專利名稱：源自巴西橡膠樹的乳膠分泌組織特異性srpp啟動(dòng)子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自巴西橡膠樹乳膠分泌組織特異性SRPP啟動(dòng)子及其用途。更詳細(xì)地，涉及源自巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)的小橡膠粒子蛋白(SRPP, small rubberparticle-associated protein)啟動(dòng)子,其由SEQ ID N0.1的堿基序列構(gòu)成；包含上述啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化上述重組植物表達(dá)載體的植物體及其種子；使外源基因在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)乳膠分泌組織特異性表達(dá)的方法，該方法包括在上述重組植物表達(dá)載體上重組外源基因的步驟；以及由上述方法制備的外源基因在乳膠分泌組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物體及其種子。
背景技術(shù)：
通常被稱為橡膠樹(rubber tree)的巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)屬于大戟科(family Euphorbiaceae),是在橡膠樹屬中經(jīng)濟(jì)層面上最為重要的一種樹。巴西橡膠樹可大量生產(chǎn)作為天然橡膠主要原料的乳膠(latex)，幾乎是目前工業(yè)上唯一已知的天然橡膠資源。90%以上的天然橡膠由馬來(lái)西亞、印度尼西亞、泰國(guó)及緬甸等東南亞地區(qū)生產(chǎn)，而韓國(guó)每年使用的20萬(wàn)噸以上的天然橡膠全部都是依靠進(jìn)口獲得。
橡膠樹中橡膠的生物合成在橡膠樹產(chǎn)乳菌絲(lactifer)細(xì)胞質(zhì)的乳膠中浮游的橡膠粒子(rubber particle)表面產(chǎn)生。已知上述橡膠粒子結(jié)合有幾個(gè)橡膠粒子結(jié)合蛋白質(zhì)(RPP,rubber particle-associated protein),其中 SRPP 是與直徑在 10 μ m 以下的小橡膠粒子結(jié)合的蛋白質(zhì)。但是關(guān)于SRPP是否只在乳膠組織中表達(dá)這一問題，還處于還沒有經(jīng)過(guò)組織解剖學(xué)方法進(jìn)行精密驗(yàn)證的狀態(tài)。
蛋白質(zhì)的合成始于DNA編碼的遺傳信息傳遞到mRNA的轉(zhuǎn)錄(transcription)過(guò)程。上述轉(zhuǎn)錄通過(guò)位于基因上游(upstream)的啟動(dòng)子與RNA聚合酶(polymerase)的結(jié)合而開始。所有的啟動(dòng)子在離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)一定距離的位置上具有共有堿基序列(consensussequence),已知其對(duì)于RNA聚合酶的啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合來(lái)說(shuō)非常重要。這些啟動(dòng)子是決定重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生效率的重要因素之一。
現(xiàn)有的源自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子是在雙子葉植物的所有組織中表達(dá)效率極佳的啟動(dòng)子。因此，是在植物體中表達(dá)基因方面最能夠有效使用的啟動(dòng)子。但是，上述啟動(dòng)子不適合使特定基因轉(zhuǎn)化而僅在所需要的組織表達(dá)時(shí)使用。因此非常需要研究開發(fā)出一種組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其能夠減少需要的組織外的其它組織中的不必要的表達(dá)。
本發(fā)明人制備了對(duì)于SRPP重組蛋白質(zhì)的抗體，并實(shí)施免疫染色分析法，其目的在于，確認(rèn)源自巴西橡膠樹的SRPP基因是否在乳膠分泌組織中特異性表達(dá)。
韓國(guó)授權(quán)專利第10-0789274號(hào)公開有一種源自谷氨酸棒狀桿菌的新型啟動(dòng)子，韓國(guó)授權(quán)專利第10-078 1059號(hào)公開有一種轉(zhuǎn)化植物體的制備方法，該方法利用源自擬南芥的環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，使靶蛋白質(zhì)在保衛(wèi)細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明是為了實(shí)現(xiàn)上述目的而完成的。本發(fā)明人通過(guò)組織解剖學(xué)方法確認(rèn)了源自巴西橡膠樹的SRPP、蛋白質(zhì)僅在乳膠分泌組織中特異性表達(dá)，對(duì)SRPP啟動(dòng)子堿基序列進(jìn)行研究后，制備了在SRPP啟動(dòng)子上結(jié)合標(biāo)記(Marker)基因(GUS)的轉(zhuǎn)化載體CpBI 101-SRPPpro::⑶S)，將其轉(zhuǎn)化到具有乳膠分泌組織、且容易轉(zhuǎn)化的模型植物體-俄羅斯蒲公英上，確認(rèn)了依靠SRPP啟動(dòng)子的⑶S表達(dá)是否在乳膠分泌組織中特異性的被誘導(dǎo)，從而完成了本發(fā)明。
技術(shù)方案
為了解決上述課題，本發(fā)明提供源自巴西橡膠樹的SRPP啟動(dòng)子，其由SEQ ID N0.1的堿基序列構(gòu)成。
此外，本發(fā)明提供包含上述啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體。
此外，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化上述重組植物表達(dá)載體的植物體及其種子。
此外，本發(fā)明提供使外源基因在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)乳膠分泌組織特異性表達(dá)的方法，該方法包括在上述重組植物表達(dá)載體上重組外源基因的步驟。
此外，本發(fā)明提供由上述方法制備的外源基因在乳膠分泌組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物體及其種子。
有益效果
利用本發(fā)明的源自巴西橡膠樹的SRPP啟動(dòng)子，可獲得使外源基因在乳膠分泌組織中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物體，因此有望在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)天然橡膠生物合成過(guò)程和生產(chǎn)率的增減。


圖1示出了利用免疫組織解剖學(xué)分析對(duì)巴西橡膠樹葉柄中SRPP蛋白質(zhì)的表達(dá)位置進(jìn)行確定的結(jié)果。
圖2為從巴西橡膠樹葉中提取的基因組DNA中分離SRPP啟動(dòng)子的過(guò)程的模式圖。
圖3示出了用于啟動(dòng)子-GUS分析制備的轉(zhuǎn)化載體的模式圖。將分離的SRPP啟動(dòng)子插入至Hind III和X mal之間，從而制備了重組載體(pBIlOl-SRPPpromotor::⑶S(pBI 101-SRPP啟動(dòng)子::⑶S))，以誘導(dǎo)GUS基因的表達(dá)。
圖4為表示將pBI 101-SRPP啟動(dòng)子:AUS載體轉(zhuǎn)化至具有乳膠分泌組織的俄羅斯蒲公英的過(guò)程的照片。(A)表示在葉子切片愈傷組織(Callus)中轉(zhuǎn)化的新生芽從卡那霉素(Kanamycin)選擇培養(yǎng)基 中長(zhǎng)出，(B)將轉(zhuǎn)化的俄羅斯蒲公英轉(zhuǎn)至土壤培養(yǎng)基后培養(yǎng)2_3個(gè)月。(C)提取基因組(Genomic) DNA初次驗(yàn)證轉(zhuǎn)化，(D)提取總(Total) RNA后根據(jù)NPT II(卡那霉素)基因的表達(dá)情況，篩選出5個(gè)最終轉(zhuǎn)化的俄羅斯蒲公英品系(lines)。
圖5示出了與非轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英(野生型(Wild Type))的根組織中未檢測(cè)出⑶S基因的表達(dá)相比(左側(cè))，在SRPP啟動(dòng)子:AUS轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英根部檢測(cè)出⑶S基因表達(dá)的RT-PCR結(jié)果(右側(cè))。TkGAPDH表示看家基因(house-ke印ing gene)。在乳膠分泌組織極少的葉子組織中，在俄羅斯蒲公英SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化體的葉子中幾乎未檢測(cè)出⑶S基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明SRPP啟動(dòng)子在乳膠組織中特異性表達(dá)⑶S基因。圖6為表示俄羅斯蒲公英SRPP啟動(dòng)子:AUS轉(zhuǎn)化體的根部發(fā)生⑶S染色的照片(右側(cè))。與之相比，非轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英(野生型)的根部組織中則未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色⑶S染色(左側(cè))。圖7為為了進(jìn)一步調(diào)查根部的GUS染色是否具有乳膠分泌組織特異性，在顯微鏡下對(duì)切斷的根部橫截面進(jìn)行拍攝并的照片。野生型俄羅斯蒲公英根部組織的橫截面中未見藍(lán)色⑶S染色(A)，與此相反，SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化的俄羅斯蒲公英根部組織的橫截面中的⑶S染色則顯示出了乳膠組織特異性(B)。在其旁邊附加了將四角形內(nèi)的部分?jǐn)U大的照片。圖8示出了在乳膠分泌組織中生成的乳膠分泌液中對(duì)⑶S染色進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果，俄羅斯蒲公英SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化體中顯示出了藍(lán)色GUS染色(右側(cè))。與之相比，非轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英(野生型)的乳膠分泌液中未見⑶S染色(左側(cè))。這些結(jié)果均證明了 SRPP啟動(dòng)子在乳膠分泌組織較多的部位，特別是根部乳膠分泌組織中，更準(zhǔn)確地說(shuō)是在乳膠分泌液中表達(dá)。
具體實(shí)施例方式為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供源自巴西橡膠樹的SRPP啟動(dòng)子，其由SEQ IDNo。I的堿基序列構(gòu)成。上述SRPP啟動(dòng)子能在乳膠分泌組織中特異性表達(dá)特定基因。與目前使用較為廣泛的源自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子表達(dá)全部組織中導(dǎo)入的基因相比，本發(fā)明的乳膠分泌組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子能夠在轉(zhuǎn)化的植物體中的乳膠分泌組織中特異性表達(dá)導(dǎo)入的基因。 此外，上述啟動(dòng)子序列的變異體包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。變異體為發(fā)生了堿基序列的變化，但仍具有與SEQ ID N0.1的堿基序列相似功能性特性的堿基序列。更確切地說(shuō)，上述啟動(dòng)子可包含與SEQ ID N0.1的堿基序列具有70%以上的序列同源性的堿基序列，更優(yōu)選為80%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上，最優(yōu)選為95%以上。對(duì)于多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通過(guò)比較兩個(gè)以最優(yōu)方式排列的序列和比較區(qū)域得以確認(rèn)。比較區(qū)域中的部分多聚核苷酸序列與對(duì)于兩個(gè)序列的最優(yōu)排列的參考序列(不包括添加或者刪除)相比，可包含添加或者刪除(即間隙(gap))。此外，本發(fā)明提供包含上述SRPP啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體。更優(yōu)選地，上述重組植物表達(dá)載體可以在SRPP啟動(dòng)子的下游(downstream)上可操作地連接編碼祀蛋白質(zhì)的靶基因而制備。本發(fā)明中的“可操作地連接”是用于表達(dá)異種蛋白質(zhì)的單位，是指具有功能的表達(dá)盒(expression cassette)的成分。例如，與編碼蛋白質(zhì)的異種DNA可操作地連接的啟動(dòng)子，能促進(jìn)相當(dāng)于異種DNA的功能性mRNA的產(chǎn)生。本發(fā)明的乳膠分泌組織特異性表達(dá)載體可用作在導(dǎo)入外源基因的植物體內(nèi)短暫表達(dá)的瞬時(shí)(transient)表達(dá)載體及在導(dǎo)入外源基因的植物體內(nèi)永久表達(dá)的植物表達(dá)載體。在本發(fā)明中可使用的雙元載體可以是與A.Tumefaciens (A.遺傳轉(zhuǎn)化)的Ti質(zhì)粒一同存在時(shí)，可轉(zhuǎn)化植物體的包含T-DNA的RB (右緣(right border))和LB (左緣(leftborder))的任何雙元載體，優(yōu)選使用本領(lǐng)域通常使用的pBIllOl (Cat# =6018-1,載體(Clontech，美國(guó))、pBIN19 (基因庫(kù)(Genbank)保藏號(hào) U09365)、pBI121、pCAMBIA 載體等。
術(shù)語(yǔ)“重組”是指復(fù)制異種核酸或表達(dá)上述核酸或表達(dá)由肽、異種肽或者異種核酸編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。重組細(xì)胞能將在上述細(xì)胞的天然形態(tài)中不被發(fā)現(xiàn)的基因或者基因片段表達(dá)為正義引物或者反義引物形態(tài)中的一個(gè)。另外，重組細(xì)胞可表達(dá)從天然狀態(tài)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，但上述基因是發(fā)生變形的，是通過(guò)人為手段再導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的基因。
術(shù)語(yǔ)“載體”在表示向細(xì)胞內(nèi)傳遞的DNA片段、核酸分子時(shí)使用。載體能夠復(fù)制DNA，并在宿主細(xì)胞中單獨(dú)再生產(chǎn)。術(shù)語(yǔ)“傳遞體”通常與“載體”互換使用。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指包括適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄械闹亟MDNA分子。所述適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄袨楸磉_(dá)目標(biāo)編碼序列、以及表達(dá)特定宿主生物中可操作地連接的編碼序列所必需的核酸序列。在真核細(xì)胞中可利用已知的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、結(jié)束信號(hào)及聚腺苷酸化。
植物表達(dá)載體的優(yōu)選例有根癌土壤桿菌等，其為在適當(dāng)?shù)乃拗髦写嬖跁r(shí)，可將自身的一部分，即所謂的T-區(qū)域轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的T1-質(zhì)粒載體。其它類型的T1-質(zhì)粒載體(參見EP0116718B1號(hào))作 為能夠?qū)⒛壳暗闹参锛?xì)胞，或者雜合DNA適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)移至植物基因組內(nèi)的，能夠生產(chǎn)出新型植物的原生質(zhì)體，用于轉(zhuǎn)移雜合DNA序列。T1-質(zhì)粒載體的最優(yōu)選的形態(tài)是EP0120516B1號(hào)及美國(guó)專利第4，940, 838號(hào)中要求保護(hù)的所謂雙元(binary)載體。本發(fā)明中的可用于將基因?qū)胫参锼拗髦械钠渌m合的載體可以選自源于雙鏈植物病毒(比如,CaMV)及單鏈病毒、雙粒病毒(Gemini virus)等的病毒載體，例如可以選自非完整性植物病毒載體。這些載體特別有利于難以適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)化植物宿主時(shí)使用。
表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記。上述標(biāo)記通常是具有可用化學(xué)方法被選擇的特性的核酸序列，即包括能將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中區(qū)分出來(lái)的所有的基因。例如有草甘膦(glyphosate)或者草胺膦等抗除草劑抗性基因，卡那霉素、G418、博萊霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐受性基因，但不局限于此。
本發(fā)明中的重組載體可使用通常的終止子，例如有胭脂堿合酶(N0S)、水稻α -淀粉酶、RAmylA終止子、菜豆堿(phaseoline)終止子、根癌土壤桿菌的章魚堿(Octopine)基因的終止子等，但并不局限于此。對(duì)于終止子的必要性，一般被認(rèn)為是這些區(qū)域能促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的確定性及效率。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容中使用終止子是非常適合的。
并且，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化上述重組植物表達(dá)載體的植物體及其種子。
植物的轉(zhuǎn)化是指能將DNA轉(zhuǎn)移至植物的任意方法。這些轉(zhuǎn)化方法不一定需要經(jīng)過(guò)再生及(或)組織培養(yǎng)期。目前，植物種的轉(zhuǎn)化不僅對(duì)于雙子葉植物，包括單子葉植物量子的植物種也非常普遍。原則上，任意的轉(zhuǎn)化方法均可被用于將依據(jù)本發(fā)明的雜合DNA導(dǎo)入到祖細(xì)胞中。所述方法可選自對(duì)于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens, F.A.et a1., 1982, Nature296,72-74;Negrutiu 1.et al., Junel987,Plant Mol.Biol.8, 363-373(Krens, F.A.等人.，1982，自然 296，72-74; Negrutiu 1.等人.，1987 年 6 月，植物分子生物學(xué)8，363-373))、原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.et al., 1985Bio/Technol.3，1099-1102 (Shillito R.D.等人.，1985 生物 / 技術(shù) 3，1099-1102))、作為植物元素的顯微注射法(Crossway A.et al.，1986, Mol.Gen.Genet.202，179-185 (克洛斯威A.等人.，1986，分子遺傳學(xué)和基因組202，179-185))、各種植物元素的(DNA或者RNA-涂布的)微粒轟擊法(Klein T.M.et al., 1987, Nature327, 70 (Klein T.M.等人.，1987，自然327，70))、依據(jù)植物的浸潤(rùn)或者成熟花粉或者小孢子轉(zhuǎn)化的，根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(非完整性)中依據(jù)病毒的感染(EP0301316號(hào))等。本發(fā)明的優(yōu)選方法包含土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。更為優(yōu)選的是利用EP A120516號(hào)及美國(guó)專利第4，940，838號(hào)所記載的所謂雙元載體技術(shù)的方法。用于植物轉(zhuǎn)化的“植物細(xì)胞”可為任意的植物細(xì)胞。植物細(xì)胞可以是培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織、培養(yǎng)器官或者整個(gè)植物，優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織或者培養(yǎng)器官，更為優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞的任意形態(tài)?！爸参锝M織”是分化或者未分化的植物組織，例如包含果實(shí)、莖、葉子、花粉、種子、癌組織及用于培養(yǎng)的各種形態(tài)的細(xì)胞，即單細(xì)胞、原生質(zhì)體(protoplast)，芽及愈傷組織，但不局限于此。植物組織可為植物(in planta)或器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或者細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)。此外，本發(fā)明還提供使外源基因在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)乳膠分泌組織特異性表達(dá)的方法，該方法包括以下步驟:在所述重組植物表達(dá)載體上重組外源基因；以及將所述重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物體。上述外源基因可以編碼選自橡膠聚合酶、橡膠生物合成相關(guān)酶類、白細(xì)胞介素、干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血紅蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白、胰島素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人生長(zhǎng)因子、人血清白蛋白及紅細(xì)胞生成素的蛋白質(zhì)，但不局限于此。所述外源基因可以是希望在植物體內(nèi)乳膠分泌組織中表達(dá)的任意基因，其位于本發(fā)明的乳膠分泌組織特異性表達(dá)載體中的上述啟動(dòng)子后面，并可根據(jù)需要與報(bào)告基因融合表達(dá)。將上述重組的乳膠分泌組織特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物體的方法可根據(jù)前面所述的方法實(shí)施。并且，本發(fā)明提供由上述方法制備的外源基因在乳膠分泌組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物體及其種子。所述植物體優(yōu)選雙子葉植物，但不局限于此。雙子葉植 物可為巖梅科(裂緣花科，Diapensiaceae)、棺葉樹科(Clethraceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、杜醇花科(Ericaceae)、紫金?？?Myrsinaceae)、報(bào)春花科(Primulaceae)、藍(lán)雪科(Plumbagi naceae)、柿樹科(Ebenaceae)、安息香科(Styracaceae)、山帆科、灰木科(Symplocaceae)、木庫(kù)科(木庫(kù)，Oleaceae)、馬錢科(Loga niaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、夾竹桃科(亞洲絡(luò)石，Apocynaceae)> 蘿摩科(Asclepiadaceae)、菌草科(R ubiaceae)、花蔥科(Polemoniaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、馬鞭草科(Verbenaceae)、唇形科(Labiatae)、爺科(Solanaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、紫蔵科(Bignoniac eae)、爵床科(Acanthaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、列當(dāng)科(Orob anchaceae)、苦苣笞科(Gesneriaceae)、涯藻科(Lentibulariaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、車前草科(Plantaginaceae)、忍冬科(Capr ifoliaceae)、五?；?Adoxaceae)、敗醫(yī)科(Valerianaceae)、川續(xù)斷科(Dipsacaceae)、結(jié)梗科(Campanulaceae)、菊科(Compositae)、楊梅科(Myricaceae )、胡桃科(Juglandaceae)、楊柳科(Salicaceae)、禪木科(Betulaceae)、山毛棒科(殼斗科，F(xiàn)agaceae)、偷科(Ulmac eae)、桑科(Moraceae)、尊麻科(Urticaceae)、植香科(Santalaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、寥科(寥，Polygonaceae)、商陸科(商陸，PhytoIaccaceae)Λ紫榮莉科(Nyctaginaceae)、番杏科(Aizoaceae)、馬齒覓科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、黎科(Cheno podiaceae)、覓科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、木蘭科(Magnoliaceae)、八角科(Illiciaceae)、棒科(Lauraceae)、連香樹科(Cercidiphyllaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、小梁科(Berberid aceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科( 藤，Menispermaceae)、睡蓮科(Nymphaeaceae)、金魚藻科(CeratophylIaceae)、藥菜科(C abombaceae)、三白草科(Saururaceae)、胡椒科(Piperaceae)、金粟蘭科(Chloranthaceae)、馬覽鈴科(Aristolochiaceae)、稱猴桃科(A ctinidiaceae)、荼科(山荼科，Theaceae)、藤黃科(Guttiferae)、茅膏菜科(Droseraceae)、S 粟科(Papaveraceae)、白花菜科(Capparida ceae)、十字花科(十字花，Cruciferae)、洋桐木科(懸鈴木科，Plat anaceae)、金鏤梅科(金鏤梅，HamameI idaceae)、景天科(景天，C rassulaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)λ 海桐花科(Pittosporaceae)、蓄薇科(Rosaceae)、顯科(Leguminosae)、酔衆(zhòng)草料(Oxalidaceae)、牛兒苗科(Geraniaceae)、旱金蓮科(T ropaeolaceae)、瘈藜科(Zygophyllaceae)、亞麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、水馬齒科(Callitrichaceae)、蕓香料(Rutaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、棟科(Meliaceae)、遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、械樹科(楓樹科，Aceraceae)、無(wú)患子科(S apindaceae)、七葉樹科(hippocastabaceae)、清風(fēng)藤科(Sabiaceae)、鳳仙花科(水鳳仙，Balsaminaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、衛(wèi)矛科(衛(wèi)茅科，Celastraceae)、旌節(jié)花科(Staphyleaceae)、黃楊科(Bu xaceae)、巖高蘭科(Empetraceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae )、杜英科(Elaeocarpaceae)、鍛樹科(Ti I iaceae)、錦奏科(Malvaceae)，梧桐科(Sterculiaceae)，瑞香科(瑞噴鼻科，Thymel aeaceae)、胡顏?zhàn)涌?Elaeagnaceae)、大風(fēng)子科(Flacourtiaceae)、堇菜科(Violaceae)、西番蓮科(Passifloraceae)、徑柳科(Tamaricacea e)、溝繁縷科(Elatinaceae)、海棠科(Begoniaceae)、葫蘆科(Cucu rbitaceae)、千屈菜科(千屈菜，Lythraceae)、石植科(Punicaceae)、柳葉菜科(Onagraceae)、小二仙草科(Haloragaceae)、八角楓科(A Iangiaceae)、山茱萸科(四照花科，Cornaceae)、五煎科(五科加，A raliaceae)或者傘形科(傘形花科)(Umbelliferae(Apiaceae))，但不局限于此。
以下，通過(guò)實(shí) 施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。但下述實(shí)施例僅用于例示本發(fā)明，因此本發(fā)明的內(nèi)容不會(huì)被下述實(shí)施例所限定。
實(shí)施例1:制備對(duì)于SRPP蛋白質(zhì)的抗體
為了驗(yàn)證SRPP基因是否在乳膠分泌(laticiferous)組織中特異性表達(dá)，制備了對(duì)于SRPP重組蛋白質(zhì)(大腸桿菌表達(dá))的抗體。
實(shí)施例2:在巴西橡膠樹的葉柄橫截面上對(duì)于SRPP蛋白質(zhì)的組織解剖學(xué)免疫染色分析
用于免疫化學(xué)分析的組織固定及包埋
組織塊是利用布萊澤(blazer)由葉柄制備而成，為防止乳液的流出，迅速浸沒在固定緩沖液(溶解于PBS制備的4% (v/v)多聚甲醒(paraformaldehyde))中。固定一晚后，用PBS清洗上述組織塊。然后將上述組織塊立即包埋于化合物(冰凍切片用包埋組織劑(Tiss ue-Tek OCT) ; Sakura Finetechnical公司，東京，日本)中，在液氮中冷凍。之后再制備成厚度為40 μ m的切片，于_2(TC條件下在低溫恒溫器(cryostat) (CM-1850;萊卡公司(Leica Microsystems))中保存。
免疫化學(xué)組織解剖分析下述所有步驟均在室溫條件下進(jìn)行。利用PBS去除OCT化合物后，切片在包含10%馬血清(胎牛血清，奧克蘭，新西蘭)的PBS中封閉20分鐘。之后，將以10μ g/mL的濃度稀釋到新的PBS溶液中的50 μ I各個(gè)小鼠的I次抗體添加至上述切片中孵育6小時(shí)，上述PBS中包含10%馬血清及0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，上述切片用PBS清洗3次，每次10分鐘。再將通過(guò)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)共軛的2次抗體50 μ I添加至上述切片中孵育4小時(shí)。所述堿性磷酸酶通過(guò)以下方法制得。將堿性磷酸酶以10 μ g/mL的濃度稀釋到包含10%馬血清及0.1%聚乙二醇辛基苯基醚的新PBS中，從而制得。將上述切片再次用PBS清洗3次,每次10分鐘,添加磷酸酶的底物p-硝基酹(p-nitrophenol)使其顯色。(Planta Vol.230，Numberl, 215-225，DO1:10.1007/s00425-009_0936-0 (植物，第 230 卷，I 號(hào)，215-225，DO1: 10.1007/s00425-009-0936-0))。其結(jié)果，可確定SRPP蛋白質(zhì)僅在乳膠分泌組織中特異性表達(dá)(圖1)。實(shí)施例3:從巴西橡膠樹葉子中分離SRPP基因啟動(dòng)子采用通常的方法從巴西橡膠樹葉子中提取基因組DNA，提取的基因組DNA用Taq I進(jìn)行處理，使其斷成多個(gè)片段，后將切斷的基因組DNA用連接酶處理，使其發(fā)生自體連接。之后，從SRPP5’ -UTR (非翻譯區(qū))的Taq I部分向兩側(cè)方向制備引物后實(shí)施了 PCR(5，-TGGTCCATTAAAACCTGGTGTCGA-3’ (SEQ ID N0.2)及 5，_GATATGTCCTGGCATAAAGGTAGA_3’(SEQ ID N0.3))。之后對(duì)PCR分離的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序(圖2)。

實(shí)施例4:制備SRPP啟動(dòng)子與⑶S基因結(jié)合的轉(zhuǎn)化載體在ρΒΙΙΟΙ載體的Hind III / X mal中插入SRPP啟動(dòng)子，從而制備重組載體(pBI 101-SRPP啟動(dòng)子::⑶S)(圖3)，使其能誘導(dǎo)標(biāo)記基因⑶S的表達(dá)。實(shí)施例5:乳膠分泌模型植物體(俄羅斯蒲公英)的轉(zhuǎn)化分離SRPP啟動(dòng)子的巴西橡膠樹不僅很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且由于它是橋木樹，故結(jié)果需要數(shù)年的時(shí)間，因此選用了比較容易轉(zhuǎn)化，且生長(zhǎng)時(shí)間短的乳膠分泌模型植物俄羅斯蒲公英進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將pBI 101-SRPP啟動(dòng)子::⑶S載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌屬菌株(Agrobacteriumstrain) GV3101中，俄羅斯蒲公英的轉(zhuǎn)化是采用Bae等人(2005，Plant Cell, Tissue andOrgan Culture80:51-57(2005，植物細(xì)胞，組織和器官培養(yǎng)80:51-57))所記載的方法實(shí)施。從選擇培養(yǎng)基中篩選出SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化體后，使其在土壤基質(zhì)中生長(zhǎng)2-3個(gè)月(圖4A，B)。提取基因組DNA及總RNA，用PCR/RT-PCR分析法再次驗(yàn)證轉(zhuǎn)化與否(圖4C，D)。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英中⑶S基因的組織特異性表達(dá)作為標(biāo)記基因的⑶S的表達(dá)在含有較多SRPP啟動(dòng)子:AUS轉(zhuǎn)化體的乳膠分泌組織較多的根部非常明顯，與此相比，幾乎不含有乳膠分泌組織的葉子中發(fā)現(xiàn)表達(dá)(圖5，右側(cè))。而非轉(zhuǎn)化體野生俄羅斯蒲公英中的任何組織中均未檢測(cè)出⑶S基因的表達(dá)(圖5，左側(cè))。實(shí)施例7:轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英中⑶S蛋白質(zhì)的組織特異性表達(dá)為了找出⑶S蛋白質(zhì)表達(dá)的組織，將組織切片浸沒在底物溶液中進(jìn)行⑶S染色(藍(lán)色)。組織學(xué)⑶S (β_葡萄糖醛酸酶)_染色是根據(jù)以前記載的方法進(jìn)行的(Jefferson etal.Biol.Rep.5:387-405 (Jefferson 等人.生物學(xué)報(bào)告 5:387-405))。如圖 6 所示，藍(lán)色GUS染色在SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化體根部組織中非常明顯，但在非轉(zhuǎn)化體野生俄羅斯蒲公英的根部組織則未觀察到。
為了更精密地檢測(cè)SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英根部的GUS染色是否為組織特異性，截?cái)喔康臋M截面并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。在野生型俄羅斯蒲公英根部組織的橫截面中未觀察到GUS染色(圖7，左側(cè))，而在SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化蒲公英的根部橫截面中，只在乳膠組織中觀察到藍(lán)色⑶S染色(圖7，右側(cè))。
檢測(cè)根部乳膠分泌組織生成的乳膠分泌液中的⑶S染色的結(jié)果顯示，SRPP啟動(dòng)子::GUS轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英根部乳膠組織中分泌的乳膠分泌液中觀察到藍(lán)色⑶S染色(圖8，右側(cè))。而與此相反，在非轉(zhuǎn)化俄羅斯蒲公英(野生型)根部的乳膠分泌液中未觀察到GUS染色(圖8，左側(cè))。
權(quán)利要求
1.一種源自巴西橡膠樹的乳膠分泌組織特異性SRPP啟動(dòng)子，其由SEQ ID N0.1的堿基序列構(gòu)成。
2.包含權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求2所述的重組植物表達(dá)載體，其通過(guò)在所述啟動(dòng)子的下游上可操作地連接編碼靶蛋白質(zhì)的靶基因而制備。
4.轉(zhuǎn)化權(quán)利要求2的重組植物表達(dá)載體的植物體。
5.權(quán)利要求4所述植物體的種子。
6.使外源基因在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)乳膠分泌組織特異性表達(dá)的方法，該方法包括以下步驟:在權(quán)利要求2所述的重組植物表達(dá)載體上重組外源基因；以及將所述重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，所述外源基因編碼選自橡膠聚合酶、橡膠生物合成相關(guān)酶類、白細(xì)胞介素、干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血紅蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白、胰島素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人生長(zhǎng)因子、人血清白蛋白及紅細(xì)胞生成素的蛋白質(zhì)。
8.由權(quán)利要求6所述的方法制備的外源基因在乳膠分泌組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物體。
9.如權(quán)利要求8所述的植物體，其特征在于，其為雙子葉植物。
10.權(quán)利要求8所述植物體的種子`。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種源自巴西橡膠樹的SRPP啟動(dòng)子，其由SEQ ID No.1的堿基序列構(gòu)成；包含上述啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化上述重組植物表達(dá)載體的植物體及其種子；使外源基因在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)乳膠分泌組織特異性表達(dá)的方法，該方法包括在上述重組植物表達(dá)載體上重組外源基因的步驟；以及由上述方法制備的外源基因在乳膠分泌組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物體及其種子。
文檔編號(hào)A01H5/10GK103153044SQ201180048802
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月8日
發(fā)明者柳炳泰, 申正燮 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院