專利名稱：大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，確切地是大豆品質(zhì)改良表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor)和凝集素(agglutinin)是大豆(Glycine max)主要營(yíng)養(yǎng)抑制因子(nutritional inhibitors)，極大地影響著大豆制品的質(zhì)量和新產(chǎn)品的開發(fā)。胰蛋白酶抑制劑是大豆蛋白質(zhì)中最重要的一類抗?fàn)I養(yǎng)因子。大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean Trypsin Inhibitors, STI)主要存在于大豆籽實(shí)中，占大豆籽實(shí)蛋白質(zhì)總量的6% 8%。STI主要分為Kunitz類抑制劑(KTI)和Bowman-Birk類抑制劑(BBI)兩類。其中KTi型大豆胰蛋白酶抑制劑起主要的抗?fàn)I養(yǎng)作用，含量為1.4%左右，表達(dá)形式為 21. 5kDa的蛋白質(zhì)，對(duì)胰蛋白酶有專一的抑制性；BBi含量為0. 6%左右，分子量為SkD(單子葉植物或雙子葉植物)或16kD(單子葉植物)，同時(shí)對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在獨(dú)立的反應(yīng)部位產(chǎn)生抑制。KTi家族由多基因編碼，在大豆的基因組中至少存在10個(gè)不同的KTi 基因，其中KTil、KTi2、ΚΤ 3為主要基因，在胚形成時(shí)期和成熟植株中表達(dá)，這三種基因在大豆生活周期中是差異表達(dá)的，其中，KTi3編碼大豆種子主要的胰蛋白酶抑制劑，在幼胚及種子中高水平的表達(dá)。生大豆抗?fàn)I養(yǎng)作用的40%是由胰蛋白酶抑制劑引起的。目前，大豆胰蛋白酶抑制劑抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質(zhì)消化吸收和造成胰腺腫大兩個(gè)方面。主要是胰蛋白酶抑制因子與小腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶結(jié)合，生成無(wú)活性復(fù)合物，消耗和降解胰蛋白酶，導(dǎo)致腸道對(duì)蛋白質(zhì)消化、吸收及利用能力下降。同時(shí)，胰蛋白酶抑制劑與腸內(nèi)胰蛋白酶結(jié)合后隨糞便排出體外，使腸內(nèi)胰蛋白酶數(shù)量減少。小腸中的胰蛋白酶、糜蛋白酶的濃度和活性都降低，負(fù)反饋性引起促胰液素-膽囊收縮素(CCK)分泌增加，刺激胰腺泡細(xì)胞分泌功能加強(qiáng)，分泌更多的酶進(jìn)入腸道，以抵消胰蛋白酶抑制劑對(duì)消化酶的失活作用，結(jié)果造成胰腺細(xì)胞肥大和增生。大豆凝集素(Soybean Agglutinin, SBA)也是大豆的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。SBA是指大豆中能與N-乙酰基-葡萄糖胺或半乳糖特異性結(jié)合的糖蛋白，具有典型的豆類凝集素四級(jí)結(jié)構(gòu)，由等量的兩種略有不同的四個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基分子量約30KDa，故而大豆凝集素的分子量約120kDa。1974年，Lotan等測(cè)定了大豆凝集素的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)大豆凝集素中富含酸性和羥基氨基酸，大豆凝集素亞基完整的基因序列已經(jīng)被測(cè)出(其基因庫(kù)查詢號(hào)碼為AY342213)。SBA在成熟的種子中其含量高達(dá)蛋白質(zhì)總量的10%左右，屬于熱敏感性抗?fàn)I養(yǎng)因子，但在加熱處理后，其殘存量仍然很大，在大豆粕(餅)、帶(去)皮大豆和大豆油等飼料原料中仍含有一定量的大豆凝集素。大豆凝集素抗?fàn)I養(yǎng)作用的關(guān)鍵在于它能與動(dòng)物的小腸特異性結(jié)合，這種結(jié)合導(dǎo)致①小腸正常的結(jié)構(gòu)被破壞，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用下降，動(dòng)物生長(zhǎng)受到抑制，并出現(xiàn)病理
4性腹瀉，同時(shí)導(dǎo)致腸細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化受到抑制；②SBA進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，繼而破壞消化器官 (胰腺)的正常結(jié)構(gòu)，引發(fā)全身性的反應(yīng)。SBA能破壞腸道上皮微絨毛即刷狀緣正常結(jié)構(gòu)， 并促進(jìn)腺窩細(xì)胞分裂。刷狀緣酶在粘膜消化過程中起著至關(guān)重要作用，它包括蔗糖酶、氨肽酶、堿性磷酸酶等重要酶類，這些酶是在腸細(xì)胞分化過程中合成，并能影響腸細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有著非常重要作用。然而，SBA引起刷狀緣正常結(jié)構(gòu)破壞， 直接導(dǎo)致刷狀緣活性降低，從而導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率下降，出現(xiàn)病理性腹瀉。SBA能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，是因?yàn)槠渑c小腸上皮細(xì)胞結(jié)合繼而被內(nèi)吞入上皮細(xì)胞后沒有被溶酶體酶徹底降解，最后經(jīng)胞吐作用經(jīng)吸收性細(xì)胞基底膜釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。SBA進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，可導(dǎo)致血漿胰島素水平迅速降低，使脂肪降解增加、合成減少，肌肉蛋白質(zhì)合成減少。此外，SBA可直接刺激小腸黏膜的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌CCK (膽囊收縮素)，而血漿 CCK水平的升高可導(dǎo)致動(dòng)物采食下降、內(nèi)分泌紊亂、生產(chǎn)性能降低等。降低胰蛋白酶抑制劑和凝集素活性的方法包括物理失活，化學(xué)失活和作物育種失活，這些方法也可以降低其活性，但增加了能源消耗，同時(shí)降低了大豆品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。所以，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)培育低胰蛋白酶抑制劑和凝集素含量的大豆品種，可有效提高大豆的加工品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是解決這一問題的一種簡(jiǎn)潔、有效的方法。以往在大豆的品質(zhì)改良及抗?fàn)I養(yǎng)抑制因子的研究中，多采用雜交、回交等方法，但由于受到遺傳基礎(chǔ)窄、育種時(shí)間長(zhǎng)的限制，改良作用有限。常規(guī)育種方法是首先利用高速而低耗的檢測(cè)手段對(duì)大量種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，篩選出大豆胰蛋白酶抑制因子低含量水平或者缺失的自然缺失體品種；或采用誘變技術(shù)產(chǎn)生所需的變異類型，再利用普遍回交或改良回交法等傳統(tǒng)方法培育出大豆胰蛋白酶抑制因子低含量水平或者缺失的品種。研究人員依據(jù)對(duì)KTi基因及其遺傳規(guī)律的研究與認(rèn)識(shí)，已經(jīng)通過上述手段獲得了低含量水平或者缺失大豆胰蛋白酶抑制因子的品種。80年代，研究人員將這些基因轉(zhuǎn)育到一些栽培品種中，如William82，Amsoy71等，這些品種產(chǎn)量與普通大豆相當(dāng)，而胰蛋白酶抑制劑活性降低了 50%。1990年美國(guó)已有了個(gè)以“庫(kù)尼茲”命名的titi 型商用大豆品種，同時(shí)日本巖手大學(xué)等也進(jìn)行了大豆titi基因的轉(zhuǎn)育。目前，國(guó)內(nèi)還選育出了 KTi和脂肪氧化酶雙缺失的大豆新品種中黃16，但是它們的血緣均源自美國(guó)缺失KTi 的大豆品種。因此，迄今為止，我國(guó)還沒有自己獨(dú)立創(chuàng)制的不含胰蛋白酶抑制因子的大豆品種。近年來(lái)，國(guó)外直接利用不含凝集素和Kimitz型胰蛋白酶抑制劑的大豆粉飼喂畜禽(牛、 雞)收到了良好效果。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA引起的序列特異性基因沉默，主要是通過siRNA介導(dǎo)的靶mRNA降解，調(diào)節(jié)或關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)，是由dsRNA分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)或使其沉默的過程，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGQ。RNAi現(xiàn)象普遍存在于植物、動(dòng)物和人類中，現(xiàn)在RNA干擾已發(fā)展成為一種強(qiáng)大的“基因沉默”技術(shù)，并且廣泛應(yīng)用于各種生物的基因功能鑒定和功能基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。植物中利用RNAi技術(shù)的關(guān)鍵因素在于需要構(gòu)建可轉(zhuǎn)錄為hpRNA或dsRNA的植物表達(dá)載體。研究表明在強(qiáng)啟動(dòng)子下游插入反向重復(fù)片段的重組載體是導(dǎo)致RNA沉默的基本結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)中，在間隔序列(spacer) 的兩端是目標(biāo)基因的cDNA片段的克隆，這些片段的頭頭相連或尾尾相連導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生自我互補(bǔ)的hpRNA(分子內(nèi)dsRNA)結(jié)構(gòu)，同時(shí)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、目的片段的大小和內(nèi)含子的
5有無(wú)等也會(huì)影響RNA沉默的效率。人們用不同的啟動(dòng)子分別構(gòu)建了兩種植物表達(dá)載體，結(jié)果用CaMV35S啟動(dòng)子所構(gòu)建的載體獲得轉(zhuǎn)基因植株的效率比采用NOS啟動(dòng)子所構(gòu)建的載體的效率高得多，這說明啟動(dòng)子功能的強(qiáng)弱對(duì)于RNAi干擾效果的影響較為明顯。研究還發(fā)現(xiàn)較短的目的片段效率較低，較長(zhǎng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)在寄主細(xì)菌中容易重組。因此我們分離胰蛋白酶抑制劑KTi基因和凝集素SBA基因的兩個(gè)核心保守片段， 構(gòu)建雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，通過RNA干擾的定向表達(dá)，抑制KTi和SBA基因，降低他們的含量， 為大豆胰蛋白酶抑制劑和凝集素的同時(shí)改良提供簡(jiǎn)潔的新技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有對(duì)胰蛋白酶抑制劑或凝集素的同時(shí)進(jìn)行抑制的研究。運(yùn)用 RNAi技術(shù)，進(jìn)行兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子的同時(shí)抑制，能夠改良大豆種質(zhì)，生產(chǎn)出更加利于吸收和畜牧業(yè)利用的大豆新種質(zhì)，獲得更大的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體。一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體是在pCAMBIA3301 的EcoR I和)(ba I中，插入大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P，在)(ba I和I^st I酶切位點(diǎn)中，插入了大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA反義連接片段SBAF-KTiF，在I^st I和Bgl II 酶切位點(diǎn)中，插入了綠色熒光蛋白GFP基因片段，在Bgl II和BstE II中插入了大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA正義連接片段KTiZ-SBAZ ；所述的KTi,SBA,7 α P和GFP其核苷酸序列依次分別如=SEQ ID No. 1、2、3和4所示，所述的連接片段SBAF-KTiF或KTiZ-SBAZ在KTi和SBA之間引入了酶切位點(diǎn)Mil ；所述的7 α P、KTi、SBA基因片段均來(lái)自于吉農(nóng)17。一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體制備方法，該方法包括1)提取大豆吉農(nóng)17總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，用引物Pl 5' TTT CTG CAG AAGTCAGACATAACAGCAT 3' (Pst I)P2 5' TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC 3' (Sal I)擴(kuò)增大豆胰蛋白酶抑制劑基因KTi基因片段；用引物Pl 5' TTT GTC GAC ATCCACATTTGGGACAGC 3' (Sal I)P2 5' GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (XbaI)擴(kuò)增大豆凝集素SBA基因片段；提取大豆吉農(nóng)17的基因組DNA，以其為模板，用引物Pl 5' GGG GAA TTC TGCTTGGATTTGGACCAGAC 3' ； (EcoR I)P2 5' GGG TCT AGA TAGGATATTGAACTAGTTCT 3' ；(Xba I)擴(kuò)增大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P ；提取AHLG的質(zhì)粒DNA，以其為模板，用引物Pl 5' TTT CTG CAG ATG GTG AGC AAG GGC GA 3' ； (Pst I)Ρ2 5' GGG AGA TCT TTACTTGTACAGCTCGTC 3' ； (Bgl II)
進(jìn)行GFP基因的PCR擴(kuò)增；將上述各基因分別插入克隆載體pMD18-T中；2)克隆質(zhì)粒pMD-T-7 α P和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA3301分別用EcoR I、Xba I進(jìn)行雙酶切，電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，16°C連接過夜，得到種子特異性表達(dá)載體ρ3301_7αρ ；3)將重組質(zhì)粒ρ3301_7αΡ經(jīng)I^t I、Bgl II酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒 PMD18-T-GFP經(jīng)I^st I和Bgl II酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒 Ρ3301-7 α P上，得中間表達(dá)載體ρ3301_7 α P-GFP ；4)同時(shí)用Pst I和Ml I、Sal I和Xba I分別雙酶切克隆載體pMD18_T_KTi和 PMD18-T-SBA，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，對(duì)KTi和SBA做T4連接，以連接產(chǎn)物為模板，用引物Pl 5' GGG AGA TCT GTC AGA CAT AAC AGC AT 3' (Bgl II)P2 5' TTG GGT TACC TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (BstE II)進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段連入pMDIS-T載體，得到重組克隆載體 pMD18-T-KTiZ-SBAZ ；5)同時(shí)用Bgl II和BstE II分別雙酶切克隆載體pMD18-T-KTiZ_SBAZ和過渡載體P3301-7 α P-GFP，將切下的片段連入ρ3301_7 α P-GFP，構(gòu)建成正義表達(dá)載體 PCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ ；6)同時(shí)用Xba I和I3St I分別雙酶切表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA3301_KTiZ_SBAZ和克隆質(zhì)粒pMD18-KTiZ-SBAZ，經(jīng)電泳回收連接，得到雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pCAMBIA3301_7 α P-SBAF-K TiF-GFP-KTiZ-SBAZ,統(tǒng)稱pCAMBIA3301-KTi_SBA。一種根癌農(nóng)桿菌，它是轉(zhuǎn)染了 pCAMBIA3301-KTi-SBA的根癌農(nóng)桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，在改良大豆中胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA含量的應(yīng)用本發(fā)明的大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體是從大豆籽粒中克隆了大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA基因，用綠色熒光蛋白GFP為中間片段， 構(gòu)建了大莖環(huán)KTi和SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體；以植物表達(dá)載體pCAMBIA3301為基礎(chǔ)，用大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P，并插入大莖環(huán)KTi和SBA雙干擾體，獲得了重組表達(dá)載體pCAMB IA3301-7 α P-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ,通過遺傳轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)基因大豆品種的胰蛋白酶抑制劑活力平均降低了 83%，凝集素活性也有大幅度降低，從而降低了飼料加工成本，期望為畜牧業(yè)增加更大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pKTi-SBA-RNAi構(gòu)建流程圖。圖2為雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pCAMBIA3301-KTi-SBA構(gòu)建流程圖。圖3為雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pKTi-SBA-RNAi酶切電泳檢測(cè)結(jié)果4為雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pCAMBIA3301-KTi-SBA酶切電泳檢測(cè)結(jié)果圖實(shí)施例1提取大豆總RNA提取與cDNA的合成RNA的提取使用TRIzoL試劑盒(TaKaRa公司)從處于成熟中后期的大豆品種“吉農(nóng)17”籽粒提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系反應(yīng)體系為20 μ L，其中5 X緩沖液4. 0 μ L，dNTP (IOmM) 2. 0 μ L， 通用引物2. OyL，反轉(zhuǎn)錄酶lyL，RNA酶抑制劑0. 5yL，模板4yL，ddH20 6. 5 yL。上述試劑均購(gòu)于TaKaRa公司。實(shí)施例2大豆胰蛋白酶抑制劑基因KTi基因片段的克隆、篩選及鑒定根據(jù)GenBank已發(fā)表的KTi3基因序列(S45092)的保守序列設(shè)計(jì)引物，選取324bp 的片段作為干擾KTi類型胰蛋白酶抑制劑基因的mRNA，為了便于重組植物表達(dá)載體構(gòu)建， 在上、下游引物的5’端分別引入I^t I和Ml I位點(diǎn)，引物序列如下(畫線部分為加入的酶切位點(diǎn))Primerl 5' TTT CTG CAG AAGTCAGACATAACAGCAT 3' (Pst I)Primer2 5' TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC 3' (Sal I)以實(shí)施例1合成的大豆cDNA為模板；PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)體系為 25μ L，其中(NH1)2SO4 Buffer 2. 5 μ 1，MgCl2 2· 5μ 1， dNTPMiXture(10mM)0. 5μ 1，引物各1μ 1(由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)， 模板CDNAl μ 1，Taq酶0. 1 μ 1，ddH2017. 4 μ L (上述試劑均購(gòu)于MBI公司)；PCR 擴(kuò)增條件941預(yù)變性51^11，941變性558，481復(fù)性458，721延伸558，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸anin;進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，分別得到約 324bp和517bp的片段，特異性強(qiáng)，單一的擴(kuò)增帶。電泳后，采用北京V-gene生物公司的DNA GeLExtraction Kit回收目的片段；回收的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T連接；連接反應(yīng)體系在10μ 1反應(yīng)體系中，Solution I 5 μ 1，PCR回收產(chǎn)物4 μ 1， PMD18-T Vectorl μ 1?；靹蚝?16°C反應(yīng) 16h。(pMD18-T_vector 購(gòu)于 TaKaRa 公司)。重組載體的轉(zhuǎn)化按Maniatis的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，冰浴30min，同時(shí)做對(duì)照管。然后42°C熱激90s，冰上放置anin。每管加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C溫育45min，140rpm/min。涂在含氨芐青霉素(100 μ g/mL)、X-gal (北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、IPTG(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)的LB培養(yǎng)基平板上選擇培養(yǎng)過夜(37°C)。挑取白斑用堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，得到重組克隆pMD18-T-KTi ；送北京三博遠(yuǎn)志有限公司測(cè)序，核苷酸序列分析用DNAMAN軟件，其核苷酸序列如SEQID No. 1 所示。實(shí)施例3SBA基因片段PCR克隆、篩選及鑒定依據(jù)GeneBanK中已知大豆凝集素基因序列(AY34221； )設(shè)計(jì)人工寡核苷酸擴(kuò)增， 為了便于重組植物表達(dá)載體構(gòu)建，在上、下游引物的5'端分別引入Ml I和)(ba I位點(diǎn)，引物如下(畫線部分為加入的酶切位點(diǎn))Primerl 5' TTT GTC GAC ATCCACATTTGGGACAGC 3' (Sal I)Primer2 5' GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (XbaI)以實(shí)施例1合成的大豆cDNA為模板；
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PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)體系為 25 μ L，其中(NH4)2SO4 Buffer 2. 5 μ 1, MgCl2 2. 5μ 1, dNTP Mixture (各 10mM)0. 5μ 1，引物各 0.5 μ 1，模板 0· 3 μ 1，Taq 酶 0· 3 μ 1 (MBI 公司)， ddH2018. 4 μ L ；上述試劑均購(gòu)于MBI公司；PCR 擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 Imin, 52. 8°C 復(fù)性 55s，72°C延伸 55s， 35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，分別得到約 324bp和517bp的片段，特異性強(qiáng)，單一的擴(kuò)增帶。電泳后，采用北京V-gene生物公司的DNA GeLExtraction Kit回收目的片段；回收的PCR產(chǎn)物分別與克隆載體PMD18-T連接；連接反應(yīng)體系在10μ 1反應(yīng)體系中，Solution I 5 μ 1，PCR回收產(chǎn)物4 μ 1， PMD18-T Vectorl μ 1。混勻后 16°C反應(yīng) 16h。(pMD18-T_vector 購(gòu)于 TaKaRa 公司)。重組載體的轉(zhuǎn)化按Maniatis的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，冰浴30min，同時(shí)做對(duì)照管。然后42°C熱激90s，冰上放置anin。每管加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C溫育45min，140rpm/min。涂在含氨芐青霉素(100 μ g/mL)、X-gal (北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、IPTG(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)的LB培養(yǎng)基平板上選擇培養(yǎng)過夜(37°C)。挑取白斑用堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，得到重組克隆PMD18-T-SBA ；送北京三博遠(yuǎn)志有限公司測(cè)序，核苷酸序列分析用DNAMAN軟件，其核苷酸序列如SEQID No. 2 所示。實(shí)施例4大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P的克隆利用CTAB法提取得到大豆品種“吉農(nóng)17”的基因組DNA，以其為模板，利用大豆7S 蛋白α亞基基因啟動(dòng)子序列的特異性引物PCR擴(kuò)增大豆種子特異性啟動(dòng)子7α P;為了便于重組植物表達(dá)載體構(gòu)建，在上、下游引物的5'端分別引入EcoR I和)(ba I位點(diǎn)，引物序列如下(畫線部分為加入的酶切位點(diǎn))Primerl 5' GGG GAA TTC TGCTTGGATTTGGACCAGAC 3' ； (EcoR I)Primer2 5' GGG TCT AGA TAGGATATTGAACTAGTTCT 3' ； (Xba I)PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)體系為 50 μ L，其中(NH4)2SO4 Buffer 5 μ 1，MgCl2 5 μ 1，dNTP Mixture(IOmM) 1 μ 1，引物各1 μ 1 (由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)，模板DNA 1 μ 1，Taq酶0. 3 μ 1，ddH20 34. 7 μ L (上述試劑均購(gòu)于MBI公司)；PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性8min，94°C變性lmin，68°C復(fù)性anin30s，32個(gè)循環(huán)，最后 72°C 延伸 30min ；回收的PCR產(chǎn)物大豆種子特異性啟動(dòng)子7α P與克隆載體pMDIS-T連接；獲 PMD18-T-7 α P，統(tǒng)稱ρ_7 α P經(jīng)測(cè)序，核苷酸序列分析用DNAMAN軟件，大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P的核苷酸序列如=SEQ ID No. 3所示。實(shí)施例5綠色熒光蛋白GFP基因片段的擴(kuò)增參照植物表達(dá)載體AHLG上GFP基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。提取AHLG的質(zhì)粒DNA，以其為模板進(jìn)行GFP基因的PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)體系為 50 μ L，其中(NH4)2SO4 Buffer 5 μ 1，MgCl2 5 μ 1，dNTPMixture (IOmM) 1 μ 1，引物各1 μ 1 (由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)，模板質(zhì)粒DNA 1 μ 1，Taq酶0. 3 μ 1，ddH20 34. 7 μ L (上述試劑均購(gòu)于MBI公司)；PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 50s，56°C復(fù)性 50s，72°C延伸 55s，28 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸30min ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳后回收目的片段。為了便于重組植物表達(dá)載體構(gòu)建，在上、下游引物的5'端分別引入I^st I和Bgl II位點(diǎn)，引物序列如下(畫線部分為加入的酶切位點(diǎn))Primerl 5' TTT CTG CAG ATG GTG AGC AAG GGC GA 3' ； (Pst I)Primer2 5' GGG AGA TCT TTACTTGTACAGCTCGTC 3' ； (Bgl II)回收的PCR產(chǎn)物GFP與克隆載體pMD18_T連接，獲p_GFP。GFP的核苷酸序列如 SEQID No. 4 所示實(shí)施例6KTi基因RNAi表達(dá)載體ρ7 α P-KTiZ-GFP-KTiF完整的ihpRNA構(gòu)件 (pMD18-T-KTiRNAi)的克隆(參見附圖1)1)種子特異性表達(dá)載體ρ1301-7 α P的構(gòu)建將克隆質(zhì)粒ρ-7 α P和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301分別用EcoR I、Xba I進(jìn)行雙酶切， 電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，然后以3 1的比例，加連接液 4. 0 μ L混勻，16°C反應(yīng)過夜，得到重組質(zhì)粒(P 1301-7 α P)；該pCAMBIA1301質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室
保存；2)中間表達(dá)載體ρ 1301-7 α P-GFP的構(gòu)建將上述重組質(zhì)粒ρ1301_7αΡ經(jīng)I^st I、Bgl II酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒(P-GFP)經(jīng)I^t I和Bgl II酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒 (Ρ1301-7 α P)上，得中間表達(dá)載體 ρ1301_7 α P-GFP。3)重組表達(dá)載體ρ1301-7 α P-KTiZ-GFP的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pMD18-T_KTi為模板，利用KTi基因的正向引物PCR擴(kuò)增KTiZ， 電泳后回收目的片段，然后利用)(ba I和I^st I分別雙酶切KTiZ的PCR回收產(chǎn)物和 P1301-7 α P-GFP質(zhì)粒，37°C酶切3h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，將胰蛋白酶抑制劑 KTi正向插入中間表達(dá)載體ρ1301-7 α P-GFP，得到ρ1301_7 α P-KTiZ-GFP0擴(kuò)增KTiZ的引物序列如下Pl :5，TTG GAA TTCAAGT CAG ACA TAA CAG CAT 3，(Xba I)P2 :5，GGG CTG CAGTTC ATC ATC AGA AAC TC 3，(Pst I)4) ihpRNA 種子特異性表達(dá)載體 ρ1301_7 α P-KTiZ-GFP-KTiF 的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pMD18-T-KTi為模板，利用KTi基因的反向引物PCR擴(kuò)增KTiF，電泳后回收目的片段，然后利用Bgl II和BstE II分別雙酶切KTiF的PCR回收產(chǎn)物和重組質(zhì)粒ρ1301-7 α P-KTiZ-GFP, 37 °C酶切3h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，得到 P1301-7 α P-KTiZ-GFP-KTiF0 擴(kuò)增 KTiF 的引物序列如下Pl :5，GGG AGA TCT TTC ATC ATC AGA AAC TC 3，(Bgl II)Ρ2 :5，TTG GGT TACCAAGT CAG ACA TAA CAG CAT 3，(BstE II)實(shí)施例7KTi 基因 RNAi 表達(dá)載體 ρ1301_7 α P-KTiZ-GFP-KTiF 完整的 ihpRNA 構(gòu)件的克隆
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以P1301 -7 α P-KTiZ-GFP-KTiF質(zhì)粒DNA為模板，利用種子特異性啟動(dòng)子7 α P 的上游引物PBX和NOS終止子的下游引物NOSX PCR擴(kuò)增ρ1301_7 α P-KTiZ-GFP-KTiF 完整的ihpRNA構(gòu)件。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，將測(cè)序正確的命名為 pMD18-T-KTiRNAi。引物序列如下PBX :5，GGGCTCGAGTGC TTG GAT TTG GAC CAG AC 3，(Xho I)NOSX :5，TTG CTCGAG GAT CTA GTA ACA TAG ATG ACA CCG 3，(Xho I)實(shí)施例8SBA基因ihpRNA種子特異性表達(dá)載體ρ 1301-7 α P-SBAZ-GFP-SBAF的構(gòu)
建1)重組表達(dá)載體ρ7 α P-SBAZ-GFP的構(gòu)建以克隆質(zhì)粒pMD18-T-SBA為模板，利用SBA基因的正向引物PCR擴(kuò)增SBAZ，電泳后回收目的片段，用Xba I和I^st I分別雙酶切SBAZ和重組質(zhì)粒pl301-7aP-GFP，37°C酶切3h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，將SBA插入種子特異性表達(dá)載體pl301-7 a P-GFP 中，得到p7 a P-SBAZ-GFP ；擴(kuò)增SBAZ的引物序列如下Pl 5' TTT GAA TTC ATCCACATTTGGGACAGC 3' (XbaI)P2 5' GGG CTG CAG TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (PstI)2). ihpRNA 種子特異性表達(dá)載體 ρ1301_7 α P-SBAZ-GFP-SBAF 的構(gòu)建以克隆質(zhì)粒pMD18-T-SBA為模板，利用SBA基因的反向引物PCR擴(kuò)增SBAF， 電泳后回收目的片段，用Bgl II和BstE II分別雙酶切SBAF的PCR回收產(chǎn)物和重組質(zhì)粒ρ7 α P-SBAZ-GFP, 37 °C酶切3h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，得到 ρ 1301-7 α P-SBAZ-GFP-SBAF。擴(kuò)增 SBAF 的引物序列如下Pl 5' GGG AGA TCT TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (BglII)P2 5' TTT GGT TACC ATCCACATTTGGGACAGC 3' (BstEII)實(shí)施例9雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pKTi_SBA_RNAi的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化1)大豆胰蛋白酶抑制劑KTi基因和凝集素SBA基因雙價(jià)RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建
以pMD18-T_KTiRNAi的質(zhì)粒DNA為模板，利用種子特異性啟動(dòng)子7 α P的上游引物和NOS終止子的下游引物PCR擴(kuò)增ρ1301-7 α P-KTiZ-GFP-KTiF完整的ihpRNA構(gòu)件，然后電泳，回收，利用Xho I單酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ρ1301-7 α P-KTiZ-GFP-KTiF和SBA基因RNAi 表達(dá)載體Ρ1301-7 α P-SBAZ-GFP-SBAF，37 °C酶切l(wèi)h，然后在微量離心管中分別依次加入 2 μ IlOXbuffer 和 1 μ 1 CIAP 將 ρ1301_7 α P-SBAZ-GFP-SBAF 載體去磷酸化，反應(yīng) 30 分鐘后650C加熱Smin。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，成功地構(gòu)建了雙價(jià)RNAi表達(dá)載體 pKTi-SBA-RNAi。2)大豆胰蛋白酶抑制劑KTi基因和凝集素SBA基因雙價(jià)RNAi表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出4個(gè)重組克隆。通過限制性內(nèi)切酶)(bal和I^stI酶切鑒定，得到兩條約517bp和324bp的特異帶，電泳圖譜(附圖3) 表明大豆胰蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因確實(shí)插入到植物表達(dá)載體PCAMBIA1301的種子特異啟動(dòng)子下游，成功地構(gòu)建了雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pKTi-SBA-RNAi。實(shí)施例10雙價(jià)RNAi載體pCAMBIA3301_KTi_SBA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化(參見附圖2)1)種子特異性表達(dá)載體ρ3301-7 α P的構(gòu)建將實(shí)施例4制得的克隆質(zhì)粒pMD-T-7 α P和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA3301分別用EcoR I、Xba I進(jìn)行雙酶切，電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，16°C連接過夜，得到重組質(zhì)粒(Ρ3301-7 αΡ)；2)中間表達(dá)載體ρ3301-7 α P-GFP的構(gòu)建將重組質(zhì)粒ρ3301_7αΡ經(jīng)I^st I、Bgl II酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒 (P-GFP)經(jīng)I^st I和Bgl II酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒 (Ρ3301-7 α P)上，得中間表達(dá)載體 ρ3301_7 α P-GFP ；3) KTi與SBA連接成雙片段KTi-SBA同時(shí)用Pst I和Sal I, Sal I和Xba I分別雙酶切克隆載體pMD-T-KTi和 pMD-T-SBA,反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，對(duì)KTi和SBA做T4連接，以連接產(chǎn)物為模板，利用KTi的上游引物^s-dj和SBA的下游引物21as-dj對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增得到的片段連入 PMD18-T載體，得到重組克隆載體pMD18-T-KTiZ-SBAZ。2ks-dj 5' GGG AGA TCT GTC AGA CAT AAC AGC AT 3' (Bgl II)21as-dj 5' TTG GGT TACC TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (BstEII)4)正義表達(dá)載體 pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ 的構(gòu)建同時(shí)用Bgl II和BstE II分別雙酶切克隆載體pMD18-T-KTiZ_SBAZ和過渡載體P3301-7 α P-GFP,將切下的片段連入ρ3301_7 α P-GFP,構(gòu)建成正義表達(dá)載體 PCAMBIA330I-KTiZ-SBAZ。5)雙價(jià) RNAi 載體 pCAMBIA3301_KTi_SBA 的構(gòu)建同時(shí)用Xba I和I3St I分別雙酶切表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA3301_KTiZ_SBAZ和克隆質(zhì)粒 pMD18-KTiZ-SBAZ，然后經(jīng)電泳回收連接，得到雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pCAMBIA3301_7 α P-SBAF -KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，統(tǒng)稱pCAMBIA3301-KTi_SBA ；成功構(gòu)建了 siRNA 表達(dá)載體。6)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出7個(gè)重組克隆。通過限制性內(nèi)切酶I3St I和Ml I, Sal I和Xba I酶切鑒定，得到兩條約3Mbp和517bp的特異帶，電泳圖譜(附圖4)表明大豆胰蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因確實(shí)插入到植物表達(dá)載體PCAMBIA3301的種子特異啟動(dòng)子下游，成功地構(gòu)建了 siRNA的表達(dá)載體 pCAMBIA3301-KTi-SBAo實(shí)施例11 雙價(jià) RNAi 表達(dá)載體 pKTi_SBA_RNAi 和 pCAMBIA3301-KTi-SBA 的遺傳轉(zhuǎn)化采用RNAi技術(shù)沉默大豆胰蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定、內(nèi)源大豆胰蛋白酶抑制劑和凝集素活性的測(cè)定和農(nóng)藝性狀的觀察，研究RNAi技術(shù)對(duì)大豆胰蛋白酶抑制劑和凝集素在種子特定部位的表達(dá)調(diào)控效果以及對(duì)其他品質(zhì)性狀的影響，培育出大豆新品種。此外，還對(duì)兩種RNAi表達(dá)載體(一個(gè)大莖環(huán)結(jié)構(gòu)和兩個(gè)小莖環(huán)結(jié)構(gòu))轉(zhuǎn)入大豆后的效果進(jìn)行了比較，得出一個(gè)大莖環(huán)結(jié)構(gòu)要比兩個(gè)小莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA抑制效果顯著的結(jié)論。1、花粉管通道法轉(zhuǎn)化1)表達(dá)質(zhì)粒(pCAMBIA3301-KTi-SBA 和 pKTi-SBA-RNAi)的提取采用改良的“堿裂解法”(大量)提取表達(dá)質(zhì)粒(pCAMBIA3301-KTi-SBA和 pKTi-SBA-RNAi)。
置于冰箱中待用。2)受體大豆品種“吉農(nóng)觀”，“吉農(nóng)18”，“吉農(nóng)27”的種植將受體大豆品種“吉農(nóng)觀”，“吉農(nóng)18”，“吉農(nóng)27”的種子播種于試驗(yàn)田內(nèi)，按照一般方法管理，培育成株至開花，在盛花期進(jìn)行目的基因的導(dǎo)入。3)受體植株的選擇和目的基因的導(dǎo)入時(shí)間選擇在下午3:00 5:00時(shí)進(jìn)行目的基因的導(dǎo)入。方法為用鑷子將多余花去除，然后將即將要導(dǎo)入花的萼片與翼瓣去除，用小剪刀將顯露出的柱頭小心剪去一小部分， 然后用微量進(jìn)樣器在切口處滴注5 10 μ L制備好的質(zhì)粒DNA液(pCAMBIA3301-KTi-SBA和 pKTi-SBA-RNAi)，掛上標(biāo)牌，記載導(dǎo)入時(shí)間，質(zhì)粒DNA名稱和受體品種。待15 20min后，
復(fù)滴一次。4)后期管理和收獲轉(zhuǎn)化的植株在3 IOd內(nèi)進(jìn)行去雜，待大豆成熟時(shí)，將導(dǎo)入外源DNA的大豆莢分別收獲，曬干，脫粒。2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌工程菌液的制備利用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取pCAMBIA3301-KTi-SBA和pKTi_SBA_RNAi的質(zhì)粒 DNA,通過凍融法分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中，將經(jīng)過菌落PCR鑒定的農(nóng)桿菌單菌落分別接種于含有100 μ g/ml Kan的5ml YEP液體培養(yǎng)基中，于，2IOrpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將其轉(zhuǎn)入50ml YEP液體培養(yǎng)基中，于，2IOrpm振蕩培養(yǎng)至0D_值在 0. 5 1. 0時(shí)，收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基懸浮，待用。2)大豆子葉節(jié)的培養(yǎng)和處理A.挑選飽滿、無(wú)破損和無(wú)病的大豆種子進(jìn)行表面消毒將大豆種子盛于一個(gè)大培養(yǎng)皿中，取15mL NaClO、濃5mL HCl于玻璃培養(yǎng)皿中混合，使產(chǎn)生氯氣，迅速蓋好玻璃培養(yǎng)皿的上蓋，熏蒸消毒過夜。將消毒后的大豆種子置于萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 5d。B.取萌動(dòng)的種子制備子葉節(jié)外植體用鑷子剝?nèi)ゴ蠖狗N皮，然后用解剖刀沿種子中線縱向切開，使兩片子葉分開，切去子葉的1/3，再去掉下胚軸及頂芽。每皿約18個(gè)子葉，
預(yù)培養(yǎng)3d。3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化A.將預(yù)培養(yǎng)3d后的大豆子葉節(jié)外植體，用解剖刀在子葉與胚軸交接處淺劃幾刀制造創(chuàng)傷后，放入用MB液體培養(yǎng)基重懸后的菌液中浸泡30min，期間每隔5min搖動(dòng)一次。B.倒掉菌液，將子葉節(jié)取出放在無(wú)菌的濾紙上稍微吸干，然后將其近軸面向下置于MB共體培養(yǎng)基中，26°C暗培養(yǎng)3d。C.待共培養(yǎng)3d后的外植體，周圍出現(xiàn)菌斑后，將其轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)濃度的Cef、Carb 和Hyg的MB篩選培養(yǎng)基上，260C，光照16h/d，光照強(qiáng)度2000LX培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為對(duì)照，每隔15d更換一次培養(yǎng)基。D.待抗性芽長(zhǎng)至1 2cm左右時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中長(zhǎng)莖，當(dāng)莖長(zhǎng)至3 5cm時(shí)，移入含有相應(yīng)潮霉素濃度的MB生根培養(yǎng)基中。E.待根系發(fā)育好后，先煉苗3d，然后移入盛有無(wú)菌土的花盆中，用塑料薄膜保濕 3d后，室溫常規(guī)管理。
3、轉(zhuǎn)化后代的篩選和鑒定(1)轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測(cè)(2)轉(zhuǎn)基因植株的胰蛋白酶活性的檢測(cè)1)試樣的制備稱取0.2g Ig試樣，將試樣材料磨碎，過篩(篩盤為100目 200目)。在室溫條件下先用戍烷己烷(1 1)脫脂。脫脂方法如下將試樣浸泡于20mL戍烷己烷 (1 1)中，低檔速電磁攪拌30min，過濾。殘?jiān)眉s50mL戍烷己烷(1 1)淋洗倆次， 收集殘?jiān)?。然后加?0mL O.Olmol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行浸提，低檔速電磁攪拌下浸提池， 過濾。浸出液用于測(cè)定，必要時(shí)，可進(jìn)行稀釋。2)測(cè)定管和對(duì)照管的制備取兩組平行的試管，按表5-2在每組中一次加入試樣浸出液、水和胰蛋白酶溶液， 于37°C水浴中混合后，再加入5. OmL預(yù)熱至37°C的BAPA底物溶液，從第一管加入起計(jì)時(shí)， 于37°C水浴中搖動(dòng)混勻，并準(zhǔn)確反應(yīng)lOmin，最后加入1. OmL反應(yīng)終止液。在制備測(cè)定管的同時(shí)，應(yīng)制備試劑對(duì)照管和試樣對(duì)照管，即取2mL水或試樣浸出液，然后按順序加入2mL胰蛋白酶溶液、ImL反應(yīng)終止液和5mLBAPA底物溶液，混勻后過濾。表4-2反應(yīng)體系Table 4-2 reaction system
試劑非抑管測(cè)定管1 測(cè)定管2 測(cè)定管3 測(cè)定管4
試樣浸出液0.OmL0.3mL0.6mL1.0mL1.5mL水2.0 mL1.7mL1.4mL1.0ml.0.5mL胰蛋白酶溶液2.0 mL2.0mL2.0mL2.0mL2.0mLBAPA底物溶液5.0 mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL反應(yīng)終止液1.0 mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL3)測(cè)定以試劑對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定各測(cè)定管和對(duì)照管的吸光度值，以平行試管的算術(shù)平均值表示。4)結(jié)果表示A.酶活性的表示方法。a.胰蛋白酶活性單位(TU)在規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件下，每IOmL反應(yīng)液在410nm波長(zhǎng)下每分鐘升高0.01吸光度值即為一個(gè)TU。b.胰蛋白酶抑制率在規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件下，與非抑制管相比，測(cè)定管吸光度值降低的比率。c.胰蛋白酶抑制單位(TIU)在規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件下，與非抑制管相比，每IOmL反應(yīng)混合液在410nm波長(zhǎng)下每分鐘降低0. 01吸光度值即為一個(gè)TIU。B.計(jì)算a.各測(cè)定管的胰蛋白酶抑制率按如下公式計(jì)算
式中TIR-胰蛋白酶抑制率％ ；An-非抑管吸光度值；At-測(cè)定管吸光度值；Ato-試樣對(duì)照管吸光度值。b.只有胰蛋白酶抑制率在20% 70%范圍內(nèi)時(shí)，測(cè)定管吸光度值可用于胰蛋白酶抑制劑活性計(jì)算，各測(cè)定管胰蛋白酶抑制劑活性按如下公式計(jì)算
「01931 τι — Λ tI^Ajj f - 0.01式中TI-胰蛋白酶抑制劑活性，單位為胰蛋白酶抑制劑單位(TIU)；t-反應(yīng)時(shí)間，單位為分鐘(min)。c.單位體積試樣浸出液中胰蛋白酶抑制劑活性以測(cè)定用試樣浸出液體積(單位為mL)為橫坐標(biāo)，TI為縱坐標(biāo)作圖，擬和直線回歸方程，計(jì)算斜率，斜率值即是單位體積試樣浸出液中胰蛋白酶抑制劑活性(單位為TIU/ mL)。當(dāng)測(cè)定用試樣浸出液體積和TI不是一條直線關(guān)系時(shí)，單位體積試樣浸出液中胰蛋白酶抑制劑活性用各各測(cè)定管單位體積胰蛋白酶抑制劑活性的算術(shù)平均值表示。試樣值胰蛋白酶抑制劑活性按如下公式計(jì)算TIM -
m式中TIM-試樣中胰蛋白酶抑制劑活性，單位為胰蛋白酶抑制劑單位每克(TIU/g)；TIV-單位體積試樣浸出液中胰蛋白酶抑制劑活性，單位為胰蛋白酶抑制劑單位每毫升(TIU/mL)；V-試樣浸出液總體積，單位為毫升(mL)；F-稀釋倍數(shù)；m-試樣質(zhì)量，單位為克(g)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因大豆種子的胰蛋白酶抑制劑活力與對(duì)照(100% )相比有明顯的下降，其中轉(zhuǎn)一個(gè)大莖環(huán)結(jié)構(gòu)ihpRNA種子特異性表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因種子平均降低了 83%， 轉(zhuǎn)兩個(gè)小莖環(huán)結(jié)構(gòu)ihpRNA種子特異性表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因種子平均降低了 13.4%。以上結(jié)果說明ihpRNA種子特異性表達(dá)載體的RNAi表達(dá)構(gòu)件在種子特異性啟動(dòng)子的控制下有效的表達(dá)了 siRNA，從而抑制了內(nèi)源性胰蛋白酶抑制劑mRNA的翻譯，使胰蛋白酶抑制劑明顯降低，并且轉(zhuǎn)一個(gè)大莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNAi載體的抑制效果更好。(3)轉(zhuǎn)基因植株的凝集素活性的檢測(cè)1)大豆凝集素的提取取適量轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆(吉農(nóng)18)樣品，用研缽間歇性粉碎后，過40 目篩，稱取Ig過篩粉碎樣品與2倍體積的石油醚(沸程60 90°C)混合脫脂，攪拌1 后抽濾，脫脂的大豆粗粉靜置過夜至完全干燥，用2倍體積的0. 15mol/L濃度的NaCl混合浸提，溶液透析過夜，透析液在4°C下15000rpm離心30min，取上清液，得大豆凝集素粗品，用
15于檢測(cè)。2)紅細(xì)胞懸液的制備兔心臟采血后，血液注入裝有玻璃珠的椎形瓶中快速搖動(dòng)lOmin，以脫去纖維。取脫纖維血液5mL，加入10 15mL生理鹽水混勻，常溫離心GOOOrAiirT1, 5min)，倒去上部液體，反復(fù)幾次直至上部液體澄清。取ImL洗過血液用血球緩沖液(0. 02mol/L PBS, pH7. 2) 配制成2. 5%濃度的紅細(xì)胞懸液，置于4°C備用，可保存一周。3)大豆凝集素的檢測(cè)(1)在“V”型血凝板中每孔加入15 μ L血球緩沖液(0. 02mol/L PBS, ρΗ7· 2)。(2)取待測(cè)凝集素樣品15 μ L，加入第一孔，混勻后取出15 μ L，加入第二孔，混勻后取出15yL加入第三孔。依此類推，作倍比稀釋。(3) “V”型血凝板的最后一排加入反應(yīng)緩沖液做空白對(duì)照。(4)待測(cè)樣品倍比稀釋完成后，隨即每孔加入15yL 2. 5%的血球懸浮液，加完血球后將血凝板置于微型震蕩器上振動(dòng)(60rpm，lmin)，室溫放置，觀察凝集效果。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株凝集素活性均有大幅度減低。
權(quán)利要求
1.一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，其特征在于它是在PCAMBIA3301的EcoR I和)(ba I酶切位點(diǎn)中，插入大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P，在 Xba I和I^t I酶切位點(diǎn)中，插入了大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA反義連接片段 SBAF-KTiF，在I^st I和Bgl II酶切位點(diǎn)中，插入了綠色熒光蛋白GFP基因片段，在Bgl II 和BstE II中插入了大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA正義連接片段KTiZ_SBAZ。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，其特征在于所述的KTi, SBA,7 α P和GFP其核苷酸序列依次分別如=SEQ ID No. 1、 2、3和4所示；所述的連接片段SBAF-KTiF或KTiZ-SBAZ在KTi和SBA之間引入了酶切位點(diǎn) Sal I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，其特征在于所述的7 α P、KTi、SBA基因片段均來(lái)自于吉農(nóng)17。
4.一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體制備方法，該方法包括1)提取大豆吉農(nóng)17總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，用引物 Pl 5' TTT CTG CAG AAGTCAGACATAACAGCAT 3'P2 5' TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC 3' 擴(kuò)增大豆胰蛋白酶抑制劑基因KTi基因片段； 用引物Pl 5' TTT GTC GAC ATCCACATTTGGGACAGC 3'P2 5' GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA 3'擴(kuò)增大豆凝集素SBA基因片段；提取大豆吉農(nóng)17的基因組DNA，以其為模板，用引物Pl 5' GGG GAA TTC TGCTTGGATTTGGACCAGAC 3'；P2 5' GGG TCT AGA TAGGATATTGAACTAGTTCT 3'；擴(kuò)增大豆種子特異性啟動(dòng)子7 α P ；提取AHLG的質(zhì)粒DNA，以其為模板，用引物Pl 5' TTT CTG CAG ATG GTG AGC AAG GGC GA 3'；Ρ2 5' GGG AGA TCT TTACTTGTACAGCTCGTC 3'；進(jìn)行GFP基因的PCR擴(kuò)增；將上述各基因分別插入克隆載體PMD18-T中；2)克隆質(zhì)粒pMD-T-7α P和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA3301分別用EcoR I、Xba I進(jìn)行雙酶切， 電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，16°C連接過夜，得到種子特異性表達(dá)載體ρ3301_7αρ ；3)將重組質(zhì)粒ρ3301-7αΡ經(jīng)I^st I、Bgl II酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒 PMD18-T-GFP經(jīng)I^st I和Bgl II酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒 Ρ3301-7 α P上，得中間表達(dá)載體ρ3301_7 α P-GFP ；4)同時(shí)用PstI和Ml I, Sal I和Xba I分別雙酶切克隆載體pMD18_T_KTi和 PMD18-T-SBA,反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳，回收，連接，對(duì)KTi和SBA做T4連接，以連接產(chǎn)物為模板，用引物Pl 5' GGG AGA TCT GTC AGA CAT AAC AGC AT 3' (Bgl II)P2 5' TTG GGT TACC TGGCAAATTGGAAGAAAA 3' (BstE II)進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段連入PMD18-T載體，得到重組克隆載體pMD18-T-KTiZ-SBAZ ；5)同時(shí)用BglII和BstE II分別雙酶切克隆載體pMD18_T_KTiZ-SBAZ和過渡載體P3301-7 α P-GFP,將切下的片段連入ρ3301_7 α P-GFP,構(gòu)建成正義表達(dá)載體 PCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ ；6)同時(shí)用XbaI和I3St I分別雙酶切表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ和克隆質(zhì)粒 pMD18-KTiZ-SBAZ，經(jīng)電泳回收連接，得到雙價(jià)RNAi表達(dá)載體pCAMBIA3301_7 α P-SBAF-KTi F-GFP-KTiZ-SBAZ，統(tǒng)稱pCAMBIA3301-KTi_SBA。
5.一種根癌農(nóng)桿菌，它是轉(zhuǎn)染了 pCAMBIA3301-KTi-SBA的根癌農(nóng)桿菌。
6.一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，在改良大豆中胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA含量的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，它是從大豆籽粒中克隆了大豆胰蛋白酶抑制劑KTi和凝集素SBA基因，用綠色熒光蛋白GFP作為中間片段，構(gòu)建了大莖環(huán)結(jié)構(gòu)的KTi和SBA雙價(jià)RNAi表達(dá)載體，以植物表達(dá)載體pCAMBIA3301為基礎(chǔ)，用大豆種子特異性啟動(dòng)子7αP，并插入大莖環(huán)結(jié)構(gòu)的KTi和SBA雙干擾元件，獲得了重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-7αP-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，通過遺傳轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)基因大豆品種的胰蛋白酶抑制劑活力平均降低了83％，凝集素活性也有大幅度降低，從而降低了飼料加工成本，期望為畜牧業(yè)增加更大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102174561SQ20111000894
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月27日
發(fā)明者付永平, 杜娟, 王丕武 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)