專利名稱：：草地羊茅花藥組織培養(yǎng)的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)和作物育種領(lǐng)域，特別涉及一種草地羊茅花藥組織培養(yǎng)的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：草地羊茅，學名FestucapratensisL，又叫草甸羊茅，分布于歐亞大陸及北美溫帶地區(qū)，我國西北、西南地區(qū)也有分布，多年生草本。須根密集，稈直立，光滑，株高70-130cm。葉片扁平成內(nèi)卷，長15-20cm，葉耳披針形，鐮狀彎曲，邊緣具睫毛。圓錐花序緊縮或稍舒展，長10-25cm，小穗長10-15cm，含6-10花，穎披針形至卵形，長3_5mm，無毛，邊緣膜質(zhì)，外稃長卵形，長5-8mm，頂端無芒，子房無毛，花藥長達4mm。適應(yīng)的土壤范圍很廣，在肥沃、潮濕、富含有機質(zhì)的細壤中生長最好，對肥料反應(yīng)明顯。PH值的適應(yīng)范圍是4.7-8.5，最適宜PH值為5.5-7.5。在防風固沙、水土保持、環(huán)境綠化等方面也具重要的生態(tài)和觀賞價值。在雜交育種中，由于雜種后代遺傳組成高度雜合，性狀不斷分離，要得到一個穩(wěn)定的品系往往需要多年時間，耗費大量的人力物力。單倍體培養(yǎng)是用植物的組織細胞進行的育種方法，多用花藥離體培養(yǎng)法。單倍體的產(chǎn)生，可通過離體誘導，植物細胞具有潛在的再生性和全能性，能發(fā)育為完整植株，故應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)對特定組織進行離體培養(yǎng)，可誘導產(chǎn)生單倍體。方法是將一定發(fā)育階段的花藥、子房或幼胚，通過無菌操作接種在培養(yǎng)基上，使單倍體細胞分裂形成胚狀體或愈傷組織，然后由胚狀體發(fā)育成小苗或誘導愈傷組織發(fā)育為植株。因為它們的二倍數(shù)染色體是由單倍數(shù)染色體本身加倍而來的，所以都是純系，自交后代不會發(fā)生性狀分離，因此進行單倍體培養(yǎng)在作物品種選育上，可加快純合速度，提高選擇效率。目前，關(guān)于草地羊茅花藥培養(yǎng)的研究在國內(nèi)并沒有報道，國際上雖然有報道，但只是得到了白化苗(Roseetal.，1987)，白化苗不能成活，不能用于生產(chǎn)當中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于草地羊茅花藥愈傷組織分化培養(yǎng)的專用分化培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的草地羊茅的分化培養(yǎng)基，是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基激動素、NAA、碳源和凝膠劑；該分化培養(yǎng)基中激動素的終濃度是1.5-2.5mg/L,NAA的終濃度是0.4-0.6mg/L；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如下表1所示。表1.MS基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</table>在本發(fā)明分化培養(yǎng)基中凝膠劑可以是瓊脂、卡拉膠或Gelrite等，優(yōu)選是Gelrite；凝膠劑的用量以能達到培養(yǎng)基的硬度為基礎(chǔ)，可適當調(diào)整其用量。本發(fā)明中凝膠劑若采用Gelrite，則其在分化培養(yǎng)基中的終濃度可以是2.5-2.7g/L。分化培養(yǎng)基中碳源可以是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖等，優(yōu)選為麥芽糖；若采用麥芽糖，則麥芽糖在分化培養(yǎng)基中的終濃度可以是28-32g/L。上述分化培養(yǎng)基中激動素的終濃度優(yōu)選是2mg/L，NAA的終濃度優(yōu)選是0.5mg/L。本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)草地羊茅單倍體再生植株的方法。該方法可以固定草地羊茅優(yōu)良外源基因，提高育種效率。本發(fā)明的生產(chǎn)草地羊茅單倍體再生植株的方法，包括以下步驟1)將草地羊茅的花藥置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到誘導的愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到上述分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，得到單倍體再生植株。上述步驟1)中，愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加2，4_D、激動素(KT)、水解酪蛋白(CH)、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如上表1所示。該愈傷組織誘導培養(yǎng)基中2，4_D、激動素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和絲氨酸的終濃度是如下a)或b)a)2，4-D為1.8-2.2mg/L，激動素為0.3-0.7mg/L，水解酪蛋白為180_220mg/L，谷氨酰胺為480-520mg/L，脯氨酸為18_22mg/L，絲氨酸為18_22mg/L；b)2，4-D為2mg/L，激動素為0.5mg/L，水解酪蛋白為200mg/L，谷氨酰胺為500mg/L，脯氨酸為20mg/L，絲氨酸為20mg/L。上述花藥可根據(jù)草地羊茅的每一品種和同一品種的不同生長季，選取不同適齡期的花藥，并通過鏡檢進行校正。在本發(fā)明的方法中花藥可優(yōu)選為單核中期或晚期的花藥。單核中期或晚期的花藥是指細胞核處于周邊，也就是單核靠邊期的花藥。采用單核中、晚期花藥不僅誘導綠苗率高，且二倍體組織受到抑制不能成苗，從而保證了單倍體再生植株的產(chǎn)生。為了提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量，上述花藥是經(jīng)過低溫預處理的，該低溫預處理是將花藥置于0-10°C下處理5-10天；優(yōu)選為在4°C下處理7天。上述生產(chǎn)草地羊茅單倍體再生植株的方法還包括將步驟1中的草地羊茅花藥進行消毒處理，所述消毒處理是將經(jīng)過低溫預處理后的花藥放入lg/L的升汞溶液中消毒9-llmin分鐘后，用蒸餾水沖洗至少一次；消毒的時間最好為10分鐘。本發(fā)明的生產(chǎn)草地羊茅單倍體再生植株的方法，還包括將步驟2)中得到的單倍體再生植株接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到已生根的單倍體植株。上述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)液中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基中1/2MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表下2所示。表2.1/2MS基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</table>本發(fā)明中愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的碳源均可為葡萄糖、麥芽糖或蔗糖等；在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中碳源優(yōu)選為麥芽糖，麥芽糖在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的終濃度可為90g/L；在生根培養(yǎng)基中碳源優(yōu)選為蔗糖，蔗糖在生根培養(yǎng)基中的終濃度可為30g/L。本發(fā)明中愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的凝膠劑均可為瓊脂、卡拉膠或Gelrite等，愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中凝膠劑均優(yōu)選為Gelrite，Gelrite在愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的終濃度均可為2.6g/L。本發(fā)明的分化培養(yǎng)基可有效地將草地羊茅的花藥誘導的愈傷組織進行分化得到再生植株，在本發(fā)明實施例1中，愈傷組織的誘導率平均為81.2%，分化培養(yǎng)基誘導草地羊茅愈傷組織分化的分化率平均可達38%，不定芽的分化率平均可達45.7%。本發(fā)明方法是運用雄核發(fā)育技術(shù)，可以獲得具有純合遺傳背景的后代植株(品系)，固定優(yōu)良外源基因，固定屬間雜種優(yōu)勢，創(chuàng)造豐富的變異類型，可以從中選擇獲得在育種目標上有重大突破的新品種、新品系，提高選擇效率。本發(fā)明還首次完成了草地羊茅花藥培養(yǎng)到綠苗再生的全部過程，得到的再生綠苗能夠應(yīng)用于生產(chǎn)中，縮短了育種時間，提高選擇效率，從而大大提高了育種功效。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、“草地羊茅17號”單倍體植株的制備及統(tǒng)計觀察一、花藥誘導愈傷組織的獲得及其統(tǒng)計觀察1、花藥的獲得與低溫預處理取溫室內(nèi)正常生長的“草地羊茅17號”(種子購買于克勞沃草業(yè)有限公司)植株的單核中期的花藥。將采集到的草地羊茅穗子(內(nèi)含花藥)插入一個盛有自來水的三角瓶中，外罩塑料袋，攜回實驗室放入冰箱，4°C低溫黑暗條件下保存處理7天。接著鏡檢校正花藥的適齡期將低溫預處理之后的草地羊茅花序剝?nèi)∑溆姿牖ㄐ?，依次從花序上、中、下三部位剝?nèi)』ㄋ?，?.1%I-KI溶液染色后鏡檢，細胞核處于周邊即單核靠邊期的花藥就是單核中期的花藥。2、花藥消毒處理將上述步驟1中低溫預處理后的穗子自袋內(nèi)取出后，立即放入預先開機15分鐘的超凈工作臺內(nèi)，在超凈工作臺內(nèi)剝出穗子，按序號放入50ml的大試管中，隨即注入lg/L的升汞溶液消毒10分鐘，然后用無菌水沖洗3次。3、花藥誘導愈傷組織的獲得將上述步驟2中消毒后的穗子放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌不銹鋼鑷子將花藥從穎殼內(nèi)取出，平放入裝有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用雙層封口膜封閉，放于25°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，30-40天，得到愈傷組織，之后可每28天繼代到相同培養(yǎng)基上(即愈傷組織誘導培養(yǎng)基)。本實施例采用直徑為9厘米培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿內(nèi)可接種約25枚花藥。上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加2，4_D、激動素(KT)、水解酪蛋白(CH)、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、麥芽糖和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中2，4-D的終濃度為2mg/L，激動素的終濃度為0.5mg/L，水解酪蛋白的終濃度為200mg/L，谷氨酰胺的終濃度為500mg/L，脯氨酸的終濃度為20mg/L，絲氨酸的終濃度為20mg/L，麥芽糖的終濃度為90g/L；凝膠劑為Gelrite，Gelrite的終濃度為2.6g/L；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示，培養(yǎng)基的PH為5.8。4、愈傷組織的統(tǒng)計觀察上述步驟3中接種的花藥培養(yǎng)4-6周之后，可以觀察到愈傷組織分化。實驗重復3次，培養(yǎng)35天時進行統(tǒng)計觀察上述步驟3中愈傷組織的誘導情況，實驗結(jié)果見下表3，三次重復愈傷組織的誘導率分別為86.4%、77.4%和79.8%。表3.愈傷組織的誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</table>二、單倍體再生植株的獲得及統(tǒng)計觀察1、單倍體再生植株的獲得將上述步驟一中步驟3培養(yǎng)6-8周后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，分化培養(yǎng)期間的溫度為24-25°C，并保持16小時25-30ymOl/m2·s的光照，分化培養(yǎng)30-50天后得到單倍體再生植株。上述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基激動素、NAA、碳源和凝膠劑；其中激動素的終濃度是2mg/L，NAA的終濃度是0.5mg/L，碳源是麥芽糖，麥芽糖的終濃度是30g/L，凝膠劑是GelrithGelrite的終濃度為2.6g/L；MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示，培養(yǎng)基的PH為5.8。2、統(tǒng)計觀察實驗重復3次，統(tǒng)計觀察上述步驟二中步驟1的愈傷組織的分化情況，培養(yǎng)50天時進行統(tǒng)計，實驗結(jié)果見下表4，從表4可以看出，愈傷組織的分化率平均可達到38%，不定芽的分化率平均可達45.7%。表4.再生分化培養(yǎng)的分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table>三、生根培養(yǎng)與統(tǒng)計觀察1、生根培養(yǎng)將上述步驟二中步驟1得到的長出2-3片真葉的幼苗，轉(zhuǎn)接入含有生根培養(yǎng)基的三角瓶中，在22°C_25°C，光照強度為25-30ymOl/m2·8，光照時間為16小時下培養(yǎng)誘導生根，培養(yǎng)約10-15天，得到已生根的單倍體再生植株。上述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)液中添加蔗糖和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；其中蔗糖的終濃度為30g/L；凝膠劑是Gelrite，Gelrite的終濃度為2.6g/L；1/2MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表2所示，生根培養(yǎng)基的pH為5.8。2、生根情況的統(tǒng)計觀察實驗重復3次，統(tǒng)計觀察上述步驟三中步驟1的生根培養(yǎng)情況，實驗結(jié)果見下表5，從表5可以看出生根率達平均為92%，每株單倍體植株平均生根4.3根。表5.生根培養(yǎng)的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table>四、煉苗移栽及檢測分析1、煉苗移栽將上述步驟三中步驟1生根良好的試管苗(即再生植株)在自然條件下煉苗7天，然后洗凈瓊脂，移栽于苗床上生長。移栽的成活率為95%。2、檢測分析將上述步驟四中步驟1的再生植株生長到處于分蘗盛期時，用流式細胞儀方法確定再生植株的倍性。采用流式細胞儀測定植株倍性步驟如下用流式細胞儀進行倍性分析時，常用DNA的絕對含量或相對含量來進行分析。通常用已知細胞核DNA含量的雞血紅細胞核作測量標準。也可以用DNA的相對含量進行比較分析，在測量待分析樣品時，選擇一個已知倍性的同類材料作對照，所有待檢測的樣品均與其作比較，即可換算出待檢樣品的DNA相對含量，并對其進行倍性分析。1)取植物幼葉，用清水清洗，將IcmXIcm洗凈的新葉置于塑料培養(yǎng)皿中，加入0.5ml裂解液，用雙面刀將葉片切碎；2)將切好的樣品經(jīng)350目尼龍篩網(wǎng)過濾到離心管中；對所得濾液lOOOr/min的條件下離心5min；3)去上清，在準備用流式細胞儀檢測樣品時，再向樣品中加入200μ1PI染料，測試前置于低溫(4°C)染色2h；4)進行流式細胞儀檢測并通過與之連接的電腦軟件BDFACSCaliburSoftwarePackage分析檢測結(jié)果。倍性檢測的實驗結(jié)果表明，在隨機檢測的50株個體中，32株(64%)為二倍體植株，14株(28%)為單倍體植株，4株(8%)為非整倍體植株。實施例2、草地羊茅1號單倍體植株的制備及統(tǒng)計觀察本實施例與實施例1的區(qū)別在于采用的外植體-花藥為草地羊茅1號(羊茅種子購買于克勞沃草業(yè)有限公司)植株的單核晚期的花藥，其余步驟與實施例1的一致。本實施例的實驗統(tǒng)計觀察結(jié)果如下一、花藥誘導愈傷組織統(tǒng)計觀察實驗結(jié)果見下表6，愈傷組織的誘導率平均可達77.3%。表6.愈傷組織的誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</table>二、再生分化培養(yǎng)的分化率實驗結(jié)果見下表7，從表7可以看出，愈傷組織的分化率平均可達34%，不定芽的分化率平均可達41%。表7.再生分化培養(yǎng)的分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</table>三、生根培養(yǎng)的生根率實驗結(jié)果見下表8，從表8可以看出三次重復的生根率94%、84%和92%，每株單倍體植株平均生根4.0根。表8.生根培養(yǎng)的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</table>四、煉苗移栽后的檢測分析采用流式細胞儀檢測的實驗結(jié)果表明在隨機檢測的50株個體中，30株(60%)為二倍體植株，16株(32%)為單倍體植株，4株(8%)為非整倍體植株。權(quán)利要求一種草地羊茅的分化培養(yǎng)基，是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基激動素、NAA、碳源和凝膠劑；所述分化培養(yǎng)基中激動素的終濃度是1.5-2.5mg/L，NAA的終濃度是0.4-0.6mg/L；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分化培養(yǎng)基，其特征在于所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優(yōu)選是Gelrite；所述凝膠劑在所述分化培養(yǎng)基中的終濃度是2.5-2.7g/L；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為麥芽糖；所述麥芽糖在所述分化培養(yǎng)基中的終濃度是28-32g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分化培養(yǎng)基，其特征在于所述分化培養(yǎng)基中激動素的終濃度是2mg/L，NAA的終濃度是0.5mg/L。4.一種生產(chǎn)草地羊茅單倍體再生植株的方法，包括以下步驟1)將草地羊茅的花藥置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到誘導的愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到權(quán)利要求1-3中任一所述的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，得到單倍體再生植株。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加2，4-D、激動素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中2，4-D、激動素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和絲氨酸的終濃度是如下a)或b)a)2，4-D為1.8-2.2mg/L，激動素為0.3-0.7mg/L，水解酪蛋白為180_220mg/L，谷氨酰胺為480-520mg/L，脯氨酸為18_22mg/L，絲氨酸為18_22mg/L；b)2，4-D為2mg/L，激動素為0.5mg/L，水解酪蛋白為200mg/L，谷氨酰胺為500mg/L，脯氨酸為20mg/L，絲氨酸為20mg/L。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述花藥為單核中期或晚期的花藥。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述花藥是經(jīng)過低溫預處理的，所述低溫預處理是將花藥置于0-10°C下處理5-10天；優(yōu)選為在4°C下處理7天。8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述生產(chǎn)草地羊茅單倍體再生植株的方法還包括將步驟2)中得到的單倍體再生植株接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，得到已生根的單倍體植株。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)液中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述1/2MS基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表2所示。10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的碳源均為葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中碳源優(yōu)選為麥芽糖，所述麥芽糖在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的終濃度為90g/L；在所述生根培養(yǎng)基中碳源優(yōu)選為蔗糖，所述蔗糖在生根培養(yǎng)基中的終濃度為30g/L；所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的凝膠劑均為瓊脂、卡拉膠或Gelrite，均優(yōu)選為Gelrite，Gelrite在愈傷組織誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的終濃度均為2.6g/L。全文摘要本發(fā)明公開了一種草地羊茅花藥組織培養(yǎng)的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的草地羊茅的分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的固體培養(yǎng)基激動素、NAA、碳源和凝膠劑；其中激動素的終濃度是1.5-2.5mg/L，NAA的終濃度是0.4-0.6mg/L。本發(fā)明的方法，包括將草地羊茅的花藥置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到誘導的愈傷組織；再將愈傷組織轉(zhuǎn)接到本發(fā)明的分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，得到單倍體再生植株。本發(fā)明的分化培養(yǎng)基可有效地將草地羊茅的花藥誘導的愈傷組織進行分化得到再生植株，本發(fā)明方法是運用雄核發(fā)育技術(shù)，獲得具有純合遺傳背景的后代植株，從而提高選擇效率。文檔編號A01H4/00GK101836592SQ20101019783公開日2010年9月22日申請日期2010年6月3日優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日發(fā)明者李蔚,趙冰,郭仰東申請人:中國農(nóng)業(yè)大學