專利名稱：荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食用菌菌絲體工廠化發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
荷葉離裙傘Lyophyllum decastes (Fr. ) Singer是一種珍稀野生食用菌,分布在甘肅祁連山國家級自然保護區(qū)海拔2300-3200m的金露梅potenlilla fruticosa灌木叢和青海云杉林地中；經(jīng)測定，荷葉離褶傘菌絲體中必需氨基酸是氨基酸總量的35.3%，高于香菇和金針菇(參見菌物學報，席亞麗等2010);化學評分為73. 4，高于子實體和金針菇；氨基酸比值系數(shù)分分別是荷葉離褶傘子實體、香菇和金針菇的I. 18、I. 59、和I. 23倍，說明菌絲體中蛋白質(zhì)的均衡性優(yōu)于子實體、金針菇和香菇，營養(yǎng)價值比子實體高，極具生產(chǎn)和食用價值。如何規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)荷葉離褶傘菌絲體，開發(fā)荷葉離褶傘菌絲體，是一項急迫而有價值的工作。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述，本發(fā)明的目的是提供一種荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵工藝，既在中試條件下生產(chǎn)荷葉離褶傘菌絲體，為工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。對培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，對發(fā)酵周期進行了測定。本發(fā)明的目的是通過以下措施來達到一種荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵工藝，其步驟是a.供試菌種荷葉離褶傘菌種由河西學院食用菌研究所提供，菌種保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，菌種保藏號CGMCC No. 1518，菌株號ZY48-1，專利號ZL200510096405. Ob.液體菌種培養(yǎng)基的制備將玉米面加水調(diào)制成懸液，加入O. 1%淀粉酶，于70°C水浴鍋中酶解5h ;大豆先用水浸泡24h，用豆?jié){機打漿，加入O. 1%蛋白酶，于55°C水浴鍋中酶解5h ;麩皮加水調(diào)制成懸液，加入O. 1%蛋白酶，于55°C水浴鍋中水解5h，然后用300目篩過濾，濾液中加入白糖，力口水定容；C.液體菌種培養(yǎng)將供試試管菌種置于22°C恒溫箱內(nèi)活化24h，接入100mL/250mL三角瓶中，置于22°C、轉(zhuǎn)速120r/min的恒溫搖床上，連續(xù)培養(yǎng)7d，將該菌種接入20L液體菌種培養(yǎng)罐中，接種量10%，恒溫22°C、通氣量20L/h，連續(xù)培養(yǎng)7d獲得液體菌種；d.荷葉離褶傘菌絲生產(chǎn)將上述玉米面、大豆、麩皮的水解過濾液加入200L發(fā)酵罐，加水定容至150L，然后加入ZnS04、MgSO4, KH2PO4和PPE聚醚消泡劑，121°C滅菌lh，冷卻至25°C，接入10%的液體菌種，攪拌，轉(zhuǎn)速為160r/min、罐壓O. 2MPa、通氣量80L/h、pH 6. 5、溫度20°C的培養(yǎng)條件，連續(xù)培養(yǎng)，于接菌后第2天開始，每天測定菌絲體菌絲體生物量(g/L)和胞外多糖產(chǎn)量(g/L)，直第8d。本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有效效果是菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)所需原料以農(nóng)產(chǎn)品玉米和大豆為主，具有來源廣泛，價格低廉，取材容易，安全可靠之優(yōu)點；發(fā)酵條件易于滿足；發(fā)酵技術(shù)易于掌握；本工藝使空氣攪拌和機械攪拌相結(jié)合，使用的菌種和本發(fā)明技術(shù)方案相結(jié)合；縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率；可滿足工廠化生產(chǎn)的需要。發(fā)酵至第8d菌絲體生物量可達10.578g/L，第9d胞外多糖產(chǎn)量可達 I. 212g/L。


圖I為本發(fā)明培養(yǎng)時間對荷葉離褶傘菌絲體生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響。
具體實施例方式本發(fā)明使用的儀器與試劑淀粉酶、中性蛋白酶(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；PPE聚醚消泡劑(杭州肯明精細化工有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號RE52CS-1);冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司，型號LGJ-18);恒溫搖床(上海智城分析儀器有限公司，型號ZHWY-200B) ;20L、200L發(fā)酵罐(北京中蕈農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司)。荷葉離褶傘菌絲體發(fā)酵條件優(yōu)化以荷葉離褶傘菌絲體搖瓶發(fā)酵條件(席亞麗等2011)為依據(jù)，在200L發(fā)酵罐中，加入150L液體菌種培養(yǎng)液，以轉(zhuǎn)速、罐壓、通氣量、初始pH值、溫度、接種量6個因素的不同水平，做均勻設(shè)計Ultl(IOe),組成10種發(fā)酵培養(yǎng)條件組合(見表I)。在不同發(fā)酵條件組合下連續(xù)培養(yǎng)，于第8d取樣，每次取樣3個重復，每個重復取樣量為500mL，用300目篩過濾，經(jīng)真空冷凍(_70°C 12h)干燥后稱重，得菌絲體生物量(g/L);濾液分別用4000r/min離心機離心IOmin,取上清液50mL,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至25mL以下,然后加水定容到25mL,加入等體積95%酒精，在2-4°C冰箱中保藏24h，之后離心(4000r/min) lOmin，將沉淀置于鼓風干燥箱中(35°C )烘干，稱重，得到胞外多糖產(chǎn)量(g/L)。表I.發(fā)酵條件優(yōu)化的均勻設(shè)計試驗方案及實驗結(jié)果因素 factors 結(jié)果 result試驗_:_
號 A轉(zhuǎn)速B罐壓(M C通氣DpH E溫度 F接種量(％)胞外多糖含菌絲體產(chǎn)Pa) 量(L/h)值 (0C)量(g/L) 量(g/L)
1I CO)2 (0.3)3 (80)5 C8)7 (22)10 (10)1.29523.6908
22 (20)4 (0.2)6 (80)10 (8)3 (24)9 (5)0.43573.5823
33 (40)6 ￠0,4)9 (80)4 (7,5)10 (28)8 (8)1.07964.4170
44 (60)8 (0.3)I (40)9 (7.5)6 (20)7 (10)0.18892.3593
55 (80)10 (0.3)4 (40)3 C7)2 ￠22)6 (5)0.20524.4291
66 (100)I (0.2)7 (40)8 (7)9 (26)5 (8)0.75595.4450
77 (120)3 (0.4)10 (60)2 ￠6.5)5 (28)4 (10)0.57404.7270
88 (140)5 (0.3)2 (60)7 (6.5)I (20)3 (5)0.94776.1278
99 (160)7 ￠0.2)5 (60)I (6)8 (24)2 (8)0.81628.0621
10I (180)9 (0.4)8 (60)6 ￠6)4 (26)I (10)1.09378.0011采用DPSv3. 01統(tǒng)計軟件對表I數(shù)據(jù)進行逐步回歸分析，得到菌絲體干重(Y)和各因素關(guān)系的方程Y = -5. 9429+0. 0222*Α+0· 1142*C_0. 1070*E+0. 6004*F經(jīng)檢驗，回歸方程顯著(P = O. 0203),復相關(guān)系數(shù)R = O. 9314,剩余標準差S =
O.9098, Durbin-Watson統(tǒng)計量d = I. 5998,結(jié)果表明不同水平pH值和罐壓對荷葉離裙傘菌絲體產(chǎn)量無顯著影響(P)O. 10)，以攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，罐壓O. 2MPa，通氣量80L/h，pH值6. 5，溫度20°C，接種量10%為培養(yǎng)條件，菌絲體生物量最高。但攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min時，菌絲細碎，發(fā)酵液粘稠，難過濾。在其他條件不變的情況下，轉(zhuǎn)速降至160r/min，過濾難度明顯降低，菌絲體生物量95%的置信區(qū)間為[8. 8259，12. 3923]，經(jīng)過最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)驗證，其菌絲體生物量為9. 5432g/L，在預測范圍內(nèi)，且均大于上述10組的測量值，故，此培養(yǎng)條件可作為工廠化發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件。荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速160r/min、罐壓 O. 2MPa、通氣量 80L/h、pH 6. 5、溫度 20°C、接種量 10%。荷葉離褶傘菌絲體培養(yǎng)基優(yōu)化以荷葉離褶傘菌絲體搖瓶培養(yǎng)研究得到的最適碳源、氮源、礦質(zhì)營養(yǎng)及最適培養(yǎng)基配方為優(yōu)化設(shè)計參考，以玉米面、大豆、白糖和麩皮為重點考察對象，利用DPS V12. 50高級版的試驗設(shè)計功能，以中心化偏差為均勻性度量指標，經(jīng)過計算機多次運行尋優(yōu)獲得4因素8水平的均勻設(shè)計方案(見表2)，組成8種培養(yǎng)基配方，玉米面、大豆和麩皮液體菌種培養(yǎng)基的制備方法見前所述。表2.培養(yǎng)基優(yōu)化的均勻設(shè)計試驗方案及實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵工藝，其步驟是 a.供試菌種 荷葉離褶傘菌種由河西學院食用菌研究所提供，菌種保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，菌種保藏號CGMCC No. 1518，菌株號ZY48-1，專利號ZL200510096405. O ； b.液體菌種培養(yǎng)基的制備 將玉米面加水調(diào)制成懸液，加入O. 1%淀粉酶，于70°C水浴鍋中酶解5h ;大豆先用水浸泡24h，用豆?jié){機打漿，加入O. 1%蛋白酶，于55°C水浴鍋中酶解5h;然后將玉米面、大豆混合液，過300目篩,加水定容； c.液體菌種培養(yǎng) 將供試試管菌種置于22°C恒溫箱內(nèi)活化24h，接入100mL/250mL三角瓶中，置于22°C、轉(zhuǎn)速120r/min的恒溫搖床上，連續(xù)培養(yǎng)7d，將該菌種接入20L液體菌種培養(yǎng)罐中，接種量10%,恒溫22°C、通氣量20L/h，連續(xù)培養(yǎng)7d獲得液體菌種； d.荷葉離褶傘菌絲生產(chǎn) 將b步驟玉米面、大豆、麩皮的水解過濾液加入200L發(fā)酵罐，加水定容至150L，然后加入ZnSO4, MgSO4, KH2PO4和PPE聚醚消泡劑，121°C滅菌lh，冷卻至25°C，接入10%的液體菌種，攪拌，轉(zhuǎn)速為160r/min、罐壓O. 2MPa、通氣量80L/h、pH 6. 5、溫度20°C的培養(yǎng)條件，連續(xù)培養(yǎng)，于接菌后第2天開始，每天測定菌絲體菌絲體生物量(g/L)和胞外多糖產(chǎn)量(g/L)，直第8d。
全文摘要
本發(fā)明公開一種荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵工藝。在荷葉離褶傘菌絲體搖瓶發(fā)酵條件研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計，在200L發(fā)酵罐中，對荷葉離褶傘菌絲體中試發(fā)酵條件與培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化研究，結(jié)果表明荷葉離褶傘中試發(fā)酵的最佳條件為攪拌轉(zhuǎn)速160r/min、罐壓0.2MPa、通氣量80L/h、pH 6.5、溫度20℃、接種量10％；最佳培養(yǎng)基配方為玉米面5％、大豆0.5％、；麩皮5％、0.025％ZnSO4、0.05％MgSO4、0.05％KH2PO4。發(fā)酵至第8d菌絲體生物量達到10.578g/L，第9d胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)產(chǎn)量1.212g/L。
文檔編號C05G3/00GK102907252SQ20111022520
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者魏生龍 申請人:魏生龍