專利名稱：高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵劑的制備方法，尤其是涉及高效復合微生物豆粕發(fā)酵
劑的制備方法，屬于生物酶解發(fā)酵技術領域。
背景技術：
豆粕是大豆榨油后的副產(chǎn)物，其粗蛋白含量高達40% _50%，營養(yǎng)豐富，成本低 廉，而且蛋白質和氨基酸的組成合理，廣泛用作動物的飼料。但是豆粕中含有大量的抗營 養(yǎng)因子，不但影響了蛋白質的利用效率，而且會引起幼年動物的腸道損傷，導致幼年動物斷 奶后腹瀉，顯著影響動物的健康和成活。解決的辦法是在豆粕中加入豆粕發(fā)酵劑，用以消 除或降低豆粕中的抗營養(yǎng)因子。目前采用的豆粕發(fā)酵劑主要有三種一是前一批發(fā)酵的豆 粕飼料；二是以前豆粕發(fā)酵時使用的覆蓋物中霉菌殘留物；三是高熱過度生長的真菌菌絲 體。這些發(fā)酵劑的活力不均，生長緩慢，且常遭受其他微生物污染，出現(xiàn)難以預測的發(fā)酵，甚 至導致全部發(fā)酵失敗。因此，在發(fā)酵前需對豆粕進行高溫滅菌，再用乳酸酸化基質，以防染 菌；發(fā)酵中通常還需通入空氣，成本很高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方 法。 本發(fā)明的目的是通過下述技術方案予以實現(xiàn) —種高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法，包括下述步驟 1)菌種優(yōu)化篩選 分別將嗜酸性乳桿菌、乳酸乳桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽胞桿菌、地衣 芽胞桿菌進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐高銅和耐溫馴化；
①菌株的耐酸馴化pH 3. 0-3. 5，篩選出耐酸菌株； ②耐膽酸馴化在培養(yǎng)基中加入不同濃度的膽酸鹽，對菌株進行馴化；③耐高銅選育在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養(yǎng)基中生長； 耐溫馴化將活化后的菌體培養(yǎng)物接種至LB、 TB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間
后在40-6(TC水浴中加熱一定時間，隨后繼續(xù)將培養(yǎng)物置于37t:培養(yǎng)； 2)搖瓶混合培養(yǎng) 菌株培養(yǎng)采用葡萄糖或玉米淀粉、魚粉或酵母粉、無機鹽等組成的培養(yǎng)基，在搖瓶 中進行； ①嗜酸性乳桿菌培養(yǎng)MTB培養(yǎng)基的組成為葡萄糖80-90g/L、蔗糖8-10g/L、蛋白 胨3-5g/L、酵母粉2-25g/L、檸檬酸鈉10-12g/L、 KH2P04 2 . 2-2 . 4g/L、 K2HP04 10-12g/L，在 26-37t:下進行深層液體發(fā)酵； ②乳酸乳桿菌培養(yǎng)GTB培養(yǎng)基的組成為葡萄糖60-70g/L、牛肉膏8-10g/L、酵母 粉10-15g/L、MgS04 1. 2-1. 6g/L、NaCl 2. 2-2. 5g/L、 KH2P04 2 . 2-2 . 4g/L、 K2HP04 10-12g/L，起始pH值為6-6. 5，培養(yǎng)溫度為26-35t:，接種量為3% ; ③乳酸桿菌的混合培養(yǎng)將培養(yǎng)后的嗜酸性乳桿菌和乳酸乳桿菌放入MTB培養(yǎng)基 中混合培養(yǎng)，通過調節(jié)發(fā)酵中菌種的配比，采用兩段培養(yǎng)溫度35、37t:，培養(yǎng)時間18-24小 時； ④釀酒酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為酪蛋白胨12-15g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖
25-30g/L、 KH2P04 2 . 2-2 . 4g/L、 K2HP04 3H20 15-16. 34g/L，培養(yǎng)溫度為26_30°C ; ⑤產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-25g/L、酵母粉10-12g/L、
(NH4)2HP04 2. 5-3g/L、 KH2P04 2 . 2—2 . 4g/L、 K2HP04 3H20 15—16. 34g/L ; ⑥枯草芽胞桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為豆粕10-12g/L、玉米粉18-21g/L、魚粉
7-7. 3g/L、MgS04 18-2. lg/L， pH為5. 5-6. l，溫度為26_35°C ; ⑦地衣芽胞桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為豆粕8-10g/L、玉米粉20-25g/L、魚粉 6. 5-7. 0g/L、MgS04 2. 2-2. 5g/L， pH為4. 6-5. l，溫度26-33. 5°C ;
3)10L發(fā)酵罐培養(yǎng) 將搖瓶培養(yǎng)的結果分別放入10L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)；
4)制作微生物復合保護劑 保護劑由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其濃度為脫脂乳粉80-85g/L、半胱
氨酸0. 04-0. 05mol/L、谷氨酸鈉25_30g/L ;將保護劑加入嗜酸性乳桿菌和乳酸乳桿菌中，
在真空冷凍干燥后，將其在4t:下進行貯藏； 5)低溫噴霧干燥 低溫噴霧干燥溫度為20-38°C ; 6)配制豆粕發(fā)酵劑 將嗜酸性乳桿菌3. 0-4. 0億CFU/g、乳酸乳桿菌2. 0_3. 0億CFU/g、枯草芽孢桿菌 10. 0-12. 0億CFU/g、地衣芽孢桿菌5. 0-6. 0億CFU/g、啤酒酵母3. 0-3. 5億CFU/g、產(chǎn)朊假 絲酵母2. 0-3. 0億CFU/g混合均勻即可，高效豆粕發(fā)酵劑總菌數(shù)^ 25億CFU/g ;
優(yōu)選為嗜酸性乳桿菌3. 5億CFU/g、乳酸乳桿菌2. 5億CFU/g、枯草芽孢桿菌11. 0 億CFU/g、地衣芽孢桿菌5. 5億CFU/g、啤酒酵母3. 0億CFU/g、產(chǎn)朊假絲酵母2. 5億CFU/g ;
本發(fā)明高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點
1)科學選取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌、啤酒酵母和 產(chǎn)朊假絲酵母六種微生物，利用它們的綜合作用達到豆粕發(fā)酵時抑制雜菌生長，消除豆粕 抗營養(yǎng)因子、脹氣因子，提高蛋白利用率，改善適口性，同時微生物合成有利于動物生長的 多種維生素和酶、次級代謝產(chǎn)物等，同時兼具有微生態(tài)制劑的作用，具有改善動物腸道微生 態(tài)平衡，剌激免疫系統(tǒng)反應，提高免疫力、降低膽固醇水平，減少飼料中酸化劑、抗生素的使 用等作用； 2)對每種微生物進行優(yōu)化篩選和馴化，使之具有耐酸、耐鹽、耐溫及耐膽汁的優(yōu)良 特性； 3)對所選微生物的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進行優(yōu)化控制，保證各個菌種的高密度生長，
降低了發(fā)酵成本，發(fā)酵劑的活力均勻，生長快速，不易遭受其他微生物污染； 4)在嗜酸乳桿菌和乳酸乳桿菌中加入了保護劑，并在菌體的可耐受溫度下采用噴
霧技術對菌體進行干燥，大大降低了成本，探明了培養(yǎng)條件、收獲期、冷凍速率、殘留水分及復水條件對干燥菌體存活率的影響，保證了產(chǎn)品中菌體的活性。所生長的菌粉易于包裝運 輸，是微生物制劑的發(fā)展方向。
具體實施方式

實施例1 本發(fā)明高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法，包括下述步驟
1)菌種優(yōu)化篩選 分別將嗜酸性乳桿菌、乳酸乳桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽胞桿菌、地衣 芽胞桿菌進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐高銅和耐溫馴化；
①菌株的耐酸馴化pH 3. 5，篩選出耐酸菌株； ②耐膽酸馴化在培養(yǎng)基中加入不同濃度的膽酸鹽，對菌株進行馴化；
③耐高銅選育在含250mg/kg銅的MRS肉湯培養(yǎng)基中生長； 耐溫馴化將活化后的菌體培養(yǎng)物接種至LB、 TB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間 后在40、45、50、55、6(TC水浴中加熱一定時間，隨后繼續(xù)將培養(yǎng)物置于37。C培養(yǎng)；
2)搖瓶混合培養(yǎng) 菌株培養(yǎng)采用葡萄糖或玉米淀粉、魚粉或酵母粉、無機鹽等組成的培養(yǎng)基，在搖瓶 中進行； ①嗜酸性乳桿菌培養(yǎng)MTB培養(yǎng)基的組成為葡萄糖90g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨5g/ L、酵母粉25g/L、檸檬酸鈉12g/L、KH2P04 2 . 4g/L、 K2HP04 12g/L，在37。C下進行深層液體發(fā) 酵； ②乳酸乳桿菌培養(yǎng)GTB培養(yǎng)基的組成為葡萄糖70g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉15g/ L、 MgS04 1. 6g/L、 NaCl 2. 5g/L、 KH2P042. 4g/L、 K2HP04 12g/L，起始pH值為6. 5，培養(yǎng)溫度為 35°〇，接種量為3% ; ③乳酸桿菌的混合培養(yǎng)將培養(yǎng)后的嗜酸性乳桿菌和乳酸乳桿菌放入MTB培養(yǎng)基 中混合培養(yǎng)，通過調節(jié)發(fā)酵中菌種的配比，采用兩段培養(yǎng)溫度35、37t:，培養(yǎng)時間24小時；
④釀酒酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為酪蛋白胨15g/L、酵母粉15g/L、葡萄糖30g/L、 KH2P04 2 . 4g/L、K2HP04 3H2016. 34g/L，培養(yǎng)溫度為30°C ; ⑤產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為葡萄糖25g/L、酵母粉12g/L、 (NH4)2HP043g/ L、 KH2P04 2 . 4g/L、 K2HP04 3H20 16. 34g/L ; ⑥枯草芽胞桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為豆粕12g/L、玉米粉21g/L、魚粉7.3g/L、 MgS04 2. lg/L， pH為6. l，溫度為35°C ; ⑦地衣芽胞桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為豆粕10g/L、玉米粉25g/L、魚粉7.0g/L、 MgS04 2. 5g/L， pH為5. l，溫度為33. 5°C ;
3) 10L發(fā)酵罐培養(yǎng) 將搖瓶培養(yǎng)的結果分別放入10L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)；
4)制作微生物復合保護劑 保護劑由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其濃度為脫脂乳粉85g/L、半胱氨酸 0. 05mol/L、谷氨酸鈉30g/L ;將保護劑加入嗜酸性乳桿菌和乳酸乳桿菌中，在真空冷凍干
燥后，將其在4t:下進行貯藏；
5)低溫噴霧干燥 低溫噴霧干燥溫度為26°C ; 6)配制豆粕發(fā)酵劑 將嗜酸性乳桿菌3. 5億CFU/g、乳酸乳桿菌2. 5億CFU/g、枯草芽孢桿菌11. 0億 CFU/g、地衣芽孢桿菌5. 5億CFU/g、啤酒酵母3. 0億CFU/g、產(chǎn)朊假絲酵母2. 50億CFU/g混 合均勻即可，高效豆粕發(fā)酵劑總菌數(shù)為28億CFU/g。
權利要求
一種高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于包括下述步驟1)菌種優(yōu)化篩選分別將嗜酸性乳桿菌、乳酸乳桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐高銅和耐溫馴化；①菌株的耐酸馴化pH 3.0-3.5，篩選出耐酸菌株；②耐膽酸馴化在培養(yǎng)基中加入不同濃度的膽酸鹽，對菌株進行馴化；③耐高銅選育在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養(yǎng)基中生長；④耐溫馴化將活化后的菌體培養(yǎng)物接種至LB、TB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后在40-60℃水浴中加熱一定時間，隨后繼續(xù)將培養(yǎng)物置于37℃培養(yǎng)；2)搖瓶混合培養(yǎng)菌株培養(yǎng)采用葡萄糖或玉米淀粉、魚粉或酵母粉、無機鹽等組成的培養(yǎng)基，在搖瓶中進行；①嗜酸性乳桿菌培養(yǎng)MTB培養(yǎng)基的組成為葡萄糖80-90g/L、蔗糖8-10g/L、蛋白胨3-5g/L、酵母粉2-25g/L、檸檬酸鈉10-12g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4 10-12g/L，在26-37℃下進行深層液體發(fā)酵；②乳酸乳桿菌培養(yǎng)GTB培養(yǎng)基的組成為葡萄糖60-70g/L、牛肉膏8-10g/L、酵母粉10-15g/L、MgSO4 1.2-1.6g/L、NaCl 2.2-2.5g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4 10-12g/L，起始pH值為6-6.5，培養(yǎng)溫度為26-35℃，接種量為3％；③乳酸桿菌的混合培養(yǎng)將培養(yǎng)后的嗜酸性乳桿菌和乳酸乳桿菌放入MTB培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，通過調節(jié)發(fā)酵中菌種的配比，采用兩段培養(yǎng)溫度35、37℃，培養(yǎng)時間18-24小時；④釀酒酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為酪蛋白胨12-15g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖25-30g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4·3H2O 15-16.34g/L，培養(yǎng)溫度為26-30℃；⑤產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-25g/L、酵母粉10-12g/L、(NH4)2HPO4 2.5-3g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4·3H2O 15-16.34g/L；⑥枯草芽胞桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為豆粕10-12g/L、玉米粉18-21g/L、魚粉7-7.3g/L、MgSO4 18-2.1g/L，pH為5.5-6.1，溫度為26-35℃；⑦地衣芽胞桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為豆粕8-10g/L、玉米粉20-25g/L、魚粉6.5-7.0g/L、MgSO4 2.2-2.5g/L，pH為4.6-5.1，溫度26-33.5℃；3)10L發(fā)酵罐培養(yǎng)將搖瓶培養(yǎng)的結果分別放入10L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)；4)制作微生物復合保護劑保護劑由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其濃度為脫脂乳粉80-85g/L、半胱氨酸0.04-0.05mol/L、谷氨酸鈉25-30g/L，將保護劑加入嗜酸性乳桿菌和乳酸乳桿菌中，在真空冷凍干燥后，將其在4℃下進行貯藏；5)低溫噴霧干燥低溫噴霧干燥溫度為20-38℃；6)配制豆粕發(fā)酵劑將嗜酸性乳桿菌3.0-4.0億CFU/g、乳酸乳桿菌2.0-3.0億CFU/g、枯草芽孢桿菌10.0-12.0億CFU/g、地衣芽孢桿菌5.0-6.0億CFU/g、啤酒酵母3.0-3.5億CFU/g、產(chǎn)朊假絲酵母2.0-3.0億CFU/g混合均勻即可；高效豆粕發(fā)酵劑總菌數(shù)≥25億CFU/g。
2. —種如權利要求1所述的高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于 所述嗜酸性乳桿菌為3. 5億CFU/g、乳酸乳桿菌為2. 5億CFU/g、枯草芽孢桿菌為11. 0億CFU/g、地衣芽孢桿菌為5. 5億CFU/g、啤酒酵母為3. 0億CFU/g、產(chǎn)朊假絲酵母為2. 5億CFU/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效復合微生物豆粕發(fā)酵劑的制備方法，屬于生物酶解發(fā)酵技術領域，其制備方法包括分別將嗜酸性乳桿菌、乳酸乳桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌進行優(yōu)化篩選、搖瓶混合培養(yǎng)、10L發(fā)酵罐培養(yǎng)、制作微生物復合保護劑、低溫噴霧干燥、配制豆粕發(fā)酵劑等步驟，本發(fā)明能有效地抑制雜菌生長，消除或顯著降低了豆粕中的抗營養(yǎng)因子、脹氣因子，提高了蛋白利用率，增強了免疫力，具有耐酸、耐鹽、耐溫及耐膽汁的優(yōu)良特性，其制備方法簡單，成本低廉，生產(chǎn)的產(chǎn)品質量穩(wěn)定可靠，適用范圍廣。
文檔編號A23K1/14GK101715876SQ20091005891
公開日2010年6月2日 申請日期2009年4月13日 優(yōu)先權日2009年4月13日
發(fā)明者馮建國 申請人:四川渴望生物科技有限公司