇后,用蒸餾水稀釋,然后裝載到聚丙烯胺凝膠Bio-Gel P-6DG層析柱上,以濃度為0. 1M 的NaN03水溶液洗脫,收集含k-新卡拉四糖硫酸酯的餾分,在蒸餾水中透析,真空蒸發(fā),冷 凍干燥,得到k-新卡拉四糖硫酸酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771,所述菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCCNO.3407。上述的假交替單胞菌WZU4771所產(chǎn)的κ-卡拉膠水解酶,能夠水解κ-卡拉膠,最終得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101864388SQ20101017543
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者趙肖為 申請(qǐng)人:溫州大學(xué)
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