專利名稱：一種千層塔原葉體誘導和增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種千層塔原葉體誘導和增殖方法。
背景技術(shù)：
千層塔為石杉科(Huperziaceae)石杉屬(Miperzia Bernh.)植物蛇足石杉 (Muperzia serrata (Thunb. )Trevis)的全草，異名虱子草、矮杉樹、虱婆藥。千層塔始載于《植物名實圖考》，性味辛、苦、平。具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效。1972年我國科技工作者報道了從該植物中分離的石杉堿甲具有橫紋肌松弛作用，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)石杉堿甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑。由于千層塔所具有的顯著醫(yī)療作用和潛在的市場效益，其野生資源迅速減少。世界各國同行從不同的角度對這一重要藥用植物資源進行研究。自然環(huán)境中千層塔生活史包括兩種繁殖方式，一種是通過孢子進行繁殖。孢子萌發(fā)后屬地下生配子體，需6 15年才能成熟。成熟的配子體即塊狀體，其上產(chǎn)生精子器和卵子器。在水環(huán)境中，卵子和精子結(jié)合形成胚，再發(fā)育成孢子體。孢子體是千層塔作為藥用植物的原植物形式。孢子體的根生于莖的基部，為不定根。不定根和真菌共生，其真菌的菌絲侵入根的皮層細胞間隙中，而不侵入細胞內(nèi)，為外生菌根。共生真菌的菌絲起到了根毛的功能，增加根系的吸收面積。自然界中千層塔的另一種繁殖方式是芽孢繁殖，但這種方式在野外極少發(fā)現(xiàn)。因此，千層塔野生資源的再生受到了極大限制。利用植物組織培養(yǎng)可進行珍稀和瀕危藥用植物的微繁殖，建立高效和穩(wěn)定培養(yǎng)系，培育出脫毒的優(yōu)質(zhì)品種，解決珍稀瀕危藥用植物人工種植存在的種子稀少、種苗奇缺、 種質(zhì)退化等嚴重問題，保存野生藥用植物資源和基因多樣性，為藥用植物的可持續(xù)利用提供技術(shù)手段。但是，千層塔組織培養(yǎng)過程主要采用的是根、莖、葉。這些外植體存在外植體滅菌困難、無菌外植體獲得率低，外植體接種后污染和褐化現(xiàn)象嚴重，不能生長、分化和增殖等問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種千層塔原葉體誘導和增殖方法，該方法以孢子囊或孢子作為外植體，進行離體組織培養(yǎng)，為千層塔的快速繁殖建立技術(shù)基礎(chǔ)。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種千層塔原葉體誘導和增殖方法，其特征在于，具體按以下步驟操作
(1)外植體的選擇
從野外采集蛇足石杉的孢子囊，經(jīng)自來水沖洗干凈；
(2)外植體的表面滅菌將洗干凈的孢子囊在超凈工作臺中先浸在質(zhì)量分數(shù)為70%的乙醇溶液中30iT60S ；接著置于濃度0. 1%的HgCl2溶液中浸泡5mirT8min，再用無菌水沖洗3_5次，將孢子囊或者孢子囊破裂后從中散出的孢子作為千層塔原葉體誘導的外植體；
(3)原葉體的誘導培養(yǎng)
將得到的外植體接種在原葉體誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為22士2°C、光照時間12/ (Tl6/d、光照強度為300 Lf2000 Lx條件下培養(yǎng)10-12周，從外植體上長出綠色的原葉體組織；
(4)原葉體的增殖
將步驟(3)中獲得的原葉體組織切割成0. 2cnT0. 5cm2的小片，然后轉(zhuǎn)入原葉體增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與步驟(3)中相同，培養(yǎng)6周后，獲得大量的新增殖的原葉體。所述原葉體誘導培養(yǎng)基組成為在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入3-吲哚丁酸0. 2mg/ L 2mg/L。所述原葉體增殖培養(yǎng)基組成為在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入2，4_ 二氯苯氧乙酸 0. 2mg/L^lmg/L,以及 6-芐氨基嘌呤 0. 5mg/L^2mg/L。采用本發(fā)明的千層塔原葉體誘導和增殖的方法，帶來的技術(shù)效果體現(xiàn)在以下幾方面
1、選取千層塔\_Huperzia serrata (Thunb. )Trev.]的孢子囊或孢子作為外植體，由于孢子囊或孢子與根、莖或葉片相對比，對外植體除菌較容易，因此，很容易建立千層塔的無菌組織培養(yǎng)體系，從而避免了外植體滅菌困難、無菌外植體獲得率低，外植體接種后污染和褐化現(xiàn)象嚴重的問題。2、通過對孢子囊或孢子培養(yǎng)，比較容易獲得原葉體，原葉體在人工培養(yǎng)基上很容易實現(xiàn)增殖，從而克服了傳統(tǒng)千層塔組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的外植體不能生長、分化和增殖等問題。3、通過控制光照強度很容易控制原葉體的增殖倍數(shù)，為通過原葉體進行千層塔大規(guī)模繁殖建立重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
具體實施例方式以下通過發(fā)明人給出的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例1
(1)外植體的選擇
從野外采集千層塔serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子囊，經(jīng)自來水沖洗干
凈；
(2)外植體的表面滅菌
將洗干凈的孢子囊在超凈工作臺中先浸在質(zhì)量分數(shù)70%的乙醇溶液中30-60s ；接著置于質(zhì)量濃度0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min，再用無菌水沖洗3_5次，作為千層塔原葉體誘導的外植體；
(3)原葉體的誘導培養(yǎng)
將所述外植體接種在原葉體誘導培養(yǎng)基上，原葉體誘導培養(yǎng)基組成為在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入3-吲哚丁酸O.ang/廣ang/L。在培養(yǎng)溫度為22士2°C、光照強度為300 Lx、光照時間12/d -16/d條件下進行培養(yǎng)10-12周，從外植體上長出綠色的原葉體組織，原葉體的誘導頻率為70% ；
(4)原葉體的增殖
將步驟(3)中獲得的原葉體組織切割成0. 2-0. 5cm2的小片，然后轉(zhuǎn)入原葉體增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，原葉體增殖培養(yǎng)基組成為在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入2，4_ 二氯苯氧乙酸 0. 2mg/L^lmg/L和6-芐氨基嘌呤0. 5mg/L 2 mg/L。培養(yǎng)條件與步驟(3)中相同。培養(yǎng)6周后，可獲得大量的新增殖的原葉體，增殖倍數(shù)平均為3. 5倍。實施例2:
(1)外植體的選擇
從野外采集千層塔D^perzia serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子囊，經(jīng)自來水沖洗干
凈；
(2)外植體的表面殺菌
將洗干凈的孢子囊在超凈工作臺中先浸在質(zhì)量分數(shù)70%的乙醇溶液中30-60s ；接著置于質(zhì)量濃度0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min，再用無菌水沖洗3_5次，作為千層塔原葉體誘導的外植體；
(3)原葉體的誘導培養(yǎng)
將外植體接種在原葉體誘導培養(yǎng)基上(原葉體誘導培養(yǎng)基的組成與實施例1相同)，培養(yǎng)溫度為22士2°C、光照強度為1500 Lx、光照時間12/cTl6/d條件下進行培養(yǎng)10-12周，從外植體上長出綠色的原葉體組織，原葉體的誘導頻率為15% ；
(4)原葉體的增殖
將步驟(3)中獲得的原葉體組織切割成0. 2-0. 5cm2的小片，然后轉(zhuǎn)入原葉體增殖培養(yǎng)基上(原葉體增殖培養(yǎng)基的組成與實施例1相同)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與步驟(3)中相同。培養(yǎng)6周后，可獲得大量的新增殖的原葉體，增殖倍數(shù)平均為5倍。實施例3:
(1)外植體的選擇
從野外采集千層塔D^perzia serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子囊，經(jīng)自來水沖洗干
凈；
(2)外植體的表面殺菌
將洗干凈的孢子囊在超凈工作臺中先浸在質(zhì)量分數(shù)70%的乙醇溶液中30-60s ；接著置于質(zhì)量濃度0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min，再用無菌水沖洗3_5次。將滅過菌的孢子囊擠壓，使孢子從孢子囊中散出，然后采用離心的方法收集孢子， 作為千層塔原葉體誘導的外植體；
(3)原葉體的誘導培養(yǎng)
取步驟(2)中的孢子，先用常規(guī)的MS液體培養(yǎng)基將孢子稀釋成100個/ml懸液，將Iml 孢子懸液均勻接種于原葉體誘導培養(yǎng)基上(原葉體誘導培養(yǎng)基的組成與實施例1相同)，在培養(yǎng)溫度為22士2°C、光照強度為1500 Lx、光照時間12/d _16/d條件下進行培養(yǎng)10-12周， 從外植體上長出綠色的原葉體組織，原葉體的誘導頻率為10% ；
(4)原葉體的增殖
將步驟(3)獲得的原葉體組織切割成0. 2cm2-0. 5cm2的小片，然后轉(zhuǎn)入原葉體增殖的MS培養(yǎng)基上(原葉體增殖培養(yǎng)基的組成與實施例1相同)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與步驟(3)中相同。培養(yǎng)6周后，可獲得大量的新增殖的原葉體，增殖倍數(shù)平均為5倍。
權(quán)利要求
1.一種千層塔原葉體誘導和增殖方法，其特征在于，按以下步驟進行(1)外植體的選擇從野外采集蛇足石杉的孢子囊，經(jīng)自來水沖洗干凈；(2)外植體的表面滅菌將洗干凈的孢子囊在超凈工作臺中先浸在質(zhì)量分數(shù)為70%的乙醇溶液中30iT60S ；接著置于濃度0. 1%的HgCl2溶液中浸泡5min、min，再用無菌水沖洗3_5次，將孢子囊或者孢子囊破裂后從中散出的孢子作為千層塔原葉體誘導的外植體；(3)原葉體的誘導培養(yǎng)將得到的外植體接種在原葉體誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為22士2°C、光照時間12/ (Tl6/d、光照強度為300 Lf2000 Lx條件下培養(yǎng)10-12周，從外植體上長出綠色的原葉體組織；(4)原葉體的增殖將步驟(3)中獲得的原葉體組織切割成0. 2cnT0. 5cm2的小片，然后轉(zhuǎn)入原葉體增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與步驟(3)中相同，培養(yǎng)6周后，獲得大量的新增殖的原葉體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的原葉體誘導培養(yǎng)基組成為在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入3-吲哚丁酸0. 2mg/L^2mg/L0
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的原葉體增殖培養(yǎng)基組成為在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入2，4- 二氯苯氧乙酸0. 2mg/L^lmg/L和6-芐氨基嘌呤0. 5mg/ L 2 mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種千層塔原葉體誘導和增殖方法。該方法以孢子囊或孢子作為外植體，進行離體組織培養(yǎng)，并建立了千層塔原葉體的誘導體系，原葉體的誘導頻率達到15%，在人工調(diào)控下，對原葉體進行增殖培養(yǎng)，月增殖倍數(shù)達到5倍。方法簡單易行，效率高，為千層塔的人工快速繁殖建立重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK102283129SQ20111020674
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者包日雙, 尉亞輝, 徐玲玲, 郭斌 申請人:西北大學