專利名稱：玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及活性分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2 并在植物中高度表達(dá)的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列、含有該啟動(dòng)子序列的植物干旱誘導(dǎo)型表達(dá)載體，以及應(yīng)用該啟動(dòng)子生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
逆境脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響糧食產(chǎn)量最重要的因素和挑戰(zhàn)之一。土壤退化、 淡水匱乏、氣候(象)多變等因素導(dǎo)致扣除零產(chǎn)出的荒蕪、鹽堿、灘涂地(15億畝以上)夕卜， 每年直接由鹽堿、干旱、低溫等逆境脅迫造成的農(nóng)作物減產(chǎn)仍超過總產(chǎn)的20%左右。在這些嚴(yán)重影響農(nóng)作物生產(chǎn)的逆境因子中，干旱和鹽脅迫是最主要的因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國每年有7 億畝農(nóng)田受旱災(zāi)威脅，干旱所造成的損失幾乎是其它自然災(zāi)害所造成損失的總和。特別是擔(dān)負(fù)我國糧食生產(chǎn)任務(wù)65%以上的華北、東北和西北，恰恰是我國最缺水和最干旱的地區(qū)。解決糧食生產(chǎn)中嚴(yán)重的多元逆境脅迫問題，提高其產(chǎn)量，除了常規(guī)育種技術(shù)以外， 基于基因遺傳轉(zhuǎn)化的生物育種技術(shù)是一個(gè)重要的選擇。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物抗逆性是有效應(yīng)對(duì)逆境挑戰(zhàn)的根本途徑，而分離、克隆抗逆關(guān)鍵基因是解決這一重要問題的核心與關(guān)鍵，克隆和組建逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是進(jìn)行多抗基因轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)分子育種目標(biāo)的重要保障。 目前，從實(shí)踐上應(yīng)用的啟動(dòng)子來看，仍以CaMV35S、玉米WDiquitin promoter等組成型表達(dá)啟動(dòng)子為主，而且多為天然分離DNA片段的直接應(yīng)用，無法實(shí)現(xiàn)高效、可控和特異(定點(diǎn)、定時(shí)、定量)的調(diào)控，而且由35S啟動(dòng)的基因過表達(dá)會(huì)使轉(zhuǎn)基因植物表型產(chǎn)生一些負(fù)面效應(yīng)， 如矮化等。因此克隆并應(yīng)用脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來啟動(dòng)抗逆基因的表達(dá)，在提高植物的抗性方面具有重要作用。目前，許多學(xué)者對(duì)逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行了研究。如rd29A啟動(dòng)子是缺水等逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子。Kasuga等用組成型的CaMV 35S啟動(dòng)子和rd29A啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)DREBlA 基因轉(zhuǎn)化擬南芥(Kasuga M，Liu Q,Miura S，，1999)。CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DREBlA基因的過量表達(dá)激活了許多其他耐脅迫基因的表達(dá)，例如rc^9A、Kin l、Cor6.6等。轉(zhuǎn)基因植株都比非轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、抗鹽、抗凍能力顯著提高。但是，過量表達(dá)DREBlA基因也導(dǎo)致了植株在正常生長條件下生長遲緩；與之相反，由脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)不僅使植株有更強(qiáng)的脅迫耐受力還對(duì)其生長有著最小的負(fù)面影響。0sABA2基因編碼玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶，該基因啟動(dòng)子含有一個(gè)MYBR元件和5個(gè)MYCR元件，表明它的表達(dá)與ABA響應(yīng)誘導(dǎo)有關(guān)。Rai等用0sABA2基因啟動(dòng)子與GUS構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米，實(shí)驗(yàn)表明在沒有脅迫的條件下，由0sABA2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的的轉(zhuǎn)基因株系的GUS活性要比由Actl驅(qū)動(dòng)的對(duì)照組低得多(feii M，He CK，2009)。缺水處理后，葉片中由0sABA2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S 的表達(dá)量是無缺水處理對(duì)照組的5倍；而由Actl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的對(duì)照組GUS的表達(dá)量沒有任何增加。corlfe基因啟動(dòng)子具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)的特性，朱青等從擬南芥Columbia生態(tài)型的基因組中擴(kuò)增出corlfe基因的啟動(dòng)子片段，將其插入pBI121的⑶S基因和NOS終止子上游構(gòu)成表達(dá)載體PLB，獲得轉(zhuǎn)化株。⑶S組織染色結(jié)果表明，經(jīng)過低溫處理的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的葉片均表達(dá)了⑶S產(chǎn)物，而沒有經(jīng)過低溫處理的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯及非轉(zhuǎn)基因植株則檢測(cè)不到⑶S活性(朱青，宋波濤等，2004)。Rrandl等分析了大豆Gmhspl7. 32B熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中的調(diào)節(jié)作用，并在轉(zhuǎn)基因植物的種子上測(cè)得GUS活性，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子具有一段熱誘導(dǎo)因子(HSE)的同功序列。杜鵑等從小麥中克隆了 mWCS120啟動(dòng)子，構(gòu)建了誘導(dǎo)型瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pmw-GUS，用pmw-GUS轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織和煙草葉片證明，mwcsl20啟動(dòng)子在單子葉和雙子葉植物中均可受低溫等逆境誘導(dǎo)，可以用于驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)(杜娟， 朱禎，李晚忱，2005)。Nazmul等分離了 1. 6kb的AmCMO基因上游啟動(dòng)子片段，5'端缺失分析發(fā)現(xiàn)，翻譯起始點(diǎn)上游410bp片段中含有鹽脅迫響應(yīng)序列，300mmol/L NaCl處理24h后， ⑶S活性顯著提高，AmCMO基因上游410bp片段可以作為鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Nazmul HB, Akira H, Nana Y,2007)。利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是培育抗逆作物新品種的有效方法。目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少，對(duì)于新的抗逆相關(guān)啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)、克隆、順式作用元件分析以及與順式元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后研究的重點(diǎn)，將功能明確的抗逆啟動(dòng)子成功應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控抗逆基因的表達(dá)是植物抗逆基因工程的一個(gè)重要研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目標(biāo)基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來源于玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目標(biāo)基因的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物能反映啟動(dòng)子誘導(dǎo)活性的高低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的載體，所述載體包含帶有玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的5’ 非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。本發(fā)明提供一種獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1444bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，干旱可以在植物中誘導(dǎo)本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的高水平活性。獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列源自玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2。一種克隆得到的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+219bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，本發(fā)明所述的非翻譯區(qū)能通過增強(qiáng)導(dǎo)入植物中的目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，包含玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區(qū)。上述用于植物轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型載體是指能夠在轉(zhuǎn)基因植物中持久表達(dá)外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農(nóng)桿菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti質(zhì)粒存在下轉(zhuǎn)化植物的二元載體。該載體可以是經(jīng)常用于相關(guān)領(lǐng)域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，包含玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。關(guān)于本發(fā)明所述的用于植物的誘導(dǎo)型載體(PCAMBIA1301)，所述的玉米干旱應(yīng)答蛋白CKS2基因CKS2的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)在植物表達(dá)載體中位于外源基因的前面。本發(fā)明提供通過插入本發(fā)明所述的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)至含有GUS報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來代替。本發(fā)明提供一種應(yīng)用干旱誘導(dǎo)型二元載體的轉(zhuǎn)基因植物，以及一種應(yīng)用本發(fā)明所述進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的玉米成熟胚。植物能通過使用例如根癌農(nóng)桿菌(An，G 1987, Plant Physiology)或粒子轟擊方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子二元載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，例如煙草可以用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供來自玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在植物中進(jìn)行干旱誘導(dǎo)型表達(dá)。本發(fā)明有益效果在于可用于啟動(dòng)抗旱基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于抗旱的轉(zhuǎn)基因植物中，對(duì)于解決干旱地區(qū)糧食生產(chǎn)并提高其產(chǎn)量具有積極意義。


圖1為玉米(B73)基因組電泳圖其中1. 2. 3.代表目的條帶擴(kuò)增的模板玉米B73基因組DNA圖 2 為 ZmCKS2_pro PCR 電泳圖其中1.ZmCKS2 Μ. Marker IV圖3為pCAMBIA 1301 ZmCKS2pro質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖其中:M.marker ν 1. Cks-1301 質(zhì)粒酶切 2. Cks-1301 質(zhì)粒圖4為pCAMBIA 1301: ZmCKS2pro植物表達(dá)載體構(gòu)建示意5為ZmCKS2pro啟動(dòng)子的GUS檢測(cè)(用20 %的PEG處理)圖6為ZmCKS2pro啟動(dòng)子的⑶S檢測(cè)(未處理)圖7為pCAMBIA 1301 :ZmCKS2pro農(nóng)桿菌侵染煙草葉片篩選照片圖8為pCAMBIA 1301:: ZmCKS2pro農(nóng)桿菌侵染煙草葉片篩選后生根照片圖9為轉(zhuǎn)基因(ZmCKS2pr0)侵染煙草根的⑶S染色照片(未處理)圖10為轉(zhuǎn)基因(ZmCKS2pro)侵染煙草根的⑶S染色照片(用20%的PEG處理)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖介紹具體實(shí)施例以下的實(shí)施將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面對(duì)于本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。實(shí)施例1 玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的啟動(dòng)子(啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQ ID NO=I的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1444bp區(qū)的DNA核苷酸序列)，在玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的 5’非翻譯區(qū)序列中得到鑒定。玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2登錄在NCBI GenBank (登錄號(hào)⑶556566. 1)，序列表顯示本發(fā)明上述基因的植物干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)的DNA序列。在圖1中，蛋白合成的起始密碼子ATG帶有下劃線，而且轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基T用+1示出。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。啟動(dòng)子分析網(wǎng)站為http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/0以玉米基因組DNA(圖1)為模板，擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)
瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出長度為1860bp的特異條帶，并進(jìn)行回收(圖幻。電泳后回收目的片段，與PMD 18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD 18-T::Zm CKS2ft~o，提取質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切驗(yàn)證，并測(cè)序。更具體地說，通過PCR擴(kuò)增克隆的干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的啟動(dòng)子和219bp的5’ 非翻譯區(qū)(見序列表)，上述PCR所用引物詳細(xì)顯示在表1中。對(duì)于PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序: 940C 4min ；94°C 50S，55. 5°C 50S，72°C 2min，29 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；表1:引物
上游引物5' CAATCCTGTCTTGCCCCATACT 3'SEQ ID NO 2下游引物5' TCCATGGCTACCMGACTTCTCG 3'SEQ ID NO 3 實(shí)施例2 植物干旱誘導(dǎo)型載體的構(gòu)建將在實(shí)施例1中所克隆的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的啟動(dòng)子和219bp的5’非翻譯區(qū)ZmCKS2ftx)(見序列表)插入到載體中，從而構(gòu)建植物干旱誘導(dǎo)型載體。更具體地說，將植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301及重組質(zhì)粒pMD 18-T: :Zm CKS2Pro 用克隆序列內(nèi)部的I3StI和NcoI分別進(jìn)行酶切，然后將它們插入載體pCAMBIA1301的I^stI 和NcoI酶切位點(diǎn)。該載體被稱作pCAMBIA 1301: Zm CKS2ftx)，用于驅(qū)動(dòng)⑶S基因的表達(dá)， 經(jīng)酶切鑒定(圖3)獲得了啟動(dòng)子片段，與預(yù)期結(jié)果相同。在圖4中，以編碼β -葡糖酸醛酶的基因GUS為報(bào)告基因，選擇標(biāo)記為潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的啟動(dòng)子，而35s_ter代表HPTII的終止子，Sn CKS2Pro代表⑶S的啟動(dòng)子，而Nos-ter代表⑶S的終止子。實(shí)施例3 鑒定玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性通過熱激轉(zhuǎn)化法，將在實(shí)施例2中構(gòu)建的載體pCAMBIA 1301:: Zm CKS2Pro轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。為鑒定啟動(dòng)子的干旱誘導(dǎo)活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法對(duì)農(nóng)桿菌侵染后的玉米的胚干旱處理再檢測(cè)GUS的活性。更具體地說，將玉米種子浸泡催芽，然后將種子縱切成兩半，用20 % PEG誘導(dǎo)培養(yǎng)Mh，將玉米種子在⑶S檢測(cè)液中于37 °C過夜，⑶S檢測(cè)液3mg/mlX-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. 1% TritonX-100，20%甲醇。如圖所示(圖5， 圖6)，經(jīng)過PEG誘導(dǎo)的胚根組織顯示出高水平的⑶S活性，而未經(jīng)誘導(dǎo)的愈傷組織顯示出低水平的GUS活性。實(shí)施例4 煙草的葉盤轉(zhuǎn)化4.1受體材料的準(zhǔn)備將煙草種子(NC89)用10%的次氯酸鈉消毒，用無菌水沖洗三次，接種在MS培養(yǎng)基上，得到無菌煙草苗。待幼葉長至2 3cm時(shí)，將葉片取下用直徑為7mm的打孔器制成葉盤，近軸面向下接種在分化培養(yǎng)基(MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L ΝΑΑ,ΡΗ = 5. 8,0. 7%瓊脂) 上，預(yù)培養(yǎng)2 3d。葉盤切口處剛剛開始膨大時(shí)即可進(jìn)行侵染。4. 2農(nóng)桿菌菌液的制備將農(nóng)桿菌EHA105接種于YEP(50mg/L rif、50mg/L kan)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)，至長出單菌落。挑取單菌落，接種在5mL含有相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，于， 200r/min振蕩培養(yǎng)M 36小時(shí)，將菌液按1 20的比例進(jìn)行二次活化。當(dāng)0D600 = 0. 4 0. 6時(shí)，吸取菌液置于無菌離心管中，5000rpm離心5min，棄上清，用等體積的MS液體培養(yǎng)基
重懸，備用。4. 3侵染取預(yù)培養(yǎng)2 3d的外植體葉片于無菌三角瓶中，加入適量活化好的農(nóng)桿菌菌液，侵染5 IOmin左右。4. 4共培養(yǎng)將侵染過的外植體接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2d。4. 5除菌及篩選培養(yǎng)將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體用無菌水沖洗3 4次，然后用附加除菌劑的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)30min，用無菌濾紙吸干表面水分，再轉(zhuǎn)移到附加選擇壓力的除菌篩選培養(yǎng)基上，28°C光照培養(yǎng)，每IOd繼代一次(圖7)。4. 6繼代篩選培養(yǎng)篩選培養(yǎng)2 3周后，外植體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)入相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。4. 7生根培養(yǎng)待不定芽長到3 4cm時(shí)，將其切下并插入生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，兩周左右長出不定根。(圖8)實(shí)施例5 轉(zhuǎn)化煙草的組織化學(xué)法染色將實(shí)施例4中的煙草根在含有20% PEG的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Mh，浸入⑶S檢測(cè)液， 于37°C保溫過夜，將染色材料用70%的乙醇脫色除去葉綠素。⑶S檢測(cè)液lmg/ml X-gluc、 50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH = 7. 0), IOmM EDTA,0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. 1 % ΗΟηΧ-100，20%甲醇。如圖9、圖10所示，經(jīng)過PEG誘導(dǎo)的根示出高水平的⑶S活性，而未經(jīng)誘導(dǎo)的根未檢測(cè)出GUS活性。工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明提供玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明提供分別將啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)插入至pCAMBIA1301而制得的植物表達(dá)載體。經(jīng)使用所述的植物表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所述的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2 的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠進(jìn)行干旱誘導(dǎo)型的表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于提高耐旱基因的啟動(dòng)活性，最終獲得能用于生產(chǎn)的耐旱植物。 序列表
SEQ ID NO. 1的序列(帶功能元件標(biāo)記)
⑴序列特征(A)長度-lbp至-1444bp ；+Ibp至+219bp ； (B)類型核苷酸；(C) 單鏈。
( )分子類型核苷酸 (iii)序列描述=SEQ ID NO. 1
-1444 GTTGTGCTCA A0GGTCA00C GTGGACATOC ATOGTGMOC OCMTTOGTG AGTGATTGAT ATTCAGTTTT CCAAT-box MBS
-1374 GCCTACATCT IUTTCTTGCT TGTTTCTTCA ATTGATTGTA GGMTAGMC TTTGTGTTCA GGTTGATCTT -1304 GTCAOCAGCA AGGTCMTM OCATTTGGM TTGCTTCTGC GMTGCTMG GTGCCAOGAC CIUTTOGTTC Box-WlG-box
-1234 GTAGTOGGAT OGCGAGTCAT GTTCTOCAOC MTCMMTT AT0CA0CT0G TOGAMGATC GGGGACTOCA
Skn-l_motif TC-rich repeats circadian -1164 GCTCTATCAC CTTTTATAGG TCAGGAMGG GGTOGGCCAG AGATGGMGG AGCOGCGAGG
-1094 AOCMOGTTC TATCTAGGGT AMGCCATGT
C-repeat/DRE GTACTOGTGG GAOOOGGMT TGTTTG1TTC
CMGGGTMT
ABRE GTATTTAOOG
G-box
-1024 TGGCGCATGA OGTGGGGCTG OGATGGTAOC AGGCGCTACT GTOCTCTOCA CACAOGCTAC ACT000CT0G CGTCA-motif
-954 GCCTOGTTGT GACTOGTGTC AAMCTCTTC OGTGAAMOC GTATOCACTA AGGCAGACTC CMOGAOGCC
CE3
TGA-element
-884 OOCTCTGCTC 000CTCA00C TOGCCAOGGC GTAOGACAGC TOCATGMOG ACTOCATOGT TGCOOOCTCT
TGA-element
AGAGAMOGT nOCTTOCAC
-814
-744 -674
(XCTOOOOCT CAOGCOGATG Spl
GTGTGAmT CTGATMCM
TTGATGTATA AMGTCAMT
TATGTAmT MCTTAGm
GATMTMTT ATGAMTTM mTTTTCAG
TAATbox ATACAmn Α ΤΠΤΤΑΜ ACTTCAAAM ATGAGCTGM TAAMGGMT GGTTGGAGM GA-motif
GGTACTACM MTGATAMG as-2—box
-604 GGGATAGMT AGGGGGMGA ATAGTTGAGG GGGAGGTATG TAMTATGM AAMGTATM mGGGGGAT
TCA-element -534 TTGAGAGAGA GMTGGmG AGATAOOCTA AGGGCTGAH
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GGGATTGAGG AMnMOOC
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Spl
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CCAAT-boxTC-rich repeats
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權(quán)利要求
1.一種獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于 SEQID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1444bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列源自玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO :1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+219bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3所述的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區(qū)。
5.一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物包含權(quán)利要求 1所述的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3所述的玉米干旱應(yīng)答蛋白基因CKS2的 5’非翻譯區(qū)。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及活性分析屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，包含相對(duì)于SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-1444bp區(qū)的DNA核苷酸序列；同時(shí)提供用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，其包含玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米干旱應(yīng)答蛋白基因的5’非翻譯區(qū)；用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物包含玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米干旱應(yīng)答蛋白基因的5’非翻譯區(qū)；SEQ ID NO2和3的PCR引物引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本發(fā)明可用于啟動(dòng)抗旱基因的高效表達(dá)、用于抗旱的轉(zhuǎn)基因植物中，對(duì)于解決干旱地區(qū)糧食生產(chǎn)并提高其產(chǎn)量具有積極意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102417910SQ201110363699
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者劉金亮, 張世宏, 張桂珍, 李桂華, 潘洪玉, 王鳳婷, 賈承國 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)