專利名稱：林蔭銀蓮花的離體快速增殖方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種林蔭銀蓮花的離體快速增殖培養(yǎng)方法及應用。

背景技術(shù)：
林蔭銀蓮花(Anemone flaccida Fr.Schmidt)系毛茛科(Ranunculacease)銀蓮花屬(Anemone)多年生草本植物，其干燥根莖俗稱“地烏”，具有祛風濕、助筋骨、消腫止痛等功效，是一種珍稀的高山藥材。每年3～5月為林蔭銀蓮花地上部生長發(fā)育時期?；~1～2片，長葉柄，五角形，長2～7cm，寬3～10cm。根狀莖近圓柱形，最大直徑為1cm，3～5年方能采收入藥。野生資源主要分布于長江中下游各省海拔1500～3000m的山坡林下陰濕處，在中國湖北省的鄂西山地分布相對集中[1]。
目前，五類新藥“地烏風濕安膠囊”對類風濕性關(guān)節(jié)炎有良好的治療作用，且毒副作用很小，已進入三期臨床試驗，該成藥將具有廣闊的市場前景[2]。林蔭銀蓮花野生資源珍稀，自然條件下生長、繁殖緩慢，嚴重限制了地烏成藥的開發(fā)利用。因此，利用快速增殖離體林蔭銀蓮花的培養(yǎng)方法對其進行快繁就成為解決這一矛盾的關(guān)鍵。
截至目前，國內(nèi)外除本課題組的工作外，關(guān)于林蔭銀蓮花的組織培養(yǎng)技術(shù)，均尚未見報導。自2006年以來，本課題組對林蔭銀蓮花的快繁技術(shù)從實驗室組培到組培苗原產(chǎn)地的煉苗、栽培進行了系統(tǒng)研究與開發(fā)，以地烏根狀莖芽為外植體誘導不定芽，再對不定芽生根培養(yǎng)后得到林蔭銀蓮花無菌組培苗已獲得成功[3]?？偨Y(jié)前期工作后發(fā)現(xiàn)，要實現(xiàn)離體培養(yǎng)條件下快速繁殖林蔭銀蓮花完整植株，使其能夠?qū)崿F(xiàn)人工栽培的目的尚存在以下一些問題需要解決(1)培養(yǎng)基的各種成分針對性不強，增殖效率較低；(2)缺乏關(guān)于試管苗繁殖系數(shù)和生長狀況等生物學性狀的詳細實驗數(shù)據(jù)；(3)試管苗生根率雖較高，但其再生根很細且弱，根系質(zhì)量差，影響對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，特別是緩苗期較長，移栽成活率低；(4)現(xiàn)有技術(shù)未見有對再生林蔭銀蓮花試管苗的煉苗及實地移栽的報道，更未見到關(guān)于利用離體培養(yǎng)林蔭銀蓮花用于生產(chǎn)應用的實際結(jié)果。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種林蔭銀蓮花的離體快速增殖方法及應用，以提高離體條件下林蔭銀蓮花再生植株的生根頻率，提高根的質(zhì)量，進而提高林蔭銀蓮花的繁殖效率。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn) 1、一種林蔭銀蓮花的離體快速增殖方法，其步驟如下所述 A、不定芽的增殖培養(yǎng) 1)選擇經(jīng)初代培養(yǎng)于MS，附加6-芐基腺嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.2mg/L，蔗糖30g/L和瓊脂0.8％的培養(yǎng)基上誘導出的林蔭銀蓮花不定芽，在無菌條件下將其分切成0.5～1.0cm2的芽塊； 2)將步驟1)的芽塊接種于1/2MS，附加6-芐基腺嘌呤1.0mg/L，萘乙酸0.4mg/L，激動素0.5mg/L，水解酪蛋白250～750mg/L，瓊脂0.8％和蔗糖20～30g/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為17±2℃，光照強度為3000Lux，光照周期為12h/d，培養(yǎng)周期為30d，以得到不定芽； B、擬球莖誘導 1)選擇經(jīng)A步驟增殖培養(yǎng)后獲得的不定芽為外植體，在無菌條件下去除葉片，將其分切成0.5～1.0cm2的芽塊； 2)將步驟1)的芽塊接種于MS，附加6-芐基腺嘌呤1.0mg/L，萘乙酸0.4mg/L、激動素0.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，瓊脂0.8％和蔗糖20～30g/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為17±2℃，光照強度為3000Lux，光照周期為12h/d，培養(yǎng)周期為30d，得到健壯的無菌芽苗； C、生根培養(yǎng) 1)將步驟A或步驟B培養(yǎng)得到的直徑為≥1cm，高為≥1.5cm的不定芽或無菌芽苗為外植體，除去其葉片，將其基部分切為1cm2的芽塊； 2)將步驟1)的芽塊接種于1/2MS，附加萘乙酸0.5mg/L，吲哚丁酸0.5mg/L，瓊脂0.75％和蔗糖20～40g/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為4±0.5℃，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為40d，獲得帶根無菌苗； D、煉苗移栽 1)取步驟C的帶根無菌苗，洗去無菌苗根部的培養(yǎng)基，將所述的無菌苗放入體積比為8∶2的潮土和沙子組成的基質(zhì)中，無菌苗植株上覆蓋紗布，置于5～6℃的冰箱中，7～10d后取出，使其煉苗； 2)將煉苗后的無菌苗培養(yǎng)至芽直徑為≥3cm，再生根條數(shù)為≥6，并移栽于大田中，保持移栽溫度為15℃，(光線強時需遮陰)。
更詳細的技術(shù)方案見《具體實施方式
》中的實施例如下所述。
本發(fā)明的優(yōu)點 (1)以本發(fā)明的培養(yǎng)基對林蔭銀蓮花不定芽進行培養(yǎng)，增殖效果顯著，增殖系數(shù)高，可達4.11，高于種苗增殖系數(shù)不小于3.0的植物組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)要求；增殖出的苗生長旺盛，30d后平均苗高度可達2.76cm，莖葉生長整齊健壯。
(2)本發(fā)明對擬球莖的誘導效果顯著，誘導率為76.5％，且芽苗的生長健壯，可作為林蔭銀蓮花的生產(chǎn)種苗。
(3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的組培苗生根率為97.2％；生根數(shù)多，平均每株12.6個根；再生根長，平均長度大于1.52cm。
(4)應用本發(fā)明的煉苗移栽方法，林蔭銀蓮花組培苗的移栽成活率至少為95％，當季出苗率大于90％，實現(xiàn)了林蔭銀蓮花的人工繁殖與栽培。
本發(fā)明與申請?zhí)枮?00810197165.7的主要技術(shù)特征和實施效果的比較分析如表1所示。
表1本發(fā)明與現(xiàn)有林蔭銀蓮花組織培養(yǎng)技術(shù)的主要差別

說明本說明書所用的術(shù)語“增殖系數(shù)”是指林蔭銀蓮花增殖培養(yǎng)中外植體的繁殖率，等于試管苗不定芽總數(shù)與產(chǎn)生這些不定芽的外植體總數(shù)的比值。



圖1和圖2是以林蔭銀蓮花不定芽為外植體誘導出的不定芽情況。
圖3和圖4是以林蔭銀蓮花不定芽為外植體誘導出的擬球莖情況。
圖5和圖6是以林蔭銀蓮花無菌苗為外植體誘導出的再生根情況。
圖7和圖8是林蔭組培苗移栽于大田時及出苗后生長情況。

具體實施例方式 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不局限于以下實施例。
實施例1 本實施例1所述培養(yǎng)基的配制方法，林蔭銀蓮花外植體的選擇方法，培養(yǎng)基及外植體滅菌方法，接種和初代培養(yǎng)方法參照朱端衛(wèi)等[3]報道的方法。
本實施例是林蔭銀蓮花無菌芽苗的制備過程，這些芽苗作為培養(yǎng)基篩選的試驗材料。
1)無菌材料的獲得 試驗材料本實施例的實驗材料是野生林蔭銀蓮花(Anemone Flaccida Fr.Schmidt)，采自湖北省長陽土家族自治縣銅鼓包自然狀態(tài)生長的野外生長的材料，不需要特別采集和篩選，也可以從市場上獲得。
選擇林蔭銀蓮花根莖帶老組織的長度為1～2cm的休眠芽，流水沖洗30min，濃度為1.5％的多菌靈水溶液浸泡2h，再用自來水沖洗30min，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，用濃度為75％的酒精消毒30～60s，無菌水沖洗1～2遍，再用0.2％升汞溶液消毒8～12min，無菌水沖洗4～5遍。
2)不定芽的誘導 先用無菌濾紙吸去林蔭銀蓮花外植體表面水分，將芽表面的老組織切除，然后從芽中間剖開，將外植體接種到不定芽誘導培養(yǎng)基上(不定芽誘導培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基，附加6-BA 2.0mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂0.8％，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0，按照常規(guī)方法對培養(yǎng)基進行滅菌。接種后培養(yǎng)室的培養(yǎng)溫度為17±2℃，光照強度3000Lux，光照周期為12h/d)誘導出不定芽。
3)將不定芽誘導培養(yǎng)基上已萌發(fā)的嫩芽切下，即獲得作為林蔭銀蓮花離體培養(yǎng)增殖培養(yǎng)基篩選的試驗材料。
實施例2 在實施例1的基礎(chǔ)上，本實施例公開了在離體培養(yǎng)條件下誘導的林蔭銀蓮花產(chǎn)生不定芽的完整過程。具體方法是在無菌條件(例如在超凈工作臺中，下同)去除在離體培養(yǎng)條件下獲得的林蔭銀蓮花的葉片，將林蔭銀蓮花的帶芽組培物(即多重芽塊)分切為0.5-1.0cm2的芽塊，接種于附加有水解酪蛋白(CH)分別為0、250、500、750、1000mg/L的MS培養(yǎng)基上(每一培養(yǎng)基均附加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.4mg/L、KT 0.5mg/L以及瓊脂0.8％，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)pH至5.8～6.0，按照常規(guī)方法對培養(yǎng)基進行滅菌)，比較林蔭銀蓮花不定芽的增殖系數(shù)和增殖質(zhì)量，篩選出林蔭銀蓮花不定芽增殖的最佳水解酪蛋白的濃度。
然后將MS基本培養(yǎng)基濃度(1/2MS、1/4MS和MS)與蔗糖濃度(10、20、30、40g/L)進行雙因素組合試驗(每一培養(yǎng)基均附加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.4mg/L、KT 0.5mg/L、CH 750mg/L以及瓊脂0.8％，pH5.8～6.0)，最終篩選并確定適用于林蔭銀蓮花不定芽增殖的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度17±2℃，光照強度3000Lux，光照周期為12h/d。30d后統(tǒng)計增殖系數(shù)、苗高度、莖粗細、葉片大小和顏色等指標。試驗結(jié)果見表2、表3所述。
表2不同濃度水解酪蛋白對林蔭銀蓮花離體不定芽生長的影響
注增殖系數(shù)＝30d后觀察總芽數(shù)/接種芽數(shù)；+代表苗的長勢，+越多，表示長勢越好，下同。
從表2可以看出，水解酪蛋白在250～750mg/L范圍內(nèi)，離體林蔭銀蓮花不定芽的增殖系數(shù)均較高，且試管苗高度沒有顯著差異，其中以水解酪蛋白750mg/L時增殖的效果最好。
表3不同MS培養(yǎng)基濃度與蔗糖濃度組合對林蔭銀蓮花不定芽生長的影響
從表3可以看出，MS培養(yǎng)基濃度相同時，增殖系數(shù)隨著蔗糖濃度的增加，總體呈現(xiàn)先增后降的趨勢，以30g/L時不定芽生長狀況最佳。蔗糖濃度為30g/L，生長在1/2MS和MS培養(yǎng)基上的外植體，生長狀況最佳，其增殖系數(shù)均高于4.0，株高大于3.0cm。綜合各種因素，選定1/2MS培養(yǎng)基和添加30g/L蔗糖作為離體林蔭銀蓮花不定芽增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。
實施例3 將增殖后產(chǎn)生的林蔭銀蓮花不定芽為外植體，去除葉片分切為0.5～1.0cm2的芽塊。將MS培養(yǎng)基濃度(1/2MS、1/4MS和MS)與蔗糖濃度(10、20、30、40g/L)進行雙因素組合試驗(每一培養(yǎng)基均附加6-BA 1.0mg/，NAA 0.4mg/L，KT 0.5mg/L，CH 500mg/L及瓊脂0.8％，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0)，篩選出適宜林蔭銀蓮花擬球莖誘導的培養(yǎng)基及蔗糖濃度。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為17±2℃，光照強度3000Lux，光照周期為12h/d。30d后統(tǒng)計擬球莖的誘導率及其生長狀況。結(jié)果見表4所示。
表4不同MS培養(yǎng)基濃度與蔗糖濃度組合對林蔭銀蓮花擬球莖生長的影響

注擬球莖誘導率＝誘導出擬球莖的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100％；+代表擬球莖長勢，即+越多，表示長勢越好，下同。
從表4可以看出，在培養(yǎng)基濃度相同條件下，林蔭銀蓮花擬球莖誘導率隨著蔗糖濃度的增加，總體呈現(xiàn)先增后降的趨勢，其中附加20～30g/L的蔗糖培養(yǎng)基中林蔭銀蓮花擬球莖的生長均較佳。蔗糖濃度為30g/L，生長在1/2MS和MS基本培養(yǎng)基上外植體誘導出的擬球莖生長狀況明顯較好，誘導率均高于70％。其中以MS培養(yǎng)基上最佳，誘導率為76.5％，且擬球莖生長最旺盛。綜合各種因素，選定MS基本培養(yǎng)基附加20～30g/L的蔗糖作為林蔭銀蓮花擬球莖培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
實施例4 將林蔭銀蓮花無菌芽苗接種在表5所示附加4種濃度蔗糖的生根培養(yǎng)基上，比較生根率和再生根的質(zhì)量，測試不同蔗糖濃度對無菌苗生根的影響，以篩選出適宜生根培養(yǎng)的蔗糖濃度。
具體步驟是將生長旺盛的林蔭銀蓮花不定芽或擬球莖，在無菌條件(超凈工作臺)去除葉片，將其基部分切為1.0cm2的小塊，轉(zhuǎn)接于1/2MS培養(yǎng)基上，均附加NAA 0.5mg/L，IBA 0.5mg/L以及瓊脂0.75％，pH5.8～6.0。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為4±0.5℃，暗培養(yǎng)。40d后統(tǒng)計生根率、根數(shù)、根長和根粗細。試驗結(jié)果見表5所示。
表5不同蔗糖濃度對林蔭銀蓮花無菌苗生根的影響
由表5可知，培養(yǎng)40d后，蔗糖在20～40g/L范圍內(nèi)時，林蔭銀蓮花無菌芽苗的生根率均≥83％，平均根數(shù)＞8條，根長＞1.2cm，根較粗。其中以蔗糖為30g/L時，再生根質(zhì)量最佳。而蔗糖為10g/L時，林蔭銀蓮花外植體表現(xiàn)出明顯營養(yǎng)不足的現(xiàn)象，顏色變黃，生長停滯。因此，在林蔭銀蓮花工廠化育苗的生根過程中，選擇20～30g/L的蔗糖均可。
實施例5 本實施例在實施例4的基礎(chǔ)上，將增殖培養(yǎng)后生根的林蔭銀蓮花無菌苗進行煉苗移栽，觀察生長狀況并統(tǒng)計其出苗率和成活率。
具體步驟①煉苗。洗去林蔭銀蓮花帶根無菌苗根部的培養(yǎng)基，將其放入潮土和沙子的混合基質(zhì)中(體積比8∶2)，在5～6℃的冰箱中進行煉苗，7～10d后取出，頂芽均開始萌發(fā)，根不斷伸長；②移栽。從煉苗后的材料中選取芽直徑≥3cm，再生根條數(shù)≥6的無菌苗240株，于2009年11月28日移栽至湖北省長陽土家族自治縣麻池鎮(zhèn)的地烏(即林蔭銀蓮花)栽培試驗基地，保持移栽時溫度為11℃，地表溫度為8℃(光線強時需遮陰)。
定期觀察并記錄出苗數(shù)及莖葉生長狀況，60d后挖出一半，觀察組培苗的根系生長狀況，統(tǒng)計成活率。試驗結(jié)果如表6所示。
表6林蔭銀蓮花組培苗移栽后的生長狀況
注成活率＝長出新根的株數(shù)/移栽株數(shù)×100％ 結(jié)果表明，培養(yǎng)20d后開始陸續(xù)出苗，2010年3月末觀察時出苗率為90.8％，莖葉生長旺盛；挖出組培苗觀察發(fā)現(xiàn)，均長出較多新根，根尖處的白色新生根長度為0.8～1.5cm，成活率為95％。
說明書中培養(yǎng)基的英文縮寫如下6-芐基腺嘌呤(6-BA)，萘乙酸(NAA)，吲哚丁酸(IBA)激動素(KT)，水解酪蛋白(CH)。
參考文獻中國科學院中國植物志編輯委員會編.中國植物志[M].北京人民衛(wèi)生出版社，1988.28。邴飛虹，張國斌.國家五類新藥-地烏風濕安膠囊.湖北中醫(yī)雜志，2005，27(1)48-49。朱端衛(wèi)等，離體快速繁殖地烏的方法[P].中國發(fā)明專利公開說明書，
發(fā)明者耿明建, 王俊, 朱端衛(wèi), 楊特武, 周文兵, 劉保財, 張忠池 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學