專利名稱：一種Viviparous1基因及其啟動子表達載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育小麥品種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種Viviparous 1 (Vp 1,以下簡稱Vpl)基因及其啟動子的表達載體構(gòu)建方法，同時還涉及一種Viviparous 1基因及其啟動子在小麥穗發(fā)芽抗性育種中的應(yīng)用，包括轉(zhuǎn)Vpl基因獲得抗穗發(fā)芽小麥新材料，Vpl基因啟動子在小麥種子中特異表達的應(yīng)用，Vpl基因抗穗發(fā)芽的功能驗證，及以轉(zhuǎn)基因抗穗發(fā)芽為親本的小麥品種培育。
背景技術(shù)：
小麥穗發(fā)芽(preharvest sprouting, PHS)是指在收割前籽粒就在麥穗上萌發(fā)的現(xiàn)象。穗發(fā)芽消耗了貯藏營養(yǎng)，籽粒重量減輕，導(dǎo)致減產(chǎn)。更嚴(yán)重的是穗發(fā)芽造成小麥品質(zhì)下降，穗發(fā)芽種子生產(chǎn)的面粉，由于淀粉降解，制作的面條容易斷裂，面包體積小，失去商用價值。同時，穗發(fā)芽引起種子活力下降，導(dǎo)致幼苗生長不良，影響來年的產(chǎn)量，因此穗發(fā)芽的小麥也失去了留種的價值(Groos C.，Gay G.，Perretant M. R. et al. Study of the relationship between pre—harvest sprouting and grain color by quantitative trait loci analysis in a whiteXred grainbread—wheat cross. TheorAppl Genet, 2002，104 :39-47)。這些都會給小麥生產(chǎn)者帶來嚴(yán)重損失。穗發(fā)芽是一個世界性的災(zāi)害，在美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、南非、日本、法國等主要小麥生產(chǎn)國都曾發(fā)生。在我國，83%的小麥生產(chǎn)區(qū)都有不同程度的發(fā)生。在小麥?zhǔn)斋@前，遇到冷濕天氣，一些敏感的品種就易發(fā)生穗發(fā)芽。長江流域在小麥?zhǔn)斋@前常遇陰雨天氣，穗發(fā)芽現(xiàn)象時常發(fā)生，是我國穗發(fā)芽危害最嚴(yán)重的地區(qū)之一(Xiao S. H., Zhang Χ. Y. &Yan C. S. et al. Germplasm improvement for preharvest sprouting resistance in Chinese white-grained wheat :An overview of the current strategy. Euphytica， 2002，126 :35-38)。受全球氣候變化影響，我國北方近年也多次遭受穗發(fā)芽的危害，僅1992 年陜西關(guān)中地區(qū)小麥穗發(fā)芽減產(chǎn)4億公斤，直接經(jīng)濟損失達2. 6億元。在我國現(xiàn)有栽培品種中，具有較高穗發(fā)芽抗性的不到5% (黃濤，李和平，張兆順等.小麥穗發(fā)芽抗性與選擇效應(yīng)研究.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007二6(1) :11-14)?？梢娝氚l(fā)芽嚴(yán)重威脅著我國的小麥生產(chǎn)安全，尋找抗穗發(fā)芽的種質(zhì)資源，培育抗性小麥品種，是解決這一問題的根本途徑。穗發(fā)芽抗性與種子休眠相關(guān)，受多基因調(diào)控，并受潮濕和低溫環(huán)境的誘導(dǎo)。在分子水平上，標(biāo)記了與種子休眠和穗發(fā)芽抗性相關(guān)的QTL位點達數(shù)十個。幾乎每條同源染色體上都有與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的QTL位點。通過對小麥基因組間的比較，以及不同谷物的遺傳圖譜的比較，發(fā)現(xiàn)種子休眠和穗發(fā)芽抗性QTL位點所處的染色體區(qū)段具有很高的同源性， 其中 Vpl (Viviparous 1)基因與穗發(fā)芽有密切關(guān)系(Li，C.，Ni，P.，F(xiàn)rancki，M.，Hunter, A. , Zhang, Y. , Schibeci, D. , Li, H. , Tarr, Α. , Wang, J. , Cakir, Μ. , Yu, J. , Bellgard, Μ. , Lance, R. , Appels, R. ,2004. Genes controlling seed dormancy and pre—harvest sprouting in a rice-wheat-barley comparison. Funct Integr Genomics 4,84—93;Gale, Μ. D. , Flintham, J. Ε., Devos, K. Μ. ,2002. Cereal comparative genetics and preharvest sprouting. Euphytica 126，21—25)。Vpl基因是玉米中發(fā)現(xiàn)的控制穗萌(穗發(fā)芽)的重要調(diào)節(jié)基因，現(xiàn)已在多種禾本科植物中分離出 Vpl 同源序列(McCarty，D. R.，Hattori, T.，Carson, C. B.，Vasil, V.，Lazar, M. ,Vasil,I. K. ,1991.The viviparous-1 developmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator. Cell66，895-905)。該基因的缺陷型表現(xiàn)為對 ABA 不敏感， 玉米種子在穗軸上就可萌發(fā)，類似于擬南芥abi3(ABA-insensitive 3)突變體(Giraudat， J. , Hauge, B. Μ. , Valon, C. , SmalIe, J. , Parcy, F. , Goodman, H. Μ. , 1992. Isolation of the Arabidopsis ABI3gene by positional cloning. Plant Cell4,1251-1261)。Vpl有 5個內(nèi)含子，編碼691個氨基酸蛋白(VPl)。VPl有4個保守結(jié)構(gòu)域Al，Bi，B2和B3。Al 是VPl N端的一個酸性激活域。Bl與bZIP轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用。B2含有核定位信號， 與核定位有關(guān)，同時有反式激活功能。B3與特異DNA序列(Sph元件)結(jié)合。VPl是一個轉(zhuǎn)錄因子，與特異DNA序列結(jié)合，具有兩方面的功能一方面作為轉(zhuǎn)錄激活因子，在種子成熟過程中，促進Em、Cl等多種種子發(fā)育后期與胚成熟相關(guān)基因的表達，使種子獲得干化耐個生(McCarty, D. R. ，Hattori, Τ. ， Carson, C. B. ，Vasil, V. ， Lazar, M. ，Vasil, I. K. ，1991. The viviparous-1 developmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator. Cell66,895-905)；另一方面作為抑制因子，抑制與種子萌發(fā)相關(guān)基因特別是 a-淀粉酶基因的表達，從而使種子獲得一定的休眠性(Hoecker，U.，Vasil, I. K.，McCarty, D. R.，1995. Integrated control of seed maturation and germination programs by activator and repressor functions ofViviparous-Iof maize. Genes&Development 9, 2459-2469) 0 Yang等在分析小麥Vpl (TaVpl)基因時發(fā)現(xiàn)，該基因內(nèi)含子3具有多態(tài)性， 并與種子休眠和穗發(fā)芽抗性相關(guān)，在該位點存在插入或切除序列的品種多具穗發(fā)芽抗性， 可用作穗發(fā)芽抗性的 STS 標(biāo)記(Yang Y. , Zhao X. L. , Xia L. Q. et al. Development and validation of a Viviparous-ISTS marker for pre—harvest sprouting tolerance in Chinese wheats. Theor Appl Genet，2007，115 :971-980)。在種子發(fā)育過程中，VPl對大量基因的表達具有強大的調(diào)控作用。Vpl與abi3是直向同源基因，將Vpl基因轉(zhuǎn)到擬南芥abi3突變體中，結(jié)果表明能夠在擬南芥背景下表達， 恢復(fù)abi3突變體的部分休眠性。通過基因芯片分析，鑒定出了 353個受ABA/VP1調(diào)節(jié)的基因，占被檢測基因的4. 8%，其中73%的基因受ABA/VP1共同調(diào)節(jié)，表明VPl在ABA的調(diào)控中處于中心位置，鑒定的27個種子貯藏蛋白，均受Vpl基因正調(diào)節(jié)，因此Vpl基因在對種子發(fā)育的調(diào)節(jié)中，可能還對種子品質(zhì)產(chǎn)生影響。ABA/VP1對Em和Cl基因表達調(diào)控研究表明， VPl和ABA作用于啟動子的不同元件，單獨的ABA或VPl的作用，可使表達提高十余倍，而兩者同時存在，可使表達提高一百多倍，呈現(xiàn)乘積關(guān)系(McCarty，D. R.，Hattori, Τ.，Carson, C. B. , Vasil, V. , Lazar, Μ. , Vasil, I. K. , 1991. The viviparous-1 developmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator.Cell 66,895-905)。小麥Vpl基因轉(zhuǎn)錄后不能正確拼接，是導(dǎo)致小麥容易發(fā)生穗發(fā)芽的重要因素。對小麥Vpl基因轉(zhuǎn)錄水平上的分析表明，由于不能正確拼接，每一基因組轉(zhuǎn)錄出一套mRNA，包括內(nèi)含子的插入和外顯子的切除，導(dǎo)致大部分成熟mRNA不能合成全長VPl蛋白，從而失去調(diào)節(jié)功能。Western blot雜交也表明，在小麥胚細胞核中存在大小不同的VPl蛋白。進一步研究發(fā)現(xiàn)小麥近緣種和祖先種同樣存在Vpl基因的錯拼，并與小麥有相似的拼接模式。 因此，小麥的錯拼不是人為選擇的結(jié)果，在小麥品種中可能沒有能夠正確拼接的Vpl基因 (Wilkinson,M. ,Lenton,J. ,Holdsworth,M. ,2005. Transcripts of Vp-Ihomoeologues are alternatively spliced within the Triticeae tribe. Euphytica 143，243-246)。因此將有功能的外源Vpl基因轉(zhuǎn)入小麥中，可能提高小麥的穗發(fā)芽抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于克服小麥穗發(fā)芽抗性資源缺乏，將外源Vpl基因?qū)胄←溸z傳背景下，補償小麥自身TaVpl的缺陷，從而達到培育高抗穗發(fā)芽小麥品種的目的。本發(fā)明的目的 Μ共了—禾中 Viviparous 1 (Accession no. M60214. 1 ；McCarty, D. ， Hattori, Τ. , Carson, C. , Vasi1, V. , Lazar, Μ. , Vasil, I.,1991.The Viviparous-Idevelopmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator. Cell 66,895-905)及其啟動子(Accession no. DQ886030. 1 ；Cao, X. Y. , Costa, L. Μ. , Biderre-Petit, C. , Kbhaya, B., Dey, N. , Perez, P. ,McCarty,D. R. , Gutierrez-Marcos,J. F. ,Becraft,P. W. ,2007. Abscisic acid and stress signals induce viviparous 1 expression in seed and vegetative tissues of maize. Plant Physiology 143，720-731)的表達載體構(gòu)建方法，利用 Vp 1 基因自身的啟動子，可使Vpl基因特異地在種子中表達。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種Vpl基因及其啟動子在小麥穗發(fā)芽抗性育種中的應(yīng)用。Vpl基因在小麥中的表達產(chǎn)物可以補償小麥Vpl (TaVpl)基因由于錯誤拼接而喪失的功能，提高ABA信號傳遞的敏感性，提高小麥種子休眠性和穗發(fā)芽抗性；Vpl基因的啟動子主要在種子中特異表達，可克服組成型啟動子組成型表達的缺陷。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將Vpl基因及其啟動子轉(zhuǎn)到小麥中獲得抗穗發(fā)芽抗性小麥材料，利用這些抗穗發(fā)芽新材料培育小麥品種。一種Viviparous 1基因及其啟動子的表達載體構(gòu)建方法，包括以下步驟A、目的基因及其啟動子的克隆合成引物VpromoterF (ACAGAATTCGGCGCGCCGTCGACACCATATTTAAGAAC)，Vpromoter R(GCTCCCGGGCAGAGAGGCACGACGACAAA)，以玉米 851213-1 XHE124B 基因組 DNA 為模板，擴增出目的基因Vpl的啟動子序列Vpromoter.剝離玉米胚，在含10 μ m ABAMS (Murashige T and Skoog F(1962),A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3) :473-497)培養(yǎng)基中，200rpm 搖床培養(yǎng) 22_26h，提取 mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，使用引物 VgCF (CTGGATATCTCTCCTCCCTTTGTCGTCGT)和 VgCR (TTCG AGCTCTGCTCTTTCAGATGCTCACCG)，擴增出 Vpl 基因的編碼序列 Vplcds。PCR 產(chǎn)物 Vpromoter 經(jīng)EcoRI和SmaI酶切后，Vplcds經(jīng)EcoRV和SacI酶切后連接到pBluescript SK+/-(購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa))，測序。B、載體構(gòu)建以pBML-PMI載體(張倩，廖玉才，陳方方，董璇，李和平，大腸桿菌6 —磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的克隆與表達.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006,25(5) =461-464)為基礎(chǔ)， Vpromoter和Vplcds經(jīng)酶切后，與pBML-PMI質(zhì)粒連接，構(gòu)建成pBML_PMI_Vpl表達載體。
C、轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌pBML-PMI-Vpl表達載體通過電擊轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌C58C1或GV3101 (購自 invitrogen 公司)(Sambrook 等，分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，用于小麥的遺傳轉(zhuǎn)化。一種Viviparous 1基因及其啟動子在小麥穗發(fā)芽抗性中的應(yīng)用，其步驟是第一步小麥愈傷組織的誘導(dǎo)取開花后14-16天的小麥幼胚，盾片向上置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含ang/L 2，4_D的MS) 上誘導(dǎo)愈傷，15-20天繼代一次，直到進行遺傳轉(zhuǎn)化。第二步愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)根瘤農(nóng)桿菌C58C1 或 GV3101 在 YEB 培養(yǎng)基(Vervliet,G. ,Holsters,Μ. ,Teuchy, H.，Montagu, Μ. van, Schell, J.，1975.Characterization of different plaque forming and defectivetemperate phages in Agrobacterium strains. J. gen. Virol.26,33-48)中 200rpm, 搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6-0. 8，收集菌體，以浸染培養(yǎng)基(1/10大量元素的MS培養(yǎng)基+ZymAS)重懸，調(diào)整OD6tltl = 0.6-0. 8。浸染小麥愈傷，超聲波處理20s，搖床搖30min， 鋪于濾紙上，當(dāng)愈傷失水50-70%后，于濾紙上23°C共培2-3d ；第三步抗性愈傷的恢復(fù)培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7d ；第四步抗性愈傷的分化轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基(MS+0. 5 μ m IAA+1 μ m ΒΑ)中，每14-20天繼代一次，第一輪分化篩選培養(yǎng)基加IOg甘露糖，第二輪分化篩選加5g甘露糖。第五步再生植株的生根篩選分化的幼苗轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基(1/2MS+0. 5 μ m NAA, 15g甘露糖)中。第六步再生植株的春化移栽形成的健壯幼苗春化處理后，種于生長室中。第七步再生植株的鑒定通過對比玉米Vpl 和小麥 TaVpl 基因(Accession no. AJ400712, AJ400713, AJ400714)的 DNA 序列，設(shè)計了 Vpl 基因特異的引物 VgF(CAGGACGACATTCACCACCG)， VgR(AACCACTGCCTTGCTCTTGC)經(jīng) PCR 鑒定 Vplcds 序列。利用 Ubiquitin 啟動子和Riii基因(張倩，廖玉才，陳方方，董璇，李和平，大腸桿菌6—磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的克隆與表達.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006,25(5) =461-464)序列，設(shè)計引物 UbiF (GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC)，PmiF (TCCGGCTTGTGGTTAGGATC)鑒定 Ubiquitin 與 Pmi 連接處的序列。提取開花后8-40天小麥幼胚m RNA,去DNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，VgF, VgR擴增 Vpl特異序列。第八步陽性株系的穗發(fā)芽抗性鑒定小麥轉(zhuǎn)基因后代種于生長室中。生理成熟期取各轉(zhuǎn)化株系麥穗進行種子發(fā)芽和穗發(fā)芽試驗。第九步陽性株系種子發(fā)育中Vpl基因的表達及受控基因檢測提取開花后8-40小麥種子mRNA，通過qRT-PCR分析受Vpl調(diào)控基因的表達情況。第十步Vpl基因?qū)Τ墒煨←湻N子α _淀粉酶性的調(diào)節(jié)
提取成熟小麥種子的α -淀粉酶，檢測α -淀粉酶活性，比較轉(zhuǎn)基因陽性株系與非轉(zhuǎn)化植株間的差異。第十一步抗穗發(fā)芽轉(zhuǎn)基因株系與普通小麥的雜交及后代穗發(fā)芽的抗性的鑒定以抗穗發(fā)芽轉(zhuǎn)基因株系為父本，普通小麥為母體，進行雜交實驗，并對雜交后代進行穗發(fā)芽抗性鑒定，評價抗穗發(fā)芽轉(zhuǎn)基因株系在雜交育種中的可行性。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明首次通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將玉米Vpl基因及其啟動子轉(zhuǎn)移到小麥中。本發(fā)明獲得的陽性株系中，Vpl基因在小麥幼胚中的表達，提高了 ABA信號傳遞的敏感性，增強了小麥種子的休眠性，從而使獲得的轉(zhuǎn)基因陽性材料穗發(fā)芽抗性顯著提高。因此本發(fā)明將玉米 Vpl基因及其啟動子轉(zhuǎn)化小麥的方法用于小麥抗穗發(fā)芽品種培育中，將減少小麥穗發(fā)芽造成的損失。


圖1為一種pBML-PMI-Vpl表達載體示意圖。Vplcds =Vpl 基因編碼序列；Vpl-P =Vpl 基因啟動子；Ubi-P =Ubiquitin 啟動子· Pmi :phosphate isomerase 基因；SAR :scaffold attachment region.圖2為一種PCR鑒定WDiquitin啟動子和Riii篩選基因連接序列示意圖。M:分子量標(biāo)記，1 空白對照，2 野生型對照，3-19 不同轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因株系可擴增出特異的目的帶，而對照中沒有。圖3為一種PCR鑒定目的基因Vp Icds序列示意圖。M:分子量標(biāo)記，1 空白對照，2 野生型對照，3-19 不同轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因株系可擴增出特異的目的帶，而對照中沒有。圖4為一種RT-PCR檢測Vpl基因在轉(zhuǎn)基因株系開花后20d幼胚中的表達示意圖。M 為分子量標(biāo)記，1 為野生型對照，2-7 為轉(zhuǎn)基因小麥。在轉(zhuǎn)基因小麥幼胚中， Vpl基因能正常表達。圖5為一種小麥遺傳轉(zhuǎn)化E39陽性株系種子發(fā)芽和穗發(fā)芽抗性鑒定示意圖。Α. E39T2代種子發(fā)芽(7d)B.對照種子發(fā)芽(7d)C. E39T5代穗發(fā)芽(4d)，D.對照穗發(fā)芽Gd)。E39的發(fā)芽率顯著降低，穗發(fā)芽抗性顯著提高。圖6小麥遺傳轉(zhuǎn)化E39陽性株系T5代種子發(fā)育過程中4個受Vp 1調(diào)控基因表達的qRT-PCR分析示意圖。A :Wabi5-l ；B :Malate oxidoreductase ；C :Peroxiredoxin ；D :Em_Bl。4^^因的表達水平均顯著高于對照，表現(xiàn)出E39株系Vpl調(diào)控作用增強。圖7為一種小麥轉(zhuǎn)基因陽性株系α -淀粉酶活性測定示意圖。與對照相比，轉(zhuǎn)基因各株系α -淀粉酶活性均顯著降低。
具體實施例方式實施例1 :目的基因及啟動子的克隆和載體構(gòu)建目的序列克隆與測序依據(jù)文獻和NCBI公布的序列、合成引物Vpr0m0terF(AC AGAATTCGGCGCGCCGTCGACACCATATTTAAGAAC)， VpromoterR(GCTCCCGGGCAGAGAGGCACGACGACAAA)，以玉米851213-1XHE124B基因組DNA為模板，擴增出目的基因Vpl的啟動子序列 Vpromoter.剝離玉米胚，在含IOymABA的MS培養(yǎng)基中，200rpm搖床培養(yǎng)Mh，提取mRNA， 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，引物 VplCF (CTGGATATCTCTCCTCCCTTTGTCGTCGT)和 VplCR(TTCGAGCTCTGC TCTTTCAGATGCTCACCG)，擴增出 Vpl 基因的編碼序列 Vplcds。PCR 產(chǎn)物 Vpromoter 經(jīng) EcoRI 和SmaI酶切后，Vplcds經(jīng)EcoRV和&icl酶切后連接到pBluescript SK+/-，測序。測序表明VPl啟動子與NCBI公布的序列為97%的同源性，編碼序列與NCBl序列完全一致。載體構(gòu)建以pBML-PMI載體(張倩，廖玉才，陳方方，董璇，李和平，大腸桿菌6 — 磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的克隆與表達.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，25 (5) =461-464)為基礎(chǔ)， Vpromoter序列經(jīng)SmaI酶切和AscI部分酶切，Vplcds經(jīng)EcoRV和SacI酶切后，與經(jīng)AscI 和Mel酶切的pBML-PMI質(zhì)粒連接，構(gòu)建成pBML-PMI-Vpl表達載體。測序分析表明載體 pBML-PMI-Vpl 構(gòu)建正確(圖 1)。轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌pBML-PMI-Vpl表達載體通過電擊轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌C58C1或 GV3101(購自invitrogen公司)(Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(New York CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989),用于小麥的遺傳轉(zhuǎn)化。實施例2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Vpl基因在小麥中的遺傳轉(zhuǎn)化鄭9023 (河南省農(nóng)科院小麥所選育)和鄂麥13 (湖北省農(nóng)科院選育)種植于實驗田中，取開花后14-16天的小麥幼胚，盾片向上置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含ang/L 2，4-D的MS)上誘導(dǎo)愈傷，15-20天繼代一次，直到進行遺傳轉(zhuǎn)化。根瘤農(nóng)桿菌C58C1或GV3101，在YEB培養(yǎng)基中200rpm，搖床培養(yǎng)至0D_ = 0. 6-0. 8，收集菌體，以浸染培養(yǎng)基(1/10大量元素的MS培養(yǎng)基+2 μ mAS)重懸，調(diào)整OD6tltl = 0. 6-0. 8。浸染小麥愈傷，超聲波處理20s，搖床搖30min，鋪于濾紙上，當(dāng)愈傷失水50-70%后，于濾紙上23°C共培2_3d，然后轉(zhuǎn)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基(MS+0. 5 μ mIAA+1 μ mBA)中，每14-20天繼代一次，第一輪分化篩選培養(yǎng)基加IOg甘露糖，第二輪分化篩選加5g甘露糖。分化的幼苗轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基(1/21^+0.5口!11織4，158甘露糖)中。形成的健壯幼苗春化處理后，種于生長室中。實施例3 抗性植株的鑒定利用Ubiquitin啟動子和Pmi基因序列，設(shè)計引物 UbiF (GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC)，PmiR(TCCGGCTTGTGGTTAGGATC)，擴增 ubiquitin 啟動子和Riii之間連接處的序列(圖2)，通過對比玉米Vpl和小麥TaVpl基因的DNA序列，設(shè)計了引物 VgF (CAGGACGACATTCACCACCG)，VgR(AACCACTGCCTTGCTCTTGC)，PCR 特異擴增 Vplcds 序列(圖3)。PCR結(jié)果表明平均轉(zhuǎn)化效率為5.4%。實施例4 轉(zhuǎn)基因株系的穗發(fā)芽抗性鑒定和篩選小麥轉(zhuǎn)基因后代種于生長室中，IMi光照，18-20°C。生理成熟期取各轉(zhuǎn)化株系麥穗進行種子發(fā)芽和穗發(fā)芽試驗。種子發(fā)芽鑒定，手工脫粒，種子置于9cm培養(yǎng)皿，兩層濾紙，種子腹溝向下，加5ml蒸餾水，20°C萌發(fā)，逐日記錄萌發(fā)種子數(shù)，然后計算發(fā)芽勢，發(fā)芽勢為萌
發(fā)GI = (7ηι+6η2+......+1η7) /7N. H1......n7分別為第1天到第7天的發(fā)芽種子數(shù)，N為種
子總數(shù)。穗發(fā)芽鑒定，生理成熟期每株系取5-6個麥穗直立于花泥中，每4小時自動噴霧1 次，4天后天統(tǒng)計穗發(fā)芽率和平均發(fā)芽度，發(fā)芽度依據(jù)1984年標(biāo)準(zhǔn)(Hagemarm，Μ. G.，Ciha, A. J. , 1984. Evaluation of methods msed in testing winter wheat susceptibility topreharvest sprouting. Crop Science 24,249-254).小麥轉(zhuǎn)化后代中，鄭麥9023 78%株系，鄂麥13 90%以上的株系種子發(fā)芽勢和穗發(fā)芽低于對照小麥，其中鄭麥9023中有5個株系表現(xiàn)出明顯穗發(fā)芽抗性。對這些株系的 T2-T5代種子發(fā)芽實驗表明，這些株系抗性穩(wěn)定，每一世代均顯著低于對照，達到高抗水平 (表1，圖5A，B)。對這5個株系T5代穗發(fā)芽鑒定表明，穗發(fā)芽度顯著下降(表1，圖5C，D)。 這些結(jié)果證明，轉(zhuǎn)Vpl基因提高了小麥穗發(fā)芽抗性，可作為穗發(fā)芽抗性的遺傳資源。表1.轉(zhuǎn)基因株系T2-T5代種子發(fā)芽勢和T5代穗發(fā)芽度分析
權(quán)利要求
1.一種Viviparous 1基因及其啟動子的表達載體構(gòu)建方法，其步驟是A、目的基因的克隆合成引物VpromoterF、VpromoterR以玉米851213-1 XHE124B基因組DNA為模板，擴增出目的基因Vpl的啟動子序列Vpromoter.剝離玉米胚，在含IOym ABA MS培養(yǎng)基中， 200rpm搖床培養(yǎng)22_2他，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用引物VgCF和VgCR，擴增出Vpl 基因的編碼序列Vplcds，PCR產(chǎn)物Vpromoter經(jīng)EcoRI和SmaI酶切后，Vplcds經(jīng)EcoRV和 SacI酶切后連接到pBluescript SK+/-，測序；B、載體構(gòu)建以pBML-PMI載體為基礎(chǔ)，Vpromoter和Vplcds經(jīng)酶切后，與pBML-PMI質(zhì)粒連接，構(gòu)建成pBML-PMI-Vp 1表達載體；所述的引物 VpromoterF :ACAGAATTCGGCGCGCCGTCGACACCATATTTAAGAAC ； 所述的引物 VpromoterR GCTCCCGGGCAGAGAGGCACGACGACAAA ； 所述的引物 VgCF CTGGATATCTCTCCTCCCTTTGTCGTCGT ； 所述的引物 VgCR TTCGAGCTCTGCTCTTTCAGATGCTCACCG
2.權(quán)利要求1所述的一種Viviparous1基因及其啟動子在小麥穗發(fā)芽抗性育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Viviparous1基因及其啟動子表達載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，其步驟A、目的基因及其啟動子的克隆合成引物VpromoterF、VpromoterR以玉米851213-1×HE124B基因組DNA為模板，擴增出目的基因Vp1的啟動子序列Vpromoter.剝離玉米胚，在含10μmABA MS培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物VgCF和VgCR，擴增出Vp1基因的編碼序列Vp1cds，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接到pBluescript SK+/-，測序；B、載體構(gòu)建以pBML-PMI載體為基礎(chǔ)，Vpromoter和Vp1cds經(jīng)酶切后，與pBML-PMI質(zhì)粒連接，構(gòu)建成pBML-PMI-Vp1表達載體。C、Viviparous 1基因及其啟動子在小麥穗發(fā)芽抗性育種中的應(yīng)用。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化小麥愈傷，獲得轉(zhuǎn)基因小麥。提高了ABA信號傳遞的敏感性，增強了小麥種子的休眠性，獲得的轉(zhuǎn)基因陽性材料穗發(fā)芽抗性顯著提高。
文檔編號A01H5/00GK102321657SQ20111026778
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者廖玉才, 李和平, 瞿波, 黃濤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)