專利名稱：治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療具有腫瘤或其他代謝紊亂的動物的組合物和方法。特別地，本公開的主題涉及分離和純化由于腫瘤和其他代謝紊亂脫落的外泌體的方法。然后，使用電穿孔以將來自外泌體的蛋白和編碼一種或多種蛋白或多肽的核苷酸序列插入抗原遞呈細胞(例如樹突細胞)或其他免疫細胞(例如T細胞)，然后向動物施加抗原遞呈細胞或其他免疫細胞，以增強免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
癌癥是由控制失效引起的疾病，所述控制通常管理細胞增殖、分化和細胞存活。進行惡性轉(zhuǎn)化的細胞逃離正常生長控制，入侵周圍組織，并且可最終遷移至機體內(nèi)的其他位點以建立繼發(fā)瘤。癌癥療法通常包括外科手術(shù)(用于實體瘤)，然后單獨或聯(lián)合實施細胞毒性藥物或放射，以殺死癌細胞。檢測和治療癌癥的繼續(xù)追求已經(jīng)發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練機體的免疫系統(tǒng)的方式，以通過下列方式精心努力地殺死癌細胞激活激素和細胞免疫系統(tǒng)以特異性攻擊生長的癌細胞，并節(jié)省生命所需要的正常細胞。治療癌癥的一種提出的方法是訓(xùn)練抗原遞呈細胞例如樹突細胞。樹突細胞是形成動物的免疫系統(tǒng)的一部分的免疫細胞。它們的主要功能是處理抗原材料，并且將其遞呈到免疫系統(tǒng)的其他細胞的表面上，因此起到抗原遞呈細胞的作用。它們起到固有和適應(yīng)免疫性之間的信使的作用。樹突細胞以少量不成熟狀態(tài)存在于血液中。一旦激活，它們遷移至淋巴組織，其中它們和T與B淋巴細胞相互作用以使適應(yīng)性免疫應(yīng)答初始化和成形。樹突細胞可以分離和純化自動物。另外提出的治療癌癥的方法是直接訓(xùn)練T淋巴細胞，T淋巴細胞是細胞免疫性激活所需要的免疫應(yīng)答的一部分。治療癌癥的一種策略已經(jīng)使用流式電穿孔將生長性惡性腫瘤的基因內(nèi)容物插入樹突細胞中。流式電穿孔的一種應(yīng)用是使用該技術(shù)來使惡性細胞從患者中生長性腫瘤中除去，并且將它們(或它們胞溶的內(nèi)容物)插入樹突細胞中。這導(dǎo)致訓(xùn)練樹突細胞，使得當(dāng)它們回到供體時，細胞和體液免疫應(yīng)答啟動以攻擊惡性細胞。該方法的限制是惡性細胞電穿孔到供體的樹突細胞中的可用性。這要求癌性組織的組織切片，這是外科手術(shù)用于組織切片的內(nèi)在問題，不能確保組織切片含有相關(guān)惡性組織樣品，并且多種類型的癌癥不適于組織切片。之前的研究表明癌細胞從生長性腫瘤脫落較小基因信息包，稱為外泌體。由正常和病理條件下細胞分泌的外泌體含有蛋白、DNA和功能RNA分子包括mRNA和miRNA，其可以從一種細胞運送至另外細胞，從而影響受體細胞的蛋白產(chǎn)生。腫瘤外泌體不同于由正常細胞脫落的外泌體。它們在癌癥患者中更多，并且它們在增加的腫瘤生長、血管形成和從免疫-監(jiān)視逃脫中發(fā)揮重要作用(Nilsson et al. ,Br J Cancer (2009) 100 :1603-1607)。外泌體內(nèi)所含的基因材料和蛋白是它們惡性源細胞的生物指紋。因此，現(xiàn)有技術(shù)中存在下列需要通過指導(dǎo)動物本身的免疫系統(tǒng)至癌細胞來用于治療癌癥的新型組合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離和純化由于腫瘤和其他代謝紊亂脫落的外泌體、然后使用電穿孔將外泌體材料插入樹突細胞、T淋巴細胞或其他相關(guān)免疫細胞中的方法。基因和蛋白信息的該周圍環(huán)境將被樹突細胞、T淋巴細胞或其他相關(guān)免疫細胞加工，從而使得它們能夠?qū)盒约膊∫约按x紊亂啟動細胞和體液應(yīng)答。認(rèn)識到的是，激活的免疫系統(tǒng)將攻擊和使錯誤的細胞失效，并且能夠恢復(fù)體內(nèi)平衡和健康。發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及用于治療增殖性病患例如但不限于癌癥和/或腫瘤的方法和組合物。更具體地，本發(fā)明包括治療動物中腫瘤的方法，包括向動物施用有效量的包含一種或多種抗原遞呈細胞的組合物，其中一種或多種抗原遞呈細胞用一種或多種外泌體源自腫瘤(下文稱為"腫瘤外泌體")電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，抗原遞呈細胞是樹突細胞.另外優(yōu)選的實施方案包括通過施用有效量的的包含一種或多種T淋巴細胞的組合物來治療動物中的腫瘤的方法，其中一種或多種T淋巴細胞用一種或多種外泌體源自腫瘤電穿孔。T淋巴細胞或"T細胞"是以細胞-介導(dǎo)的免疫性發(fā)揮作用的一組白血細胞。細胞-介導(dǎo)的免疫性或"細胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答"是指當(dāng)它們緊密接近它們的靶細胞時，由淋巴細胞例如T淋巴細胞提供的免疫防御。細胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答還包括響應(yīng)于特定抗原的淋巴細胞激活。如本文和所附權(quán)利要求書使用的，單數(shù)形式"a"，" an"和"the"包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地指示不是這樣。因此，例如涉及"化合物"是指一種或多種這樣的化合物，并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同形式等。術(shù)語"動物"包括人，并且更特別地包括哺乳動物。如本文使用的，"抗原遞呈細胞"或"APC"是指能夠處理和將抗原遞呈至淋巴細胞或另外免疫效應(yīng)細胞的細胞。抗原遞呈細胞的例子包括但不限于巨噬細胞、胰島-樹突細胞、泡囊樹突細胞、B細胞、單核細胞、成纖維細胞和纖維細胞。如本文使用的，"修飾"以遞呈至抗原表位是指抗原遞呈細胞通過天然或重組方法而操縱以遞呈抗原表位。例如抗原遞呈細胞可以通過下列方式來修飾使用至少一種腫瘤外泌體和抗原遞呈細胞電穿孔，以修飾抗原遞呈細胞來表達腫瘤多肽。如本文使用的，術(shù)語治療("treating" ， " treat"或"to treat")是指預(yù)防、減緩、部分或完全減輕、或治愈疾病或腫瘤。如本文使用的，治療癌癥可包括癌細胞的增殖降低、去分化、或擴散或其組合。這包括不同組織的癌癥和不同階段的癌癥，包括但不限于白血病，腦癌，前列腺癌，肝癌，卵巢癌，胃癌，結(jié)直腸癌，咽喉癌，乳腺癌，皮膚癌，黑色素瘤，肺癌，肉瘤，子宮頸癌，睪丸癌，膀胱癌，內(nèi)分泌癌，子宮內(nèi)膜癌，食道癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，淋巴瘤，神經(jīng)母細胞瘤，骨肉瘤，胰癌，惡性體癌，腎癌，鼻咽癌等。根據(jù)本發(fā)明治療腫瘤包括腫瘤尺寸減小、腫瘤生長降低、以及腫瘤轉(zhuǎn)移的減少。如本文使用的，術(shù)語"腫瘤"是指異常組織團塊，并且包括良性和惡性團塊。術(shù)語"腫瘤外泌體"是指含有腫瘤多肽、腫瘤DNA和/或腫瘤RNA的外泌體，并且包括源自特定類型的癌癥的外泌體，包括但不限于前列腺小體。當(dāng)細胞膜的片段自發(fā)地內(nèi)陷并且胞吞時細胞內(nèi)產(chǎn)生外泌體。該內(nèi)在化的片段破碎為更小的囊泡，所述囊泡隨后將從細胞中排出。當(dāng)含有多種較小囊泡的后期內(nèi)涵體融合細胞膜、從而引起囊泡從細胞中釋放時，更晚階段發(fā)生。囊泡(一旦釋放稱為"外泌體")由嵌有初始細胞膜共有的配體(即多肽)的脂膜筏。由正常和病理條件下細胞分泌的外泌體含有蛋白、DNA和功能RNA分子包括mRNA和mi RNA，其可以 從一種細胞運送至另外細胞，從而影響受體細胞的蛋白產(chǎn)生。該RNA稱為"體外往復(fù)性RNA"或"外泌體RNA"。外泌體可得自來自動物的生物樣品或組織樣品。在優(yōu)選實施方案中，腫瘤外泌體分離自生物樣品，包括但不限于血液樣品、尿液樣品和腫瘤腹水樣品。外泌體可通過下列方式從動物樣品中分離離心技術(shù)、超濾技術(shù)或識別外泌體表面上表達的蛋白(例如EGF受體、ICAM-1、VEGF或LMPl (EB病毒潛伏膜蛋白I))的親和色譜技術(shù)。親和色譜技術(shù)還可以使用結(jié)合之前鑒別的外泌體生物標(biāo)志物的抗體或其他材料，所述外泌體生物標(biāo)志物顯示為位于外泌體的外表上。外泌體生物標(biāo)志物列表可在下列文獻中找到=Nilssonet al, British Journal ofCancer 100 (10) 1603-7(2009);和 Skoget al, Nature CellBiology 10 (12) 1-7 (2008) o外泌體可通過本領(lǐng)域已知的方法來純化，例如下列文獻中教導(dǎo)的那些方法美國專利申請 No. 12/695，910, Gastpar et al. Cancer Research,65(12) :5238-5248, Simpson et al, ExpertReview Proteomics 6(3) :267-283 (2009)Caby et al, Exosomal-Iike vesicles arepresent in human blood plasma, Int.Immunol. 17(7)879-887(2005)。涉及該說明書的該和所有文獻通過引用的方式全部并入本文。在一個實施方案中，從癌細胞釋放或胞外分泌的外泌體轉(zhuǎn)染到抗原遞呈細胞例如樹突細胞中。任何轉(zhuǎn)染方法可用于將外泌體或外泌體內(nèi)容物插入抗原遞呈細胞中。在一個實施方案中，電穿孔是這樣的轉(zhuǎn)染方法，該方法用于將外泌體或外泌體內(nèi)容物插入抗原遞呈細胞中。任何抗原遞呈細胞涵蓋用于本發(fā)明的方法，并且可以是自身細胞或異源細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉電穿孔的方法。電穿孔可以是例如流式電穿孔或靜態(tài)電穿孔。因此，如本文使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)染的"包括電穿孔。腫瘤外泌體電穿孔到抗原遞呈細胞例如樹突細胞(或如下面所述的T淋巴細胞)中導(dǎo)致這些細胞以腫瘤特異性方式，和以可能腫瘤轉(zhuǎn)移特異性方式引發(fā)。腫瘤外泌體用于引發(fā)樹突細胞、T淋巴細胞或其他免疫細胞提供相對引發(fā)這些細胞的其他方法的優(yōu)點，因為腫瘤外泌體起到腫瘤RNA和腫瘤蛋白的預(yù)-濃縮包的作用，它們涉及癌癥和/或腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，用腫瘤外泌體電穿孔的細胞應(yīng)該遞呈、或激活以識別較高量的這些抗原/蛋白，所述抗原/蛋白涉及癌癥或腫瘤的擴增和/或增殖，從而導(dǎo)致針對這些非?？乖?蛋白的增強的免疫應(yīng)答、以及癌癥或腫瘤的更成功的治療。在一個實施方案中，電穿孔抗原遞呈細胞的方法包括使用下列所述的電穿孔裝置美國專利公開 20030073238 或 Van Meirvenne et al, CancerGene Therapy 9:787-797(2002)，通過引用的方式并入本文。電穿孔的方法和裝置還描述于例如公開的PCT申請 No. WO 03/018751 和 TO2004/031353 ;美國專利申請序列 No. 10/781，440，10/080，272和 10/675，592;以及美國專利 No. 5，720，921，6，074，605，6，090，617，6，773，669，6，090，617,6, 485，961,6, 617，154,5, 612，207，所有文獻通過引用并入。流式電穿孔中使用的另外設(shè)備描述于美國專利公開20080138877和美國專利No. 6，773，669，其通過引用的方式全部并入本文。應(yīng)該理解，術(shù)語"腫瘤外泌體"包括完整腫瘤外泌體和破碎的腫瘤外泌體。就此而言，術(shù)語"完整"包括但不限于外泌體是全部、完全或未損壞的。術(shù)語"破碎"包括但不限于外泌體是斷裂、分開或分離的。可能的是電穿孔本身擾斷外泌體，并且導(dǎo)致破碎的外泌體。如本文使用的，"腫瘤外泌體裂解物"包括破碎之前腫瘤外泌體內(nèi)部的破碎的外泌體和材料。腫瘤外泌體內(nèi)的材料包括腫瘤RNA、腫瘤DNA和腫瘤蛋白。應(yīng)該理解，如本文使用的，術(shù)語"腫瘤RNA"是指源自腫瘤外泌體的RNA。此外還如本文使用的，術(shù)語"腫瘤DNA"是指源自腫瘤外泌體的DNA，并且術(shù)語"腫瘤蛋白"是指源自腫瘤外泌體的蛋白或肽。因此，本發(fā)明包括電穿孔完整外泌體到抗原遞呈細胞、T淋巴細胞或其他免疫細胞中、電穿孔外泌體碎片到抗原遞呈細胞、T淋巴細胞或其他免疫細胞中、電穿孔腫瘤外泌 體裂解物到抗原遞呈細胞、T淋巴細胞或其他免疫細胞中、以及電穿孔擴增的腫瘤RNA和/或擴增的腫瘤DNA到抗原遞呈細胞、T淋巴細胞或其他免疫細胞中。在一些實施方案中，來自腫瘤外泌體裂解物的RNA分離、逆轉(zhuǎn)錄并擴增，之后和腫瘤外泌體裂解物重新聯(lián)合以產(chǎn)生腫瘤裂解物/腫瘤DNA混合物。然后腫瘤裂解物/腫瘤DNA混合物電穿孔到樹突細胞、T細胞或其他免疫細胞中。在其他實施方案中，在電穿孔之前，來自腫瘤外泌體裂解物的RNA分離、逆轉(zhuǎn)錄、擴增和翻譯到腫瘤蛋白中。在這些實施方案中，腫瘤蛋白和腫瘤外泌體裂解物重新聯(lián)合以產(chǎn)生腫瘤裂解物/腫瘤蛋白混合物。該混合物電穿孔到樹突細胞、T細胞或其他免疫細胞中。因此，本發(fā)明包括治療具有腫瘤的動物的方法，包括向動物施用有效量的包含一種或多種抗原遞呈細胞的組合物，其中一種或多種抗原遞呈細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，電穿孔的抗原遞呈細胞包括電穿孔后的腫瘤RNA、腫瘤DNA、腫瘤蛋白或其任意組合。在進一步優(yōu)選實施方案中，抗原遞呈細胞和腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物源自待治療的動物。本發(fā)明還包括治療具有腫瘤的動物的方法,包括向動物施用有效量的包含一種或多種T淋巴細胞的組合物，其中一種或多種T淋巴細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，電穿孔的T淋巴細胞包括電穿孔后的腫瘤RNA、腫瘤DNA、腫瘤蛋白或其任意組合。在進一步優(yōu)選實施方案中，T淋巴細胞和腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物源自待治療的動物。本文還提供方法，其中通過向動物施用有效量的的包含一種或多種T淋巴細胞的組合物來治療動物中的腫瘤，其中一種或多種T淋巴細胞使用包含編碼腫瘤多肽的腫瘤RNA的一種或多種腫瘤外泌體電穿孔。下面更詳細地定義"腫瘤多肽"。在優(yōu)選實施方案中，腫瘤多肽據(jù)信或顯示和動物中的腫瘤相關(guān)。本發(fā)明還包括治療動物中的腫瘤的方法，包括向動物施用有效量的包含一種或多種抗原遞呈細胞的組合物，其中一種或多種抗原遞呈細胞用包含編碼腫瘤多肽的腫瘤RNA的一種或多種腫瘤外泌體電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，腫瘤多肽據(jù)信或顯示和動物中的腫瘤相關(guān)。在某些實施方案中，樹突細胞或"DC"是優(yōu)選類型的抗原遞呈細胞。樹突細胞以這樣的方式修飾、轉(zhuǎn)化或改變，該方式使得它們遞呈抗原表位，所述抗原表位使免疫應(yīng)答導(dǎo)向至獲得插入的外泌體的細胞。因此，本發(fā)明還包括治療動物中的腫瘤的方法，包括向動物施用有效量的包含一種或多種樹突細胞的組合物，其中一種或多種樹突細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。樹突細胞發(fā)揮作用以加工抗原材料，并且遞呈表面上的抗原材料至免疫系統(tǒng)的其他細胞。樹突細胞還可以通過誘導(dǎo)祖先細胞變成樹突細胞而獲得。樹突細胞發(fā)現(xiàn)于多種非-淋巴組織中，但是可以通過輸入淋巴或血流遷移至淋巴器官的T-依賴性區(qū)域。在非-淋巴器官中，樹突細胞(包括胰島細胞和間質(zhì)樹突細胞)。在淋巴和血液中，它們分別包括輸入淋巴面紗細胞和血液樹突細胞。在淋巴器官中，它們包括淋巴樹突細胞和趾狀突細胞。樹突細胞和祖先可得自外周血液、骨髓、腫瘤-滲透性細胞、癌旁組織-滲透性細胞、淋巴結(jié)、脾臟、皮膚、臍血或任何其他合適的組織或流體。樹突細胞便利地分為"不成熟"和"成熟"細胞，它們允許簡便方式來在兩種良好表征的表現(xiàn)型之間進行區(qū)別。然而，該命名系統(tǒng)不應(yīng)該理解為排出分化的所有可能的中間階段。不成熟樹突細胞的特征為具有抗原攝取和加工的較高能力的抗原遞呈細胞，其相關(guān)于Fey受體、甘露糖受體和DEC-205標(biāo)志物的高度表達。"不成熟樹突細胞"也稱為未·成熟到這樣階段的樹突細胞，在該階段它們能夠引出T或B細胞應(yīng)答。一旦樹突細胞接觸可遞呈的抗原，其變成激活為"成熟樹突細胞"。在一個實施方案中，成熟樹突細胞用外泌體電穿孔。該優(yōu)選的實施方案避過成熟樹突細胞的內(nèi)在的抗原攝取限制。成熟樹突細胞典型地特征為Fey受體、甘露糖受體和DEC-205標(biāo)志物的較低表達，而非負責(zé)T細胞激活的細胞表面分子的較高表達(例如I類和II類NMC、粘附分子(例如⑶54和⑶11)和共-刺激分子(例如CD40、CD80和CD86))。它們表征為抗原遞呈時的高效。樹突細胞可通過下列方式體內(nèi)分化將細胞因子例如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNFa的聯(lián)合增加至從外周血液收獲的單核細胞培養(yǎng)物?？蛇x地，收獲自外周血液、臍血或骨髓的CD34陽性細胞可通過下列方式分化為樹突細胞增加至誘導(dǎo)樹突細胞成熟和增殖的GM-CSF，IL-3，TNFa, CD40配體，LPS, flt3配體和/或其他化合物的培養(yǎng)基聯(lián)合。因此，如本文使用的，術(shù)語"樹突細胞"包括但不限于胰島-樹突細胞、間質(zhì)樹突細胞、泡囊樹突細胞、輸入淋巴面紗樹突細胞、血液樹突細胞、淋巴樹突細胞、趾狀突樹突細胞、成熟樹突細胞和不成熟樹突細胞。在優(yōu)選實施方案中，樹突細胞分離自接受本文所述的治療或施用的動物。本發(fā)明包括治療動物中的腫瘤的方法和增強動物中的免疫應(yīng)答的方法，其中一種或多種不成熟樹突細胞分離自動物，然后一種或多種不成熟樹突細胞1)用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔；2)體外成熟的；和3)施用至動物。本發(fā)明還包括治療動物中的腫瘤的方法和增強動物中的免疫應(yīng)答的方法，其中一種或多種不成熟樹突細胞分離自動物，然后一種或多種不成熟樹突細胞I)用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔；和2)施用至動物。在這些實施方案中，樹突細胞可以施用至動物的特定位置以體內(nèi)成熟(參見美國專利No. 7，785，583，其通過引用的方式全部并入本文)。本發(fā)明甚至進一步包括治療動物中的腫瘤的方法和增強動物中的免疫應(yīng)答的方法，其中一種或多種成熟樹突細胞分離自動物，樹突細胞1)體外成熟的，2)用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔；和3)施用至動物。本發(fā)明甚至還包括治療動物中的腫瘤的方法和增強動物中的免疫應(yīng)答的方法，其中一種或多種成熟樹突細胞分離自動物，然后一種或多種樹突細胞1)用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔；和2)施用至動物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供在動物中引導(dǎo)針對腫瘤的免疫應(yīng)答的方法和組合物。例如，用一種或多種腫瘤外泌體電穿孔的抗原遞呈細胞可以以免疫刺激組合物或細胞疫苗施用至動物。在特定的實施方案中，用得自癌細胞的一種或多種腫瘤外泌體電穿孔的抗原遞呈細胞以免疫刺激組合物或疫苗施用至動物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供涉及增強針對上述癌癥和/或腫瘤細胞的免疫應(yīng)答的方法和組合物。在優(yōu)選實施方案中，通過在動物中增強針對腫瘤或癌癥多肽的免疫應(yīng)答，實現(xiàn)在動物中增強針對腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供在動物中增強針對腫瘤的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向動物施用包含有效量的包含一種或多種電穿孔的抗原遞呈細胞或一種或多種電穿孔的T淋巴細胞的組合物，其中一種或多種電穿孔的抗原遞呈細胞或T淋巴細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，電穿孔的抗原遞呈細胞或T淋巴細胞包括電穿孔后的腫瘤RNA、腫瘤DNA、腫瘤蛋白或 其任意組合。在進一步優(yōu)選的實施方案中，抗原遞呈細胞或T淋巴細胞以及腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物源自待治療的動物。在其他或進一步優(yōu)選的實施方案中，抗原遞呈細胞是樹突細胞。因此，本發(fā)明提供在動物中增強針對腫瘤的免疫應(yīng)答的方法，包括向動物施用有效量的包含一種或多種電穿孔的樹突細胞的組合物，其中一種或多種電穿孔的樹突細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，電穿孔的樹突細胞包括電穿孔后的腫瘤RNA0在進一步優(yōu)選實施方案中，樹突細胞以及腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物源自待治療的動物。在其他實施方案中，提供在動物中增強針對一種或多種腫瘤多肽的免疫應(yīng)答的方法，包括向動物施用有效量的包含一種或多種電穿孔的抗原遞呈細胞的組合物，其中一種或多種電穿孔的抗原遞呈細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。在優(yōu)選實施方案中，電穿孔的抗原遞呈細胞是樹突細胞，并且包括電穿孔后的腫瘤RNA。在進一步優(yōu)選的實施方案中，樹突細胞以及腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物源自待治療的動物。在甚至進一步優(yōu)選的實施方案中，腫瘤多肽據(jù)信或顯示源自動物中的腫瘤。如本文使用的，"免疫應(yīng)答"定義為識別抗原的機體防御反應(yīng)，該反應(yīng)可以通過任何免疫效應(yīng)細胞或其任意組合的作用或激活來實現(xiàn)，包括但不限于B細胞、T細胞、天然殺傷細胞(NK細胞)、樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、粒細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。術(shù)語"抗原"是指源自物質(zhì)的肽或脂質(zhì)，包括但不限于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的病毒、真菌、細菌、病原體、腫瘤和自反應(yīng)性細胞。如本文使用的，術(shù)語"多肽"是指氨基酸或氨基酸類似物的任何聚合物，而無論尺寸和功能。增強針對腫瘤多肽的免疫應(yīng)答包括通過免疫效應(yīng)細胞識別或遞呈腫瘤多肽的任何部分或片段。這樣識別的腫瘤多肽的部分可以是連續(xù)或非連續(xù)間距的氨基酸。如本文使用的，術(shù)語"腫瘤多肽"是指和存在腫瘤或腫瘤生長相關(guān)的任何多肽，包括相對于非-腫瘤細胞以增加的量由腫瘤細胞表達的任何多肽。在一些實施方案中，腫瘤多肽在腫瘤細胞中表達，但在非-腫瘤細胞中不表達。研究者報道，來自癌癥患者的外泌體含有用于診斷目的的癌癥用生物標(biāo)志物(參見 Nilsson et al, British Journal of Cancer 100 (10)1603-7(2009)和 Skog et al,Nature Cell Biology 10 (12) 1-7 (2008)，其通過引用的方式全部并入本文)。因此，術(shù)語"腫瘤多肽"包括前面闡述的所有這些外泌體生物標(biāo)志物。如本文使用的，激活("activation"或"activating")是指刺激B細胞、T細胞或任何免疫效應(yīng)細胞以增殖和/或分化。因此，例如，"激活的B細胞"是指已經(jīng)信號傳導(dǎo)以增殖和/或分化的B細胞。此外，例如"激活的T細胞"是指已經(jīng)信號傳導(dǎo)以增殖和/或分化的T細胞。這和典型的靜止的幼稚B細胞相反。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉鑒別激活的B細胞的方法。一種方法是簡便觀察激活的B細胞的增殖。其他方案包括評價在激活的B細胞中上調(diào)的一種或多種分子例如共-刺激分子(例如CD80、CD86)或粘附分子(例如ICAM-I)的表達。其他效應(yīng)細胞的類似分析可通過本發(fā)明的方法來區(qū)別它們的激活。在本發(fā)明的某些方面中，B細胞群得自動物。細胞可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。在優(yōu)選實施方案中，細胞得自受試者的外周血液。在某些實施方案中，受試者具有白血病。
聯(lián)合治療在一些實施方案中，可期望使用這些轉(zhuǎn)染的癌癥和/或腫瘤細胞與有效治療癌癥的其他藥劑或方法聯(lián)合治療。"抗癌"劑能夠例如通過下列方式而對受試者中的癌癥產(chǎn)生不利影響殺死癌細胞、誘導(dǎo)癌細胞的凋亡、降低癌細胞的生長速率、降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)量、降低腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、降低血液供應(yīng)至腫瘤或癌癥細胞、促進針對癌細胞或腫瘤的免疫應(yīng)答、預(yù)防或抑制癌癥的發(fā)展、或增加患有癌癥的受試者的生命期。更通常地，將提供聯(lián)合量的這些其他組合物，該量有效地殺死或抑制細胞的增殖。該方法可包括使細胞同時接觸表達構(gòu)建體以及藥劑或多種因子。這可以通過下列方式來實現(xiàn)使細胞接觸單一組合物或藥物制劑(包括兩種藥劑)或使細胞同時接觸兩種不同組合物或制劑，其中一種組合物包括轉(zhuǎn)染的癌細胞，并且另一種包括第二藥劑?；焺┖头派浏焺┠托缘哪[瘤細胞在臨床腫瘤學(xué)中表現(xiàn)出主要問題。當(dāng)前癌癥研究的一個目標(biāo)是通過將其聯(lián)合免疫療法而發(fā)現(xiàn)方式以改善花療法和放射療法的效果。在本發(fā)明的上下文中，涵蓋電穿孔的樹突細胞可以聯(lián)合化療、放療或其他免疫療法干預(yù)而類似地使用。I.化療法癌癥治療包括基于治療的和化學(xué)與放射的多種聯(lián)合療法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉化療劑的范圍和可利用的聯(lián)合。化療劑包括例如順氯氨鉬(CDDP)，卡鉬，丙卡巴肼，氮芥，環(huán)磷酰胺，喜樹堿，異環(huán)磷酰胺，美法侖，苯丁酸氮芥，白消安，nitiOsurea，更生霉素，道諾霉素，阿霉素，博來霉素，Plicomycin，絲裂霉素，依托泊苷(VP 16)，它莫西芬，雷洛昔芬，雌激素受體結(jié)合劑，紫杉醇，gemcitabien,諾維本,法呢基_蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑，順鉬，5_氟尿卩密啶，長春新堿，長春滅瘟堿和甲氨蝶呤，或上述任何類似物或衍生物變體。2.放射療法引起DNA損壞并且已經(jīng)廣泛使用的其他因素包括Y-射線、X-射線、和用于腫瘤細胞的放射性同位素的定向遞送。還涵蓋其他形式的DNA損壞因素，例如微波和UV-輻射。最可能的是，所有這些因素對于DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)、以及染色體的裝配和保持而產(chǎn)生較大的損壞。X-射線的劑量范圍為延長時間(3至4wk)的每日劑量50至200倫琴，單劑量2000至6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍變化較大，并且取決于同位素的半衰期、發(fā)射的輻射強度和類型、以及贅生性細胞的攝取。當(dāng)應(yīng)用于細胞時，術(shù)語"接觸"和"暴露"在本文中用于描述這樣的方法，通過該方法治療構(gòu)建體和化療劑或放射療劑遞送至靶細胞，或者和靶細胞直接并排放置。為了實現(xiàn)細胞殺死或停滯，兩種藥劑以殺死細胞或預(yù)防其分開的聯(lián)合有效率而遞送至細胞。3.免疫療法本發(fā)明的電穿孔的樹突細胞可以聯(lián)合免疫療法的其他形式來施用。免疫療法通常依靠使用免疫效應(yīng)細胞和分子來靶向和破壞癌細胞。免疫效應(yīng)子可以例如腫瘤細胞表面上一些標(biāo)志物的特異性抗體?？贵w單獨可以起到治療效應(yīng)子的作用，或者其可吸收其他細胞以實際影響細胞殺死?？贵w還可以締合藥物或毒素(化療、放射性核素、蓖麻毒A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)，并且可僅僅用作靶向劑。可選地，效應(yīng)子可以是負載表面分子的淋巴細胞，所述表面分子直接或間接和腫瘤細胞靶相互作用。各種效應(yīng)細胞包括細胞毒性T 細胞和NK細胞。本發(fā)明是電穿孔的樹突細胞還可以聯(lián)合淋巴細胞刺激劑施用，包括但不限 于刺激內(nèi)源性促乳泌素釋放的促乳泌素激動劑活多巴胺拮抗劑，如美國專利No. 5，605，885中所述，其通過引用的方式全部并入本文.
實施例實施例I來自生物樣品的外泌體的純化在知會同意后從下列獲得樣品來自動物的癌細胞樣品例如腫瘤組織切片、或來自動物的生物流體的樣品，例如血液、尿液、淋巴液或唾液。微囊泡部分通過差速離心制備。首先，細胞以500g在10°C球?；?0min并拋棄，然后另外的細胞碎片通過以16000g在10°C離心20min除去,然后通過O. 45mm過濾裝置(Millipore)過濾。然后濾液中的微囊泡以100，OOOg在10°C超速離心(Beckman Ti70rotor) 90分鐘而球?；?。為了電子顯微鏡研究，微囊泡通過下列方式另外純化以20和40%蔗糖梯度超速離心，然后使用過濾的磷酸鹽-緩沖的鹽水(PBS)洗滌。腫瘤-特異性外泌體或腫瘤外泌體使用識別在外泌體表面上表達的蛋白(例如EGF受體，I CAM-1, VEGF, MAGE-I和/或LMPl (EB病毒潛伏膜蛋白I))的親和色譜技術(shù)而分離自微囊泡球粒。實施例2腫瘤細胞外泌體的純化和樹突細胞的轉(zhuǎn)染傳代1-15的癌細胞在無微囊泡的培養(yǎng)基(含有5% dFBS的DMEM)中培養(yǎng)，并且在48小時后收集來自4xl07細胞的調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基。微囊泡通過差速離心純化。簡言之，癌細胞-調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基以300g離心10分鐘以消除細胞污染。上清液以16，500g進一步離心20分鐘，并通過0.22 μ m過濾器過濾。微囊泡以110，OOOg超速離心70分鐘而球?；Ｎ⒛遗萸蛄Ｔ?3ml PBS中洗滌，并且再次球?；椭匦禄鞈矣赑BS中。微粒體使用DC蛋白測定法(Bio-Rad)來測量它們的蛋白含量。來自健康對照和癌癥患者的血清微粒體在PBS中稀釋至13ml，并且在離心之前無菌過濾。遵循Lutz et al.描述的方案產(chǎn)生骨髓-源樹突細胞。簡言之，骨髓細胞分離自后肢，并用紅血細胞胞溶緩沖液來處理。細胞以IOmL的完全培養(yǎng)基(DMEM，補充5%熱-失活的 FCS，2mM 谷氨酰胺，50M 2-ME, 100U/mL 青霉素，100g/mL 鏈霉素和 20ng/mL rmo GM-CSF)中的 2xl06 細胞接種于 10-cm 細菌 Petri 盤(Falcon-Becton Dickinson, Erembodegem,Belgium)。在培養(yǎng)3天時，加入含有20ng/mL rmo GM-CSF的IOmL的培養(yǎng)基。在第5天，50%的培養(yǎng)基用含有20ng/mL rmo GM-CSF的培養(yǎng)基更新。在第7天，細胞用于mRNA電穿孔，并且根據(jù)實驗設(shè)計樹突細胞和源自大腸桿菌血清型055 B5 (Sigma-Aldrich, Bornem,Belgium)的LPS以O(shè). lg/mL的濃度進一步成熟。樹突細胞也可以通過刺激其他免疫細胞以分化或去分化來制備。在轉(zhuǎn)染之前，樹突細胞立即在PBS(Invitrogen_Life Technologies)中洗漆兩次，并且通過以1500rpm離心10分鐘收集。細胞重新混懸于Opti-MEM(Invitrogen-LifeTechnologies)至最終濃度20xl06細胞/mL。隨后,200L的細胞混懸液在O. 4-cm間隔無菌一次性電穿孔吸收池中混合20g的mRNA,并且使用Easyject Plus設(shè)備(Equibio, Kent,UK)電穿孔。按下列進行細胞轉(zhuǎn)染300V的電壓脈沖，聯(lián)合150F的電容和6毫秒的脈沖時間。在電穿孔后，細胞立即重新混懸于新鮮完全培養(yǎng)基，并且在37°C下補充7% CO2的濕潤 氣氛中進一步孵育。實施例3樹突細胞的流式電穿孔得自來自癌癥動物的癌細胞或生物流體的外泌體通過流式電穿孔系統(tǒng)引入患者的自身細胞，例如美國專利公開20030059945中描述那種，其通過引用的方式全部并入本文。樹突細胞得自動物。可以獲得不成熟或成熟樹突細胞。如果獲得不成熟樹突細胞，樹突細胞可以在電穿孔之前或之后成熟。對于電穿孔，樹突細胞重新混懸于B&K脈沖緩沖液(125mM KCl, 15mM NaCl, I. 2mMMgCl2, 25mM !fepes，3mM 葡萄糖，pH 7. 4)，并且使用流式電穿孔系統(tǒng)用pTM7 (100ug/mL)遵循下列脈沖參數(shù)轉(zhuǎn)染，例如在美國專利公開20030059945中描述的那種2. lKV/cm，400ms，4次脈沖，I. 25秒間隔，并且以O(shè). lmL/s流動。然后樹突細胞在脈沖培養(yǎng)基中孵育20分鐘，之后使細胞回到供體動物。使用該流式電穿孔系統(tǒng)的之前研究表明約75%的細胞群可以被轉(zhuǎn)染。實施例4樹突細胞施用至動根據(jù)實施例3的方法電穿孔的樹突細胞體外成熟，并且隨后施用至待治療的動物，或在電穿孔之后直接施用至動物。當(dāng)在沒有之前體外成熟的條件下施用樹突細胞時，可以使用描述于美國專利No. 7，785，583的原位成熟的方法(包括施用途徑)。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明所述的實施方案的多種改變和變化。盡管已經(jīng)結(jié)合特定優(yōu)選的實施方案來描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解所要求的本發(fā)明不應(yīng)該不恰當(dāng)?shù)叵拗茷檫@些特定實施方案。事實上，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的實施本發(fā)明的所述方式的各種變化旨在為本發(fā)明所覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種治療具有腫瘤的動物的方法，包括 向所述動物施用有效量的包含一種或多種樹突細胞的組合物， 其中在所述施用之前，所述一種或多種樹突細胞用下列物質(zhì)電穿孔 a.—種或多種腫瘤外泌體， b.一種或多種腫瘤外泌體裂解物， c.分離自所述一種或多種腫瘤外泌體裂解物的擴增的腫瘤RNA、擴增的腫瘤DNA或腫瘤蛋白、或其任意組合，或 d.其任意組合。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種樹突細胞分離自所述動物。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述一種或多種腫瘤外泌體分離自所述動物的生物樣品。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述生物樣品是血液樣品、尿液樣品或腫瘤腹水樣品。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述動物是人。
6.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種樹突細胞包括電穿孔后的腫瘤RNA、腫瘤DNA、腫瘤蛋白或其任意組合。
7.權(quán)利要求I所述的方法，還包括 a.從所述一種或多種腫瘤外泌體裂解物分離腫瘤RNA， b.使所述分離的腫瘤RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA， c.擴增所述DNA，以及 d.使所述DNA電穿孔到所述一種或多種樹突細胞中。
8.權(quán)利要求I所述的方法，還包括 a.從所述一種或多種腫瘤外泌體裂解物分離腫瘤DNA， b.擴增所述腫瘤DNA，以及 c.使所述腫瘤DNA電穿孔到所述一種或多種樹突細胞中。
9.權(quán)利要求I所述的方法，還包括向所述動物施用有效量的促乳泌素激動劑或多巴胺拮抗劑。
10.一種在動物中增強對于一種或多種腫瘤多肽的免疫應(yīng)答的方法，包括 向所述動物施用有效量的包含一種或多種樹突細胞的組合物， 其中在所述施用之前，所述一種或多種樹突細胞用腫瘤外泌體電穿孔，所述腫瘤外泌體包括編碼所述一種或多種腫瘤多肽的RNA。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述一種或多種樹突細胞分離自所述動物。
12.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述腫瘤外泌體分離自所述動物的血液、尿液或腹水樣品。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述腫瘤外泌體是完整的。
14.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述腫瘤外泌體是破碎的。
15.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述動物是人。
16.一種治療具有腫瘤的動物的方法，包括 向所述動物施用有效量的包含一種或多種T淋巴細胞的組合物， 其中在所述施用之前，所述一種或多種T淋巴細胞用一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物電穿孔。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述一種或多種T淋巴細胞和所述一種或多種腫瘤外泌體或腫瘤外泌體裂解物分離自所述動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療具有腫瘤或其他代謝紊亂的動物的組合物和方法。特別地，本公開的主題涉及使由于腫瘤和其他代謝紊亂脫落的外泌體電穿孔到免疫細胞(例如樹突細胞和T細胞)中的方法。使電穿孔的免疫細胞施用至具有腫瘤的動物導(dǎo)致針對腫瘤和腫瘤治療的免疫應(yīng)答增強。
文檔編號A01N63/00GK102905534SQ201180019660
公開日2013年1月30日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者約翰·W·霍拉迪 申請人:約翰·W·霍拉迪