專利名稱：甘草快繁苗培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘草快繁苗組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
甘草為豆科植物甘草(Glycyrrhizauralens Fisch.)、脹果甘草(G. inflata Bat)、光果甘草(G.glabraL.)的干燥根及根莖?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草具有抗?jié)?、抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用，是最常用的中藥之一，歷來就有“十方九草”之說，除藥用價值外，甘草在食品、飲料、卷煙、化妝品等方面廣泛應(yīng)用。近年來，由于人們破壞性地對野生甘草采挖，使我國甘草資源遭到了嚴重破壞，為此國家對野生群叢進行保護，大力提倡人工種植甘草。但是由于甘草種子質(zhì)地堅硬。種皮厚實，具有硬實性，阻礙了水分的吸收，種子在自然狀態(tài)下播種，要埋在土里3 5年才能出芽，因此在播種前需進行人工處理。但甘草種子的野性很強，成苗率很低，在栽培條件很好的情況下，100粒有發(fā)芽率的種籽只有 15 20粒能長成苗，有75 80粒要死掉，也就是說100噸種籽只有150 20噸能長成苗，這就導致數(shù)十年來家種甘草只漲不落的原因，也凸顯甘草種子的珍貴性，提高甘草種子的成苗率是未來甘草大田大面積栽培的關(guān)鍵技術(shù)之一。本方法利用甘草無菌苗對其快繁， 來真正的解決這一難題。但目前對甘草的快繁苗的研究還較少，本方法也為甘草快繁苗培養(yǎng)及其工廠化育苗提供科學依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種甘草快繁苗培養(yǎng)的方法。經(jīng)過甘草無菌種子發(fā)芽培養(yǎng)、甘草無菌苗培養(yǎng)、甘草快繁苗的誘導和未生根的快繁苗生根培養(yǎng)等步驟，在含有蔗糖的 MS固體培養(yǎng)基上無菌、25士 1°C培養(yǎng)，其中快繁苗誘導和快繁苗生根的培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑，MS固體培養(yǎng)滅菌前PH調(diào)為5. 9 6. 0。該方法快速可行，可以提供長勢良好的甘草苗。工藝簡單，成本低廉，重復性好。本發(fā)明提供的一種甘草快繁苗組織培養(yǎng)的方法包括的步驟1)甘草無菌種子發(fā)芽培養(yǎng)將甘草種子用自來水沖洗干凈，并浸泡3小時，于超凈工作臺中用75%乙醇浸泡10s，無菌水沖洗2 3遍，再用4% Natno溶液浸泡15min，最后用無菌水沖洗3 4次；把消過毒的甘草種子接種于固體培養(yǎng)基上，25士 1°C及避光條件下 3 4天發(fā)芽培養(yǎng)。所述的固體培養(yǎng)基為含有0. 8%瓊脂、20 30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前PH調(diào)為5. 9 6. 0。2)甘草無菌苗培養(yǎng)將帶芽種子接種于固體培養(yǎng)基上，在無菌、25士 1°C及光照條件下培養(yǎng)4-5周，苗高7 9cm，即可作為外植體材料。光照條件光照16h · d—1，光照強度 2500 30001x。所述的固體培養(yǎng)基為含有20 30g/L蔗糖和0. 8%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前PH調(diào)為5. 9 6. 0。3)甘草快繁苗的誘導將外植體切段(無菌苗的胚軸、帶芽莖段)接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無菌、25士 1°C及光照條件(光照16h · cf1，光照強度2500 30001x)下培養(yǎng)4 6周，多數(shù)外植體即可形成完整的快繁苗；所述的MS固體培養(yǎng)基含有1. 0 2. Omg/ L6-BA (植物生長調(diào)節(jié)劑)、0. 1 0. 5mg/L NAA (植物生長調(diào)節(jié)劑)、20 30g/L蔗糖、0. 05 % 活性炭，滅菌前pH調(diào)為5. 9 6. 0。4)未生根的快繁苗生根培養(yǎng)將已形成的快繁苗接種到準備好的固體培養(yǎng)基上，加入植物生長調(diào)節(jié)劑，在無菌、25士 1°C及光照條件(光照16h · cf1，光照強度2500 30001x)下培養(yǎng)2周左右，即可獲得完整的組培快繁苗。所述的固體培養(yǎng)基為含有0. 5 0. 75mg/L NAA(植物生長調(diào)節(jié)劑)、20 30g/L蔗糖、0. 05%活性炭的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前pH調(diào)為5. 9 6. 0。本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)甘草快繁苗，比培養(yǎng)細胞、毛狀根培養(yǎng)更具有實際意義，其生長速率快，繁殖倍數(shù)高達6倍。并且其苗木生長穩(wěn)定，同時又不受天災等自然環(huán)境的影響。本發(fā)明具有工藝過程簡單，誘導率高，重復性好，快繁苗增值倍數(shù)高等特點。


圖1是本發(fā)明培養(yǎng)的甘草快繁苗圖。
具體實施例方式實例1 一、用lmol/L的HCl和NaOH溶液，將IOOmL MS附加20g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 5.9，在1211、0.110^的壓力下滅菌15分鐘備用；將甘草種子(由北京時珍中藥研究所提供)用自來水沖洗干凈浸泡3小時，于超凈工作臺中用75%乙醇浸泡IOs后，用無菌水沖洗2 3遍，再用4% NaClO溶液浸泡15min，最后用無菌水沖洗3 4次，備用。之后用滅過菌的鑷子將種子接到事先準備好的培養(yǎng)基中，在無菌、25 士 1°C及避光條件下培養(yǎng)以誘導發(fā)芽，培養(yǎng)2天后肉眼可見芽的形成，3、4天后芽長0. 5cm左右。用lmol/L的HCl和 NaOH溶液，將裝在250mL三角瓶中的70mL MS附加20g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 5. 9， 在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用。二、將發(fā)芽較好的種子，用事先滅菌的鑷子接種于準備好的培養(yǎng)基(見步驟一) 中，在無菌、25 士 1°C，光照16h · cf1，光照強度2500 30001x，培養(yǎng)4周得到甘草無菌苗。 用lmol/L的HCl和NaOH溶液，將裝在IOOmL三角瓶中的50mL MS附加20g/L蔗糖、2. Omg/ L6-BA、0. 5mg/L ΝΑΑ、0· 05%活性炭的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 5. 9，在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用。三、取生長良好的無菌苗，用事先滅菌的解剖刀和鑷子在無菌的平皿中切無菌苗， 取其胚軸和帶芽莖段，長度為Icm左右，接種于準備好的培養(yǎng)基(見步驟二)上，在無菌、 25士 1°C，光照16h · cT1，光照強度2500 30001x，培養(yǎng)40天得到甘草快繁苗，由胚軸生成的苗95%左右可以直接生根，帶芽莖段可達70%左右。用lmol/L的HCl和NaOH溶液，將裝在250mL三角瓶中的IOOmL MS附加20g/L蔗糖、0. 75mg/L NAA的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 5. 9， 在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用；四、對于未生根的快繁苗，用事先滅菌的解剖刀和鑷子挑出，接種于事先準備好的培養(yǎng)基(見步驟三)中，無菌、25 士 1°C，光照leh.cT1，光照強度2500 30001X條件下培養(yǎng)，一般IOd后肉眼可以看到有根從莖基部生出，兩周后根系長到Icm左右，30d后，根系可以長到2 3cm，根粗壯，側(cè)根發(fā)達(如圖1)。生根率可達90%以上。直接生根的快繁苗及誘導生根的快繁苗均可馴化移栽。實例2:一、用lmol/L的HCl和NaOH溶液，將IOOmL MS附加30g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 6.0，在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用；將甘草種子(購自北京時珍中藥研究所)用自來水沖洗干凈浸泡3小時，于超凈工作臺中將浸泡后的種子用75%的乙醇浸泡10s，用無菌水沖洗2 3遍，再用4% Natno溶液浸泡15min，最后用無菌水沖洗3 4 次，備用。用滅過菌的鑷子將種子接到MS固體培養(yǎng)基中，在無菌、25士 1°C及避光條件下培養(yǎng)，誘導發(fā)芽，培養(yǎng)2后肉眼可見芽的形成，3、4天后芽長0. 5cm左右。用lmol/L的HCl和 NaOH溶液，將裝在250mL三角瓶中的70mL MS附加30g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 6. 0， 在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用。二、將發(fā)芽較好的種子，用滅菌的鑷子接種于準備好的培養(yǎng)基(見步驟一)中，在無菌、25士 TC，光照16h · cf1，光照強度2500 30001x，培養(yǎng)4周即得到甘草無菌苗。用 lmol/L的HCl和NaOH溶液，將裝在IOOmL三角瓶中的50mL MS附加30g/L蔗糖、1. Omg/ L6-BA、0. lmg/L ΝΑΑ、0· 05%的活性炭的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH 6. 0。在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用。三、選擇生長良好的無菌苗，用事先滅菌的解剖刀和鑷子在無菌的平皿中切無菌苗，取其胚軸和帶芽莖段，長度為Icm左右，接種于準備好的培養(yǎng)基(見步驟二)上，在無菌、25士 1°C，光照IMi .(Γ1，光照強度2500 30001χ，培養(yǎng)40天得到甘草快繁苗，由胚軸生成的苗95%左右可以直接生根，帶芽莖段可達70%左右。用lmol/L的HCl和NaOH溶液，將裝在250mL三角瓶中的IOOmL MS附加0. 5mg/L NAA、30g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基調(diào)至pH6. 0， 在121°C、0. IMPa的壓力下滅菌15分鐘備用。四、選取未生根的快繁苗，用事先滅菌的解剖刀和鑷子挑出，接種于事先準備好的培養(yǎng)基(見步驟三)中，無菌25 士 TC，光照leh.cT1，光照強度2500 30001X條件下培養(yǎng)，一般IOd后肉眼可以看到有根從莖基部生出，兩周后根系長到Icm左右，30d后，根系可以長到2 3cm，根粗壯，側(cè)根發(fā)達。生根率可達90%以上。直接生根的快繁苗及誘導生根的快繁苗均可馴化移栽。
權(quán)利要求
1.一種甘草快繁苗的組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括的步驟1)甘草無菌種子發(fā)芽培養(yǎng)將甘草種子用自來水沖洗干凈，并浸泡3小時，于超凈工作臺中用75%乙醇浸泡10s，無菌水沖洗2 3遍，再用4% Natno溶液浸泡15min，最后用無菌水沖洗3 4次；把消過毒的甘草種子接種于固體培養(yǎng)基上，25士 1°C及避光條件下3 4天發(fā)芽培養(yǎng)；本步驟中所述的固體培養(yǎng)基為含有0. 8%瓊脂、20 30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前PH調(diào)為5. 9 6. 0 ；2)甘草無菌苗培養(yǎng)將帶芽種子接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無菌、25士1°C及光照條件下培養(yǎng)4-5周；本步驟中所述的MS固體培養(yǎng)基為含有20 30g/L蔗糖和0. 8%瓊脂的MS 固體培養(yǎng)基，滅菌前pH調(diào)為5. 9 6. 0 ；3)甘草快繁苗的誘導將外植體切段接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無菌、25士1°C及光照條件下培養(yǎng)4 6周；本步驟中所述的MS固體培養(yǎng)基含有1. 0 2. 0mg/L6-BA、0. 1 0. 5mg/LNAA、20 30g/L蔗糖、0. 05%活性炭，滅菌前pH調(diào)為5. 9 6. 0 ；4)未生根的快繁苗生根培養(yǎng)將已形成的快繁苗接種到固體培養(yǎng)基上，在無菌、 25士 1°C及光照條件下培養(yǎng)2周左右，即可獲得完整的組培快繁苗；本步驟中所述的固體培養(yǎng)基為含有0. 5 0. 75mg/L NAA,20 30g/L蔗糖、0. 05%活性炭的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前pH調(diào)為5. 9 6. 0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的光照條件為光照1 · cf1，光照強度 2500 30001x。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘草快繁苗組織培養(yǎng)方法。它經(jīng)過甘草無菌種子發(fā)芽培養(yǎng)、甘草無菌苗培養(yǎng)、甘草快繁苗的誘導和未生根的快繁苗生根培養(yǎng)步驟，在含有20～30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上無菌、25±1℃培養(yǎng)，其中快繁苗誘導和快繁苗生根的培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑，所述的MS固體培養(yǎng)滅菌前pH調(diào)為5.9～6.0；本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)甘草快繁苗，比培養(yǎng)細胞、毛狀根培養(yǎng)更具有實際意義，其生長速率快，繁殖倍數(shù)高達6倍。并且其苗木生長穩(wěn)定，同時又不受天災等自然環(huán)境的影響，并具有工藝過程簡單，誘導率高，重復性好，快繁苗增值倍數(shù)高等特點。
文檔編號A01H4/00GK102499072SQ20111012894
公開日2012年6月20日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者呂連媛, 左北梅, 張黎明, 王娟, 高文遠 申請人:天津大學